第四章 蛋白质的稳定性和稳定化
药剂学：生物技术药物制剂
美国政府技术顾问委员会(OAT) 的定义是：应 用生物或来自生物体的物质制造或改进一种商品的 技术，其中还包括改良有重要经济价值的植物与动 物和利用微生物改良环境的技术。该定义强调了生 物技术的商品属性。
传统生物技术发展阶段
➢古代，人们就会利用微生物发酵法来制醋、做酱、醇酒等，但古代人并不知 道微生物的存在，更不懂得什么是发酵，他们对微生物利用完全靠着多年来 摸索出来的经验。
第19章
生物技术药物制剂
生物技术将是未来经济发展的新动力 第一次技术革命 工业革命 解放人的双手 第二次技术革命 信息技术 扩展人的大脑 第三次技术革命 生物技术 改造生命本身
生物技术的定义
1982年，国际合作与发展组织的定义为：生物 技术是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、 动物、植物体作为反应器将生物材料进行加工以提 供产品为社会服务的技术。
英国医学专家日前将转基因大肠杆菌 与一种抗癌药相结合，成功杀死了实验鼠 体内的癌细胞。科学家将转基因大肠杆菌 注射到实验鼠的肿瘤内，再给实验鼠注射 一种名叫6－MPDR的抗癌药。这种药无 法单独发挥作用，但是一种由转基因大肠 杆菌分泌的酶能将此药物“激活”，形成 一种有效的毒素，将其周围的癌细胞杀死， 而不伤害其它组织器官。
畜牧业中的应用
➢ 动物疫苗、生长激素等
➢ 例：从转基因羊的羊奶 中提取出治疗心脏病的 药物tPA
蛋白质的稳定性和稳定化
A
B
C
A.用多功能试剂交联；B.共价或非共价连于载体上 C.包埋到载体的紧密孔中
二、非共价修饰
反相胶束 添加剂
蛋白质间非共价相连，形成的多聚体或者
聚合体的活力和稳定性常比单体高
反胶束是由两性化合物在占优势的有机相中形 成的。它不仅可以保护酶，还能提高酶活力， 改变酶的专一性。
反相胶束示意图
固定化可通过下列效应影响酶的稳定性：
空间障碍：由于空间障碍可以防止蛋白水解
酶的作用，阻挡酶与化学失活剂的接触，同时
阻碍氧向酶的扩散可以保护对氧不稳定的酶
扩散机制: 使酶发生交联或包埋在载体紧
密的孔中可以使酶的构象更加坚牢，从而阻止
酶构象从折叠态向伸展态过渡。
一 酶固定到载体上后可产生空间障碍，结果其他大
质信息进行基因和蛋白质序列的改造， 通过定
点突变使得所表达的蛋白质产生相应的特征改
变。
组合设计（combinational design）
和数据驱动设计（data-driven design）
是另外两种最新的可以提高蛋白质稳定
性的蛋白质工程技术。
组合设计:
是通过一种策略使得在基因水平上产生 差异化，同时，通常需要大量的高通量筛选 来鉴别设计是否获得成功。组合设计方法的 目标在于通过在蛋白质随机位点引入随机突
进化目的的一种技术。
随着突变方法、突变体高通量筛选技术、基因结
构与功能研究的突破，特别是PCR 技术的进一步
成熟，DNA 改组技术(DNA shuffling)更加成熟，
使得DNA 改组成为蛋白质体外分子进化的主流技
术。
DNA 改组技术具有许多重要优点， 例如不需要
事先了解结构信息，也不需要了解蛋白质的功能
第四章电化学基础知识点归纳
第四章电化学基础知识点归纳第四章电化学基础知识点归纳电化学是研究电和化学之间关系的分支学科，主要研究电能和化学变化之间的相互转化规律。
本章主要介绍了电化学基础知识点，包括电化学的基本概念、电池反应、电解反应以及其相关的电解池和电极。
一、电化学的基本概念1. 电化学：研究电和化学之间相互关系的学科。
2. 电解：用电能使电解质溶液或熔融物发生化学变化的过程。
3. 电解质：能在溶液中产生离子的化合物。
4. 电解池：由电解质、电极和电解物质组成的装置。
5. 电极：用来与溶液接触，传递电荷的导体。
二、电池反应1. 电池：将化学能转化为电能的装置。
由正极、负极、电解质和导电体组成。
2. 电池反应：电池工作时在正负极上发生的化学反应。
3. 氧化还原反应：电池反应中常见的反应类型，在正极发生氧化反应，负极发生还原反应。
4. 电池电势：电池正极和负极之间的电位差。
5. 电动势：电池正极和负极之间的最大电势差。
三、电解反应1. 电解：用电流使电解质发生化学变化的过程。
2. 导电质：在电解质中起导电作用的物质。
3. 离子：在溶液中能自由移动的带电粒子。
4. 阳离子：带正电荷的离子。
5. 阴离子：带负电荷的离子。
6. 电解池：由电解质溶液、电解质和电极组成的装置。
7. 电解程度：电解质中离子的溶解程度。
8. 法拉第定律：描述了电解过程中，电流量与电化学当量的关系。
四、电解池和电极1. 电解槽：承载电解液和电极的容器。
2. 阳极：电解池中的电流从电解液流入的电极，发生氧化反应。
3. 阴极：电解池中的电流从电解液流出的电极，发生还原反应。
4. 阳极反应：电解池中阳极上发生的氧化反应。
5. 阴极反应：电解池中阴极上发生的还原反应。
6. 电极反应速度：电极上反应的速度。
7. 电极反应中间体：反应过程中形成的中间物质。
电化学是现代科学和工程领域中的重要分支，广泛应用于电池、电解、蓄电池、电解涂层、电化学合成等领域。
了解电化学的基础知识，有助于我们更好地理解和应用电化学原理。
第四章 酶蛋白的稳定性和稳定化
酶所具有的特有活性构象是分子中各种相互作用的结果。
变性：蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间 构象被改变，蛋白质分子从原来有序的卷曲的紧密结构变 为无序的松散的伸展状结构从而导致其理化性质的改变和 生物活性的丧失，称为~。分为可逆变性与不可逆变性。 失活： 蛋白质的生物活性丧失。 变性与失活的关系： 变性蛋白质一定失活，但失活并不一定全是变性的结果 如蛋白质肽链水解断裂、辅基除去及抑制剂的存在等，均
活力。
一旦远离等电点，蛋白质分子内相同电荷间的静电斥力会导 致其伸展。而且在蛋白质伸展后，埋藏在内部的非电离残基 也发生电离。 His残基主要负责酸性pH下的蛋白质伸展。 对蛋白酶来说，常会导致自溶。 极端 pH 能启动改变、交联或破坏氨基酸残基的化学反应，结 果引起不可逆失活。
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性。使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂；
其次，这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合， 以最大限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露； 最后，如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基， 则会发生分子间二硫交换反应。 注意: 聚合和简单的沉淀作用是有区别的。
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三、极端pH
pH改变可引起催化必需基团的电离，导致失活。 pH的较小变化对酶结构没有严重影响，重新调节pH，可恢复
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一、蛋白水解酶和自溶作用
酶在使用和贮存过程中的失活常是由于微生物
和外源蛋白水解酶作用的结果。 蛋白水解酶可催化肽链水解。 蛋白酶溶液中，蛋白酶分子可以相互催化，造 成蛋白酶降解，酶活降低叫做自溶。
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二、聚合作用
聚合很久以来就被认为是蛋白质失活的一种机理。 首先，必须发生单分子构象变化，导致蛋白质可逆变
蛋白质的稳定性
第一节 蛋白质的稳定性
一、蛋白质的稳定性指的是蛋白质抵抗各种因素的影 响，保持其生物活力的能力。
二、蛋白质稳定性的分子原因
1、金属离子、底物、辅因子和其它低分子量配体的结 合作用。
金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是弯曲处）， 因而可以显著增加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子和其 它低分子量配体相互作用时，也会看到蛋白质稳定性的增加。
7、疏水相互作用
带有非极性侧链的氨基酸大约占蛋白质分子总体积 的一半。它们与水的接触从热力学上来说是不利的 ，因为非极性部分加入水中，会使水的结构更有序 地排列。 水分子的这种结构重排，显然能引起系统的熵降低 和蛋白质折叠状态的改变：蛋白质的非极性部分总 是倾向于使其不与水接触，并尽可能地隐藏在蛋白 球体内部。从而蛋白质稳定性增加。
2、蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用
在体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用，形成复合物， 从而显著增加蛋白质稳定性。
当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳 定到疏水簇上，因而防止疏水簇与溶剂的接触， 屏蔽了蛋白质表面的疏水区域，从而显著增加蛋 白质稳定性
3、盐桥和氢键
蛋白质中盐桥的数目较少，但对蛋白质稳定性贡 献很显著。嗜热脱氢酶亚基间区域有盐桥协作系 统，这是嗜温脱氢酶没有的。因此嗜热酶的催化 活力的变性温度和最适温度都比嗜温酶高出约 20℃。
十、 冷冻和脱水 酶溶液通常可在低温下贮存时间较长时间，也
3、超声波 超声波压力使溶解的气体产生小气泡，小气泡迅速
膨胀至一定程度时突然破碎，这就是空化作用，它既 产生机械力，又产生化学变性剂（如在小气泡中热反 应所产生的自由基），结果使蛋白质失活。
4、压力 0.1-6×108pa 的 压 力 下 可 使 酶 失 活 。 压 力 诱 导 的 失
蛋白质与酶工程教学大纲
《蛋白质与酶工程》教学大纲课程名称：蛋白质与酶工程学分：2学时：32先修课程：生物化学适用专业：生物工程开课系部：生命科学学院一、课程性质、目的和培养目标课程性质：专业选修课课程目的：本课程是生物工程本科专业选修课，目的是让学生在学习了普通生化的基础上，进一步对蛋白质和酶工程进行深入系统的学习。
并对于酶在生产实践中的应用，也能有一些感性和理性的认识。
课程培养目标：采用多媒体课件和国内外最新的教学参考书、教案，灵活运用多种教学方法，因材施教，使学生在牢固掌握基础知识和基本概念的同时，得到科学研究、科学思维和科学方法的良好训练，为其他专业基础课和专业课的学习及日后的研究工作打下基础。
二、课程内容和建议学时分配第一章绪论2课时（一）教学基本要求掌握蛋白质工程和酶工程的定义，了解其发展史，以及应用前景。
（二）教学内容第一节蛋白质工程概论第二节蛋白质工程的应用第三节蛋白质工程展望第四节酶工程简介一酶工程二组成：酶的产生；酶的分离纯化；酶的固定化；生物反应器。
三分类：化学酶工程；生物酶工程。
第五节酶与酶工程的发展简史一酶学研究简史二酶工程研究简史（三）教学重点和难点重点：蛋白质与酶工程定义; 难点：酶工程的组成分类第二章蛋白质的结构与功能 2课时（一）教学基本要求掌握蛋白质的基本结构组成及功能（二）教学内容第一节蛋白质的基本结构与功能一蛋白质的组成二蛋白质的一级结构三蛋白质一级结构与功能的关系第二节蛋白质的空间结构与功能一蛋白质的二级结构二超二级结构和结构域三蛋白质的三级结构四蛋白质空间结构与功能的关系五蛋白质-蛋白质相互作用（三）教学重点和难点重点：蛋白质的空间结构；难点：蛋白质间的相互作用；第三章蛋白质的修饰和表达 4课时（一）教学基本要求掌握蛋白质的化学修饰途经，了解蛋白质改造的一些途经等。
（二）教学内容第一节蛋白质修饰的化学途径一功能基团的特异性修饰1 多位点取代2 单一的或限制性取代3 次级取代二基于蛋白质片段的嵌合修饰第二节蛋白质改造的分子生物学途径一编码基因的专一性位点和区域性定向突变1 编码基因的专一性位点突变2 区域性定向突变二基因融合和基因剪接三 tRNA介导定点搀入非天然氨基酸第三节重组蛋白质的表达一目标蛋白质在大肠杆菌中的表达1 表达载体的一般特点2 与外源基因有效表达的相关因素3 改善表达水平及溶解性的方法二目标蛋白质在酵母细胞中的表达三重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达1161 选择哺乳动物细胞表达体系的优点2 两个主要的哺乳动物细胞表达系统四噬菌体显示（三）教学重点和难点重点：蛋白质的修饰和表达；难点：蛋白质间的修饰；第四章蛋白质的分离纯化及酶的分离工程8课时（一）教学基本要求了解蛋白质和酶分离的一般过程、生物材料的处理方法，掌握酶的分析方法和分离纯化的方法、技术。
食品化学复习资料
食品化学复习题判断题：以下为正确命题水分子的O-H共价键具有部分（40％）离子特性。
水形成三维氢键的能力可解释水高相转变热、高表面张力等性质。
水合氢离子带正电，比非离子化水更大氢键给与能力，羟基，更大接受能力冰转变成水伴随着最邻近水分子间距离的增加（降低密度）和最邻近水分子平均数目的增加（增加密度）。
亲水溶质会改变邻近水的结构和流动性，水会改变亲水溶质的反应性，有时甚至改变结构。
在稀水溶液中，一些离子具有净结构破坏效应（Net structure-breaking effect)，此时溶液具有比纯水较好的流动性。
净结构形成离子例子：Li+、Na +、H3+O、Ca2+、Ba2+、Mg2+、Al3+、F-和OH-等。
它们强加于水的结构超过了正常水结构的损失，它们强烈地与4或6个第一层水分子作用。
大离子和/或单价离子是净结构破坏体，主要是负离子和大的正离子，例如：K + 、Rb + 、NH4 + 、Cs + 、Br-、I-、NO3 + 、BrO3-、IO3-和ClO4-等水与非极性物质的混合是对热力学不利的过程(△G＞0）。
△G＞0不是由于△H＞0，而是由于T△S＜0。
因为在不相容的非极性实体邻近水处形成了特殊结构，使熵下降，这一过程称为疏水水合（Hydrophobic hydration）。
笼状水合物是结晶，易于生长至可见大小，一些笼状水合物在压力够高下，0℃以上仍然稳定。
疏水相互作用是蛋白质折叠的主要推动力，使疏水残基处在蛋白质分子内部。
一个试样含有相当于区Ⅰ和区Ⅱ交界的水分含量被认为含有BET单层水分含量，BET相当于一个干制品仍然呈现最高的稳定性所能含有的最大水分含量。
BET并不是一个单层，如淀粉的BET约相当于每个脱水葡萄糖基一个水分子。
目前aw测定的精确性约为±0.02。
不同物质的MSI具有显著不同的形状，S形是大多数食品的特征。
水果、糖果和咖啡提取物含有大量糖和其它可溶性小分子，而聚合物含量不高，它们的MSI呈J性。
甘油对蛋白的稳定作用
甘油对蛋白的稳定作用一、引言蛋白质是生物体中重要的基础组成部分，其结构和功能对生物体的正常运作具有重要影响。
然而，蛋白质在一定的环境条件下很容易发生失活或变性，从而失去其正常的结构和功能。
因此，研究蛋白质的稳定性及其保护方法是非常重要的。
甘油作为一种常用的保护剂，被广泛应用于蛋白质的稳定化研究中。
本文将探讨甘油对蛋白质的稳定作用及其机制。
二、甘油的物理性质及应用甘油，化学名称为丙三醇，是一种无色、无味、粘稠的液体。
其具有良好的溶解性和湿润性，能够与水形成氢键和范德华力，具有较强的保湿性能。
甘油广泛应用于医药、食品、化妆品等领域，具有保湿、润滑、稳定等作用。
三、甘油对蛋白质的稳定作用1. 保湿作用甘油具有较强的保湿性能，可以吸附周围环境中的水分，形成保湿层，防止蛋白质失去水分而发生变性。
同时，甘油还能够与蛋白质表面形成氢键和范德华力，增加蛋白质的稳定性。
2. 防止蛋白质的凝聚和聚集甘油能够减少蛋白质分子间的相互作用力，阻止蛋白质的凝聚和聚集，从而保持蛋白质的原始结构和功能。
研究表明，加入适量的甘油可以显著降低蛋白质的聚集速率和凝聚程度。
3. 调节蛋白质的溶解度甘油可以增加蛋白质在溶液中的溶解度，使蛋白质更容易与水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止蛋白质在溶液中的沉淀和析出。
四、甘油对蛋白质的稳定机制1. 氢键和范德华力的作用甘油能够与蛋白质分子表面的氨基酸残基形成氢键和范德华力，增加蛋白质的稳定性。
氢键和范德华力是蛋白质分子内部和外部稳定性的重要因素，能够维持蛋白质的原始结构和功能。
2. 保水性能甘油具有良好的保湿性能，可以吸附周围环境中的水分，形成保湿层，防止蛋白质失去水分而发生变性。
保水性能是甘油对蛋白质稳定作用的重要机制之一。
3. 减少蛋白质的凝聚和聚集甘油能够减少蛋白质分子间的相互作用力，阻止蛋白质的凝聚和聚集。
蛋白质的凝聚和聚集是蛋白质失活和变性的重要原因之一，通过减少蛋白质分子之间的相互作用力，甘油能够提高蛋白质的稳定性。
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位、31位和141位），推测可能是有一个或几个半胱氨 酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位的半胱 氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠 杆菌中生产的β-干扰素的抗病性活性提高到108 U/mg， 并且比天然β-干扰素的贮存稳定性高很多。
– 盐桥和氢键 – 二硫键 – 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 – 氨基酸残基的坚实装配
– 疏水相互作用
科学家发现能预测蛋白质稳定性 的小分子
近日，德克萨斯州立大学医学院(UTMB)的 研究人员发现了一种新的方法，可预测一 种特殊小分子在处于极端环境的各种器官 中所具备的能力。 研究结果发表在10月7日网络版的《美国国 家科学院院刊》（PNAS）中，该方法是通 过一种叫"渗透剂"的有机小分子对细胞内 蛋白质稳定性影响情况来进行研究的。结 果将有助于老年痴呆症、囊肿性纤维化、 肾脏疾病和稳定蛋白药物等的研究。
渗透剂的作用第一次是在1982年被发现，其主 要作用是保护在逆境中的生物。它们能保护人 肾脏中的细胞，如分解掉大量含破坏蛋白质的 化学尿素；它们能使一种冻结的北极青蛙在无 损伤的情况下解冻；并且它们还能使奇异微小 生物"水熊"生活在极度干燥、强烈辐射和绝对 零度以上几度到过热蒸汽的温度范围内。 Matthew Auton和D. Wayne Bolen在文章中描述 了热力学计算的应用，并成功预测了多种渗透 剂在逆境状态下保护蛋白质的能力。极热、极 冷或细胞周围化学环境的改变均能影响蛋白质 正常功能的行使，而渗透剂则可以让蛋白质具 有正确的结构形式，并正常行使功能。
第四章 酶蛋白质的稳定性和稳定化
在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以 应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于 工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性， 但在业生产中没有活性或活性很低。这是 因为工业生产中每一步的反应体系中常常会 有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高， 在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。 提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常 重要的课题。一般来说，提高蛋白质的稳定 性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定 性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要 氨基酸氧化引起的活性丧失等。
酶的失活和再活化
第四节 各种酶稳定化方法的比较
一、酶稳定化的标准
– 稳定性至少增加1-3个数量级 – 应对各种酶失活因素（物理、化学及生物
学因素）都有保护作用
– 稳定化不应减少酶活力或改变酶的专一性 – 稳定化方法应适合各类蛋白质
– 稳定化方法应在体内、体外都适用
– 从经济角度看，方法应具有放大的潜力
1.你知道人类蛋白质组计划吗？它与蛋 白质工程有什么关系？我国科学家承担
了什么任务？
2.对天然蛋白质进行改造，你认为应该
直接对蛋白质分子进行操作，还是通过
对基因的操作来实现？
据分析，Pro替代Gly138后，可能由于引入了 一个吡咯环，该侧链刚好能够填充于Gly138 附近的空洞，使蛋白质空间结构更具刚性， 从而提高了酶的热稳定性。
第一节 蛋白质的稳定性
蛋白质稳定性的分子原因
– 金属离子、底物、辅因子和其他低相 对分子质量配体的结合作用
– 蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用
第二节 蛋白质不可逆失活的原因和机理
蛋白水解酶和自溶作用 聚合作用 极端pH 氧化作用 表面活性剂和去污剂 变性剂 重金属离子和巯基试剂 热 机械力 冷冻和脱水 辐射作用
第三节 蛋白质的稳定化
固定化 酶修饰 蛋白质工程
– 工程二硫键
– 增加蛋白质内部疏水性 – 酶表面亲水化 – 抗氧化失活 – Asn脱胺失活
提高酶蛋白质的稳定性
葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用广泛，为 提高其热稳定性，朱国萍等人在确定第138位 甘氨酸(Gly138)为目标氨基酸后，用双引物法 对GI基因进行体外定点诱变，以脯氨酸 （Pro138）替代Gly138，含突变体的重组质粒 在大肠杆菌中表达，结果突变型GI比野生型 的热半衰期长一倍；最适反应温度提高10～ 12℃；酶比活相同。
评定稳定化方法的标准
稳定性至少增加1~3个数量级
应对各种酶失活因素都有保护作用
稳定化不应减少酶活力或改变酶的专一
性
稳定化方法应适合各类蛋白质 稳定化方法应在体内、体外都适用 从经济角度看，方法应具有放大的潜力
二、各方法的比较
随机共价修饰法，如将PEG连到 酶上，显然不能令人满意 蛋白质工程和选择抗体保护法更 符合这些标准，具有普遍性 从难易程度和费用看，后者显然 优于前者 增加酶稳定性的新方法、新观念 仍有待开发，其研究进展必将加 速酶在生物工程各个领域的应用
蛋白质是折叠的，生物医学研究的主要目的 就是了解它们折叠或在不稳定时展开的原因。 需要研究渗透剂是如何影响不同蛋白质的稳 定性的，以及它们之间的互作情况，这将为 研究蛋白质折叠过程提供重要的信息。 蛋白质的折叠与伸展是病变的一个明显特征， 如老年痴呆症、疯牛病和囊肿性纤维化。渗 透剂在人体多种器官行使功能，尤其是在肾 脏和大脑中。没有渗透剂，肾脏将无法行使 功能，大脑组织也不能反应。 医学研究主要针对它们在肾脏中的作用，而 它们也出现在其它很多组织中，该项技术将 有助于医学研究人员研究渗透剂在整个体内 的作用。
下面举一个如何通过蛋白质工程来提高重组β-干 扰素专一活性和稳定性的例子。
– 干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素
的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病 毒活性为106 U/mg，只相当于天然产品的十分之一， 虽然在大肠杆菌中合成的β-干扰素量很多，但多数是 以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改 变这种状况？