高通量测序法检测胃癌患者融合基因LRP5_LITAF_徐晓凤

2 结果
2． 1 胃癌患者 ＲNA 测序数据结果 在胃癌组织和 癌旁组织中共检测到 2 229 个显著差异的基因及约 15 000 个 FPKM ＞ 1 基因的表达，其中在癌组织中 1 590个基因上调，709 个基因下调。随机取 1 例胃 癌患者癌组织和癌旁组织，用 ＲNA 测序技术对其全 部基因 转 录 进 行 测 序，结 果 分 别 得 到 5． 36 Gb 和 6． 12 Gb 序列，且约 80% 测定的序列可以定位到参 考基因组，平均覆盖度分别达到 38． 63 X（ X 为覆盖 倍数） 和 43． 22 X，见表 1。
基因突变、基因异常表达和表观遗传变异被认 为 是 胃 癌 的 致 病 因 素。 大 规 模 进 行 ＲNA 测 序 （ ＲNA-sequencing，ＲNA-Seq） 可 以 识 别 单 个 样 本 中 整个基因表达和结构变化，且有助于描述细胞转录 组的全部特征，所以 ＲNA 测序技术是研究不同转录 本表达变异状况的革新工具［1］。本研究针对早期胃 癌患者癌组织和癌旁组织进行了 ＲNA 测序，并对数 据进行了生物信息学分析，鉴定出各种基因转录变异 （ mＲNA 表达水平和结构变化） ，以期了解胃癌的发病 机制。并通过测序分析及蛋白质电泳技术鉴定新融 合基因 LＲP5-LITAF 的表达。
1 材料与方法
1． 1 研究对象 收集 2013 年 6 ～ 12 月靖江市人民 医院普通外科就诊的早期胃癌患者 8 例，男 5 例，女 3 例，年龄 36 ～ 78 岁，术前均未进行放化疗及药物 治疗，且根据 全 国 胃 癌 协 作 组 制 定 的《胃 黏 膜 活 检 病理诊断 标 准 》经 过 病 理 组 织 学 确 诊。 其 中，贲 门
关键词： 胃癌； 转录组； 融合基因； LＲP5-LITAF； 高通量测序
中图分类号： Ｒ735． 2
文献标志码： A
Determination of LＲP5-LITAF fusion gene in gastric cancer by transcriptome analysis XU Xiao-fenga ，WANG Jian-jiangb ，YE Jin-songa ，XU Li-fangc ，ZHU Yun-linga ，TAO Lana ，XUE Ying-chunb （ a． Clinical Laboratory， b． Department of General Surgery，c． Department of Gastroenterology，Jingjiang People's Hospital，Jingjiang 214500，Jiangsu，China） Abstract： Objective To investigate the change of fusion gene levels in the development of gastric cancer，explore the possible pathogenesy of gastric cancer． Methods ＲNAs in tumor tissues and matched normal tissues in the patients with gastric cancer were performed sequencing using Illumina high-throughput sequencer，and the levels and structural variations of differentially expressed genes were analyzed． Ｒesults One thousand five hundred and ninety up-regulated and 709 down-regulated genes were detected in gastric tumor tissues． These differentially expressed genes were enriched in gene ontology（ GO） related to cell cycle and tumor invasion and proliferation． Moreover，LＲP5-LITAF fusion gene was found in 40% （ 2 /5） of gastric tumor tissues． Conclusion Many differentially expressed genes and LＲP5-LITAF fusion gene were identified in gastric tumor tissues，which provided the foundation for the diagnosis and therapy of gastric cancer． Key words： gastric cancer； transcriptome； fusion gene； LＲP5-LITAF； high-throughput sequencing
癌 6 例，胃体癌 2 例。于手术时冷冻采集新鲜胃癌 组织和癌旁组织（ 距离癌组织 ＞ 5 cm） 样本，于 ＲNA 保存管中 － 80 ℃ 保存。 1． 2 ＲNA 测序 取癌组织和癌旁组织，按照 Trizol 试剂（ Invotrogen 公司） 说明书进行总 ＲNA 的提取， 并用 Agilent 生物分析仪（ 美国安捷伦公司） 对其质 量进 行 评 估。按 照 Illumina 标 准 实 验 流 程，通 过 TruSeq ＲNA 样本制备包 （ Illumina 公 司，型 号： F 115 bp 短序列长度进行双末端测序。 由 Illumina 公司完成。 1． 3 测序数据过滤和比对 数据过滤过程中删除 带有接头污染和低质量值碱基的短序列。用 Bowtie2． 0． 0 软件和 Tophat1． 3． 1 软件以基因组 hg19 和 转录本参考序列（ 下载自 UCSC 数据库： http： / / hgdownload． cse． ucsc． edu / goldenPath / hg19 / ） 比对过滤 后的序列。如果序列比对到核糖体 ＲNA 或者线粒 体 ＲNA，则不纳入后续的分析。通过可视化软件基
发现 1 590 个基因上调和 709 个基因下调； 功能富集分析表明，这些差异表达基因富集于细胞周期、肿瘤侵入与扩散有关的基
因实体（ gene ontology，GO） 注释中； 且在约 40% （ 2 /5） 的胃癌患者的癌组织中发现融合基因 LＲP5-LITAF 。结论 发现了胃癌
发病过程中的大量差异表达基因及融合基因 LＲP5-LITAF，为胃癌的辅助诊断及靶向治疗提供了初步实验依据。
徐晓凤a，王建江b，叶金松a，徐丽芳c，朱蕴玲a，陶岚a，薛迎春b （ 靖江市人民医院 a． 检验科，b． 普外科，c． 消化 科，江苏靖江 214500）
摘要： 目的 了解胃癌发病过程中融合基因表达水平的变化，探讨其在胃癌的发病机制中的作用。方法 用 Illumina 高通量
测序仪对早期胃癌患者组织及匹配的癌旁组织进行 ＲNA 测序，以检测差异基因表达水平及结构变化。结果 在胃癌组织中
· 月第 32 卷第 11 期 Chin J Clin Lab Sci，Nov． 2014，Vol． 32，No． 11
DOI： 10． 13602 / j． cnki． jcls． 2014． 11． 08
·临床实验诊断研究·
高通量测序法检测胃癌患者融合基因 LＲP5-LITAF
定的序列不应定位到核糖体蛋白或小分子核糖核蛋 白（ snＲNP） 。用 Circos 软件（ http： / / circos． ca / ） 显示 初步鉴定出的融合基因所在的染色体位置。 1． 7 基因融合验证 根据 GenBank 中的融合基因 LＲP5-LITAF 序列号（ AB017498． 1 和 NM_001136473． 1） ， 用 Primer Premier 5． 0 软件设计，由上海生工公司合 成。正 向 引 物 序 列： 5'-TGGATGGCAGCACCCGGA3'； 反向引物序列： 5'-CTTCCCATCAGGCCCCGT-3'。 PCＲ 产物片段大小为 313 bp。PCＲ 反应总体系为 100 μL，包括 10 × PCＲ buffer（ 含 1． 5 mmol / L Mg2 + ） 10 μL，模 板 DNA 2 μg，5 U / μL Taq DNA 聚 合 酶 （ TaKaＲa Bio 公司） 2． 5 μL，200 μmol / L dNTPs 7． 5 μL，100 pmol / L 上、下游引物各 5． 5 μL，ddH2 O 补 足至 100 μL。PCＲ 循环参数： 94 ℃ 1 min； 94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，共 40 个循环。经 10 g / L 的琼脂糖凝胶电泳（ DYY-6C，北京六一仪器厂） 观 察并拍照。
样本 癌旁组织 胃癌组织
作者简介： 徐晓凤，1964 年生，女，主任技师，大学本科，主要从事分子生物学研究。
临床检验杂志 2014 年 11 月第 32 卷第 11 期 Chin J Clin Lab Sci，Nov． 2014，Vol． 32，No． 11
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因组浏览器（ IGV2． 0． 26，http： / / www． broadinstitute． org / igv / ） 确认测定序列比对的结果。 1． 4 差异表达基因检测 为了鉴定胃癌相关的差 异表达基因（ differentially expressed genes，DEG） ，本 研究用 Cufflinks（ 1． 0． 3） 软件计算每一百万个比对 上的序列片段中比对到外显子的每一千个碱基上的 短序列个数（ fragments per kilobase of exon per million fragments mapped，FPKM） 来进行基因表达定量。 肿瘤组织与癌旁组织之间的 DEG 用显著性标准P ＜ 0． 05 进行鉴定。同时，针对筛选出来的 DEG，通过 网络 工 具 DAVID （ http： / / david． abcc． ncifcrf． gov / ） 进行基因实体（ gene ontology，GO） 注释和 KEGG 通 路富集分析，富集的显著性标准为错误发现率（ false discovery rate，FDＲ） ＜ 0． 05。 1． 5 可变剪接事件检测 用 MISO 软件检测测序 样本的可变剪接事件。可变剪接的类型包括： 可变 3'剪接位点（ alternative 3' splice sites，A3SS） ，可变 5' 剪接位点（ alternative 5' splice sites，A5SS） ，互相排 斥的外显子（ mutually exclusive exons，MXE） ，内含子 保 留 （ retained intron，ＲI ） 和 外 显 子 跳 跃 剪 接 （ skipped exons，SE） 。按照如下条件进一步确定差 异表达的亚型： （ 1） 基因表达差值 ＞ 0． 2； （ 2） 贝叶斯 因子 ＞ 10； （ 3） 内含测定序列 ＞ 1，互斥测定序列 ＞ 1，内含测定序列和互斥测定序列总数超过 10。 1． 6 融合基因识别 通过 defuse 软件和 TopHat 软 件融合识别融合基因。defuse 软件过滤过程遵循文 献［2］中所述的方法。TopHat 软件鉴定融合基因的 过滤标准如下： （ 1） 载体衔接测定序列数 ＞ 3； （ 2） 测