蛋白质的裂解
提取蛋白质的具体步骤
提取蛋白质的具体步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：提取蛋白质是生物科学研究中非常重要的一个步骤，它能够帮助研究人员深入了解蛋白质的结构和功能。
下面将为您介绍一些常用的提取蛋白质的具体步骤，希望能对您有所帮助。
1. 选择样本：在进行蛋白质提取前，首先需要选择合适的样本。
样本可以是动植物组织、微生物、细胞等。
在选择样本时，需要考虑到所需提取的蛋白质种类和含量。
2. 细胞破碎：将样本破碎是提取蛋白质的第一步。
通过机械或化学方法破碎细胞壁，释放出蛋白质。
常用的方法包括超声波破碎、研钵研磨、高压破碎等。
3. 细胞裂解：将破碎后的细胞溶液进行裂解是提取蛋白质的下一步。
裂解可使蛋白质从细胞内释放出来。
常用的裂解方法包括离心、温度变化、酸碱处理等。
4. 蛋白质沉淀：裂解后的细胞溶液含有大量的蛋白质和其他杂质，需要进行沉淀分离。
常用的方法包括盐析、醇沉、酸沉淀等。
5. 蛋白质纯化：通过进一步的分离和纯化步骤，可以得到纯度较高的蛋白质。
常用的方法包括柱层析、凝胶电泳、亲和纯化等。
6. 蛋白质鉴定：最后一步是对提取得到的蛋白质进行鉴定和分析。
常用的鉴定方法包括质谱分析、Western blotting等。
以上就是提取蛋白质的具体步骤。
通过这些步骤，研究人员可以有效地提取并纯化蛋白质，为后续的实验和研究提供重要的支持。
希望以上内容对您有所帮助，谢谢！第二篇示例：蛋白质是生物体中重要的基本分子，具有多种生物学功能，包括结构支持、酶催化、信号传导等。
提取蛋白质是生物学研究中常用的实验方法之一。
下面我将介绍提取蛋白质的具体步骤。
1. 样品的制备首先要准备待提取的生物样品，可以是细胞、组织或者生物体。
样品的制备包括收集、洗涤、离心等步骤，确保样品的纯度和完整性。
2. 细胞破碎对于细胞样品，需要先将细胞破碎以释放蛋白质。
常用的细胞破碎方法包括超声波破碎、高压破碎、冻融破碎等，选择适合样品的方法进行破碎。
3. 蛋白质溶解破碎后的细胞溶液需要进行蛋白质溶解，这可以通过添加盐溶液、表面活性剂或有机溶剂等方法来实现。
细胞提取蛋白步骤
细胞提取蛋白步骤细胞提取蛋白是生物学研究中常用的实验方法之一，通过提取细胞内的蛋白质，可以进一步进行蛋白质分析、鉴定和功能研究。
下面将详细介绍细胞提取蛋白的步骤。
一、细胞培养和采集在进行细胞提取蛋白实验之前，首先需要进行细胞培养。
常用的细胞培养基有DMEM、RPMI-1640等，根据实验需要选择合适的培养基。
将细胞培养在含有适宜浓度的培养基中，放置在恒温培养箱中，保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
当细胞生长到适当密度时，可以进行下一步的细胞采集。
二、细胞裂解将培养好的细胞放入离心管中，用PBS或生理盐水进行洗涤，去除细胞外的干扰物。
然后加入裂解缓冲液，常用的裂解缓冲液有RIPA 缓冲液、NP-40缓冲液等。
裂解缓冲液中含有蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂等，可以保护蛋白质不被降解。
将细胞裂解液置于冰上，用超声波仪或搅拌器进行充分裂解，直至细胞完全破碎。
三、离心分离将裂解后的细胞溶液离心，以去除细胞碎片、细胞核和细胞膜等残渣。
离心分离的条件根据实验需要进行调整，一般在12000×g的条件下离心10-15分钟。
离心后，上清液即为含有目标蛋白质的提取液。
四、蛋白质浓度测定使用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法，测定蛋白质的浓度。
根据实验需要，可以使用不同的测定方法。
五、蛋白质保存和分析将提取的蛋白质分装到离心管中，并存储在-80摄氏度的冰箱中。
根据实验需要，可以进行蛋白质的分析和鉴定。
常用的方法有SDS-PAGE电泳、Western blotting、质谱分析等。
这些方法可以用来确定蛋白质的分子量、表达量以及与其他蛋白质的相互作用等。
细胞提取蛋白是一项复杂的实验技术，需要注意以下几点：1. 实验前要准备好所需的试剂和设备，确保实验过程的顺利进行。
2. 在细胞裂解过程中，要注意避免蛋白质的降解和氧化，可以添加蛋白酶抑制剂和抗氧化剂等。
3. 细胞裂解后的提取液要尽量避免冻融，以免对蛋白质的活性造成影响。
裂解液和蛋白酶k
裂解液和蛋白酶k全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：裂解液是一种用于蛋白质降解的酶解液，能够将蛋白质分解成更小的肽段或氨基酸。
裂解液可用于生物化学实验中，以帮助研究人员了解蛋白质的结构和功能。
其中一种常用的裂解液是蛋白酶K，它是一种特异性的蛋白酶，能够识别和切割蛋白质中特定的氨基酸序列。
蛋白酶K最初从金黄色葡萄球菌中分离出来，因此也被称为金黄葡萄球菌蛋白酶K。
它是一种内切蛋白酶，主要作用于蛋白质分子的内部，将蛋白质分解成较短的肽段。
蛋白酶K主要识别和切割具有亮氨酸的肽键，通常切割的蛋白质序列为拉链式结构。
这些特性使得蛋白酶K成为一种非常有效的蛋白酶，可以用于蛋白质的定量分析和序列分析等实验中。
在生物化学实验中，蛋白酶K通常与其他蛋白酶一起使用，以实现更全面的蛋白质裂解。
常常将酸性蛋白酶和胰蛋白酶与蛋白酶K一起使用，以实现对各种类型蛋白质的全面降解。
通过使用多种不同特性的蛋白酶，可以更全面地了解蛋白质的结构和功能，为后续的研究工作提供重要的信息。
除了在生物化学实验中的应用外，蛋白酶K还被广泛应用于食品工业和生物技术领域。
在食品工业中，蛋白酶K被用于生产各种蛋白质基的食品添加剂，如增稠剂、发酵剂和增味剂等。
在生物技术领域，蛋白酶K则被用于蛋白质的纯化和分析，以及基因工程技术中的蛋白质合成和修饰等方面。
第二篇示例：裂解液和蛋白酶K是生物化学领域中常用的两种工具，它们在生物学和生物技术领域有着广泛的应用。
裂解液是一种含有多种蛋白酶的混合物，用来降解复杂蛋白质分子为小分子肽或氨基酸。
而蛋白酶K 则是一种特殊的蛋白酶，具有较高的特异性和活性，常用于蛋白质的裂解和鉴定。
裂解液是由多种蛋白酶组成的混合物，常见的成分包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。
这些蛋白酶在不同的PH值和温度条件下具有不同的活性，可以针对不同类型的蛋白质进行裂解。
一般来说，裂解液的制备需要注意蛋白酶的选择、浓度控制、PH值和温度的调节等因素，以保证裂解效果和裂解产物的纯度。
膜蛋白超声裂解__解释说明以及概述
膜蛋白超声裂解解释说明以及概述1. 引言1.1 概述膜蛋白超声裂解是一种常用的技术手段，用于提取和分离膜蛋白。
膜蛋白作为细胞中的重要组成部分，具有多种生物学功能，在细胞信号传导、物质运输等方面起着关键作用。
然而，由于其特殊的结构和亲疏水性质，使得膜蛋白的提取和纯化成为一项复杂而困难的任务。
超声裂解作为一种非常有效的方法，已被广泛应用于提高膜蛋白的提取效率和纯度。
1.2 文章结构本文将从以下几个方面对膜蛋白超声裂解进行深入探讨。
首先，在第2节中我们将对膜蛋白的重要性和功能进行说明，并介绍超声裂解的原理和机制。
接着，在第3节中我们将详细介绍实验所需的准备工作以及条件设置，并探讨超声处理参数选择和优化策略。
在第4节中，我们将展示并讨论通过膜蛋白超声裂解所得到的实验结果，并评估其提取效率和纯度。
最后，在第5节中我们将总结本文的研究内容，并对未来在膜蛋白超声裂解领域的发展进行展望。
1.3 目的本文旨在全面介绍膜蛋白超声裂解的原理、方法和应用，并探索其在提高膜蛋白提取和分离方面的优势。
通过本文的阐述，读者可以更好地了解并掌握膜蛋白超声裂解技术，为相关研究领域的科学家和工程师提供有价值的参考和指导。
同时，我们也希望能够激发更多研究者对于膜蛋白超声裂解技术的研究兴趣，促进该领域的进一步发展和应用。
2. 膜蛋白超声裂解的解释说明：2.1 膜蛋白的重要性和功能：膜蛋白是细胞膜上的关键组分，具有多种生物学功能。
它们参与细胞信号转导、物质运输、细胞识别和黏附等重要过程。
小到个体发育、器官发育，大到整个生命系统运作都离不开膜蛋白的正常功能。
因此，研究膜蛋白结构与功能对于理解生物活动以及开发新型药物和治疗方法具有重要意义。
2.2 超声裂解的原理和机制：超声裂解是一种利用高频声波对细胞或组织进行物理破碎的技术。
在超声波作用下，液体中会产生剧烈涡流和微小空化现象，形成强大的剪切力和冲击力，从而打破细胞壁或细胞膜，实现有效的裂解。
蛋白质的裂解
分离纯化
.
21
③马来酰化法：
称蛋白质 (200 mg)
溶于10 ml的 0.lmol／l磷酸钠缓冲液
冰浴冷却
滴加300mg马来酸酐
（溶于3ml无水三氧六环）
用0.1 N或0.5N Na○H pH= 9.0
0℃下放置30 min
继续搅拌 1h
室温透析48h（外透液为2N氨水, pH8)
冷冻干燥
分离纯化
第五章 蛋白质的裂解
.
1
一、 引 言
用Edman降解法测多肽链的氨基酸顺序，一次只能连续 降解数十个残基，用手工方法最多测二十多个残基。然而， 自然界蛋白质的分子量通常在一万以上，因此在测多肽链顺 序时，需将它们先裂解成一系列小肽，分别测出它们的顺序， 然后再找出它们的接头位置，才能定出该肽链的顺序。所以 如何选择肽链裂解的切点，将对顺序测定起着重要作用
（－）溴化氰裂解
1．原理 。溴化氰（CNBr）裂解法是多种化学法中最重要的
也是最常见的方法。 。由Gross和Witkop于1962年建立的。后人进行了系统
研究, 能专一裂解蛋氨酸残基的羧端，产率达到85% 。由于蛋白质中的Met一般都比较少，因此裂解后的肽
段较少，新生成的肽段往往是大肽段，这样很适合于 自动顺序仪测定，更适用于固相法测定。与胰蛋白酶 裂解法配合起来，通常很容易获得肽段的排列顺序
.
22
2. 胰凝乳蛋白酶裂解 : 酶解条件及缓冲液与胰蛋白酶相同, pH8.1，37℃，酶:底物=1:100，酶解1-4h
3. 嗜热菌蛋白酶裂解: 缓冲液与胰蛋白酶相同 pH8.1，50-55℃ 酶:底物=1:100或1:150，酶解2h
以避免胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的副反应
常用降解蛋白质的酶
常用降解蛋白质的酶
常用的降解蛋白质的酶有多种，主要包括内肽酶、外肽酶和二肽酶等。
1. 内肽酶：能水解肽链内部的肽键，将肽链切割成短肽的酶。
其中，胃蛋白酶能够水解芳香氨基酸及其它疏水性氨基酸组成的肽键，水解速度较快。
2. 外肽酶：又称端肽酶，只能从肽链的一端水解肽键，每次水解放出一个氨基酸。
氨肽酶可以从肽链的N-末端开始水解，而羧肽酶则从肽链的C-末端开始水解。
3. 二肽酶：专门水解二肽中的肽键，将二肽水解成单个氨基酸的酶。
在实际应用中，胰蛋白酶常用于蛋白质的裂解，其残基的羧基侧在醋酸铵或碳酸铵缓冲液中断裂。
此外，谷氨酸蛋白酶（Glu-C）也是一种常用的蛋白水解酶，可用于胶内消化。
该酶对于分析赖氨酸和精氨酸含量高的蛋白质特别有用，可以表现出完全不同于胰蛋白酶的切割特异性，提高获得蛋白质互补肽片段的可能性。
如需更多关于常用降解蛋白质的酶的相关信息，建议查阅生物科学类书籍或论文。
细菌裂解-蛋白质表达的关键性步骤说明
细菌裂解-蛋白质表达的关键性步骤说明关于包涵体蛋白质的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括包括：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化。
此次介绍菌体的破碎相关知识。
菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
细胞总蛋白的制备, SDS-PAGE,Western Blot
医学生物学研究技术与实验实验报告实验名称：细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE，Western Blot一、实验目的1. 掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术二、实验原理1. 蛋白质提取常见裂解方法极其原理。
蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。
血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。
细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。
膜蛋白的抽提比较复杂。
膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。
外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及PH的缓冲液，其中要好友EDTA，将其抽出。
固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏水性尾部结合。
在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。
较为理想的增溶剂是去垢剂。
目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。
增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。
纯化后的膜蛋白，可通过透析法去除去垢剂，进行膜蛋白重组。
抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水解酶活力，以减少细胞的自溶过程。
主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。
常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100或者NP-40等非离子去污剂（比较温柔），4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈），5 上样缓冲液（含SDS）＋细胞沸水浴5 min，6 匀浆器。
2. Lowry法测定蛋白质浓度1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物；2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测A750吸光度，做标准曲线3.SDS-PAGE分离蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。
细胞组织裂解(提蛋白)方法
第一种方法蛋白匀浆缓冲液：50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl5 mM EDTA1 % NP-40 1 mM PMSF操作步骤直接用这个进行组织匀浆然后于10000 rpm 离心20分钟收集上清作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。
我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。
将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。
上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。
70v浓缩，150v分离第二种方法裂解液配方：尿素：8M CHAPS:4% DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ 水操作步骤：取300mg样品在液氮环境下研磨，加入1ml裂解液混匀，室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻），15000g离心1小时，取上清测定蛋白质浓度。
在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以除去。
建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。
IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中没有IPG buffer可以么？（可以的，最后上胶条的时候可以再加）不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加裂解液。
裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。
用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好）第三种方法建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织，最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为30~50 ug/ul测595 OD值时，设定一个只用水的空白，把所有测得的值都减去这个空白。
wb蛋白提取步骤
wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤一、引言WB（Western Blot）蛋白提取是一种常用的蛋白质分析方法，通过将样品中的蛋白质分离、定量和检测，可以研究蛋白质的表达水平、功能和相互作用等。
本文将介绍WB蛋白提取的步骤及操作要点。
二、样品准备1. 收集样品：根据研究目的，选择合适的样品进行提取。
样品可以是细胞、组织、血清、培养基等。
2. 样品处理：对于细胞和组织样品，可先用PBS缓冲液洗涤去除残留的培养基或组织液。
对于血清样品，可离心去除悬浮的细胞或血小板。
三、蛋白提取1. 细胞裂解：将细胞沉淀离心后，加入细胞裂解液，使细胞膜破裂释放蛋白质。
可以选择不同的细胞裂解液，如RIPA缓冲液、NP-40缓冲液等。
2. 组织裂解：将组织样品切碎后，加入组织裂解液，将组织细胞破碎并释放蛋白质。
组织裂解液可以选择RIPA缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。
3. 蛋白质提取：将裂解液离心，收集上清液，即为蛋白提取物。
可以通过BCA方法或Lowry方法等测定蛋白质的浓度。
四、蛋白质分离与检测1. SDS-PAGE凝胶电泳：将蛋白样品加热变性，然后加载到凝胶孔中，施加电场使蛋白质在凝胶中进行分离。
常用的凝胶浓度为8%~15%。
2. 转膜：将凝胶中的蛋白质转移到膜上，常用的转膜方法有湿式转膜和半干式转膜。
常用的膜材料有PVDF膜和NC膜。
3. 阻断与孵育：将转膜后的膜放入阻断液中进行孵育，阻断非特异性结合位点，避免假阳性结果的产生。
4. 一抗和二抗孵育：将目标蛋白特异性抗体（一抗）孵育于膜上，然后孵育与一抗结合的二抗，二抗中带有标记物，例如辣根过氧化物酶（HRP）等。
5. 显色与成像：使用化学发光法或染色法，使膜上特定蛋白质形成显色带，然后使用成像系统进行成像和分析。
五、结果分析通过观察显色带的位置和强度，可以初步判断蛋白质的表达水平。
根据需要可以进行定量分析，使用专业软件测量带的强度，并与内参蛋白进行比较分析。
六、注意事项1. 样品保存：样品提取后应及时保存，避免蛋白质降解。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分离纯化
（3）TPCK一胰蛋白酶活力的测定方法
称底物苄酰L-精氨酰乙酶盐酸盐（Bcnzyl-L-Argininc cthv1 cster· H C1 简称 BAEE) 3.9mg 溶于10ml 0.05mol／l Tris缓冲液（pH＝9.24）中，将TPCK处理过的胰蛋白酶 l mg 溶于10 m1 0.001N HCI中，吸底物3ml在紫外分光光度计上 （波长253nm处），调节光密度为0，然后加人0.2ml 酶液。 每隔30秒钟读一次光密度数，直至读数不变为止，一般在10 分钟内稳定。
酶解和化学裂解是顺序分析中互为补充缺一不可的手段
二、蛋白质的酶裂解
（－）简述 用特异性水解酶裂解肽链有许多优点：专一性强， 降解后的肽段容易纯化，产率较高，副反应少，在酸 水解中容易受破坏的谷氨酰氨、天冬酰氨和色氨酸等 在酶解中都不受影响。
整个酶解反应中，酶解条件的选择相当重要，需要 考虑下列因素：
Pro蛋白酶
特异性在Pro羧基所形成肽键处裂解的
蛋白酶，从小羊肾中提取
（四）实验方法
1. 胰蛋白酶裂解 （l）TPCK一胰蛋白酶降解 称1.0mg蛋白质 + 0.5ml双蒸水
+ 0.5m1 0.2mol／l N-甲基吗啉缓冲液（pH 8.1）
+ 10-20 ug TPCK-胰蛋白酶 37℃保温反应4-6h 冷冻干燥 加50ul双蒸水溶解，离心
4. 嗜热菌蛋白酶
含金属的酶，锌原子和钙原子，锌是活力所必需的， 钙使酶在高温下稳定，该酶易被EDTA所抑制。 专一性比上面三种酶都差，用来直接酶解蛋白质 不太合适，因为产生的肽段相对较多，不仅纯化起来 麻烦，而且对以后的顺序重排也不利。如用它来裂解 次级肽，即先用专一性较强的酶或化学试剂把蛋白质 多肽链降解成大肽段，再切成小肽段时，嗜热菌蛋白 酶可发挥很好的作用。
加入ETPA时，产生沉淀
2小时反应结束 4℃ 透析 (pH= 8, 5％(w/v)NH4HCO3) 分离纯化
③马来酰化法：
称蛋白质 (200 mg) 溶于10 ml的 0.lmol／l磷酸钠缓冲液
冰浴冷却
滴加300mg马来酸酐 （溶于3ml无水三氧六环） 用0.1 N或0.5N Na○H pH= 9.0 0℃下放置30 min
冰冻干燥
再溶于50ul 双蒸水 待分离纯化 分离纯化
7.密环菌蛋白酶裂解:
蛋白质 1.0mg 溶于0.5m1 0.1mol/l 1N - 甲基吗啉醋酸缓冲液 或 0.07％氨水 （pH8.1） 1 ug 酶 溶于5 ul 双蒸水
（酶:底物 = 1:1000）
37℃下搅拌反应 4-6h 冷冻干燥 50 ul 双蒸水溶解 分离纯化供测顺序用
第五章 蛋白质的裂解
一、 引 言
用Edman降解法测多肽链的氨基酸顺序，一次只能连续 降解数十个残基，用手工方法最多测二十多个残基。然而， 自然界蛋白质的分子量通常在一万以上Байду номын сангаас因此在测多肽链顺 序时，需将它们先裂解成一系列小肽，分别测出它们的顺序， 然后再找出它们的接头位置，才能定出该肽链的顺序。所以 如何选择肽链裂解的切点，将对顺序测定起着重要作用
Arg 蛋白酶
（1）Chostripain 酶 专一性裂解精氨酸羧端的蛋白酶。
专一性很高；肽链的羧端是精氨酸；该酶在6mol
／l尿素20小时内仍保持活力，这样对不溶性蛋白质 的长时间裂解就很有效。 （2）凝血酶（thrombin）是另一个作用精氨酸羧端的 特异酶, 对Arg-Gly 键裂解特别快。
激烈搅拌2小时，pH 8.5 左右
透析或用Sephadcx G-25柱除试剂和盐
分离纯化
② ETPA法：以ETPA与溶菌酶反应为例 蛋白质 硼酸缓冲液（ 0.2mol/l pH=8.8） 12 mg 蛋白质 /ml， 过量的ETPA（按参与反应的Lys基团数计算） 12倍，搅拌下分批滴加 用l N NaOH pH = 8.5－9.0
胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶有一个 共同的特点，即它们的作用范为比较宽，并且主要裂 解中性氨基酸残基。
（三）几种高特异性的肽链内切酶
在蛋白质顺序测定中，对较大分子量的蛋白质采用逐级 特异性裂解是比较理想的。
Glu蛋白酶
Glu蛋白酶亦称金黄色葡萄球菌蛋白酶，是从金 黄色葡萄球菌菌株V8中分离得到的，是最有效、应 用最广泛的一个酶，分子量只有12,000。 当酶解在磷酸缓冲液（pH7.8）中进行时，它能 在谷氨酸和天冬氨酸残基的羧端处裂解肽键。 用碳酸氢铵（pH7.8）或醋酸胺（pH4.0）时，则 仅在谷氨酸的羧端处裂解。 该酶对下列蛋白质只在谷氨酸的羧端处裂解：核 糖体蛋白S7，L23，EL12，维生素A1结合蛋白,钙结 合蛋白，a1[lll］胶原蛋白, ß 2小球蛋白。
裂解条件要求： 裂解点少 专一性强 反应产率高 裂解方法： 酶法
化学法
早期：部分酸水解法裂解，由于专一性 低，裂解后生成很多小肽，造成 分离纯化困难，工作量也很大。 中期：生化学家改用蛋白酶酶解，因专 一性强，故被广泛地使用。 后来：随着自动顺序仪的广泛使用和对 大肽段的需求，发现某些化学试 剂对蛋白质的裂解有特异的优点。 化学法再流行。
以避免胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的副反应
4．胃蛋白酶裂解 : 1.0 mg蛋白质 + 0.5ml 0.05N 醋酸或稀甲酸中, pH 2.0 + 10ug 胃蛋白酶（溶于10ul双蒸水）
37℃下搅拌反应 2h
冰冻干燥 随后溶于50ml双蒸水中 离心 分离纯化
5. Gul蛋白酶裂解:
蛋白质 1.0 mg 溶于1.0 m1 醋酸铵缓冲液 0.1mol, pH4.0
讨论：
如果蛋白质分子量较大，或遇到碱性蛋白含有较多的赖氨 酸和精氨酸残基时，则酶解后的肽段数就会很多，将给顺 序测定带来很大麻烦。 方法：用柠康酸酐可逆保护赖氨酸的ε-氨基，使胰蛋白酶 酶解时不会在赖氨酸羧端裂解，而只在精氨酸的羧端裂解， 以后也很容易去掉保护基团。 ε氨 基 保 护 剂
2、胰凝乳蛋白酶
上清液待分离纯化后供测顺序用
（2）TPCK处理胰蛋白酶
胰蛋白酶（200mg）
溶于62 m1 0.001mo1／l CaCl2 用3% NaOH 调pH至7.0
在15-20℃加人含6mg TPCK 0.6ml无水甲醇溶液
继续搅拌 维持pH7.0 约5.5h
用pH3.0的盐酸水溶液透析2.5天
然后冻干。
O.D. 活力单位计算公式： a.u. = ------------C酶
（4）保护Lys ε-NH2的方法
① 柠康酰化法： 蛋白质
溶于6mol／l 盐酸胍或
8 mol／l 尿素（20-30mg 蛋白质／ml） 在室温（20℃）下 用12 N Na○H 调pH 至8.0 柠康酸酐25mg（10倍于蛋白质的量）
3．胃蛋白酶
专一性与胰凝乳蛋白酶类似 适宜酶解pH值是2
在顺序测定中很有价值，因为在确定二硫键的位置时， 在这样的酸性环境下二硫键比较稳定，很少有二硫键的互换 反应。反应条件选择恰当，可以变低特异性为高特异性。
在pH2.5的水溶液中，用胃蛋白酶酶解 胰岛素于3℃冰水浴恒温反应1.5h，此后用lN NaOH调pH=9以终止反应。结果用Scphadex G-50柱（3.0×110cm）分离得到了很纯的去 B链羧端五肽胰岛素，说明胃蛋白酶在酶解 中只降解胰岛素B链中第25位苯丙氨酸的羧 基所形成的肽键（—Phc25- -THR26-Thr27Pro28－LyS29-aLA30）
继续搅拌 1h
室温透析48h（外透液为2N氨水, pH8) 冷冻干燥 分离纯化
2. 胰凝乳蛋白酶裂解 : 酶解条件及缓冲液与胰蛋白酶相同, pH8.1，37℃，酶:底物=1:100，酶解1-4h
3. 嗜热菌蛋白酶裂解:
缓冲液与胰蛋白酶相同
pH8.1，50-55℃ 酶:底物=1:100或1:150，酶解2h
因此a一胰凝乳蛋白酶由A、B、C三条多肽链组 成，它们分别含有13，130，96个氨基酸残基。
凝凝乳蛋白酶
凝凝乳蛋白酶的专一性不如胰蛋白酶，
酶解Tyr，Phe、Trp、Len等疏水氨基酸羧基 所形成的肽链，
也能在val、Ile、Ser、Gly的羧端裂解，但较 慢。如果被裂解的邻近基团是碱性的（如Lys、 Arg或His），裂解能力将增加。倘若邻近是Pro 或Phe—Pro，则不能酶解。 在酶解中，增加酶的比例（对底物）能提高 酶解能力，这时，甚至象Ala-val键也能酶解。
当肽链中有二个相邻的甲硫氨酸，则产生一游离高 丝氨酸内酯和二个新肽段：
当甲硫氨酸在C末端，则C末端变为高丝氨酸内酯：
2. 实验方法
蛋白质 70%甲酸中
三、蛋白质的化学裂解
是蛋白质顺序测定中的另一重要手段 产物的肽段一般都比较大 裂解产物适合于在自动顺序仪中测定顺序 产物有利于肽段的吻合 因此化学法对较大分子量的蛋白质顺序测定是重要的
缺点：因为化学裂解后的肽段较大。往往会遇到不溶解 和集聚等问题，分离较困难，产率一般也比酶解为低。
（－）溴化氰裂解
(3) 颌下腺蛋白酶也有裂解精氨酸所形成的肽键的专一
性, 对磷脂酰胆碱交换蛋白只裂解Arg-Glu键，对 血纤维蛋白原只裂解Arg-Arg键。
Lys 蛋白酶
选择性一般不如Arg蛋白酶专一
1）密环菌（Armillaria mellea）是裂解赖氨酸氨端肽键,条 件是在赖氨酸残基的羧端必须联有谷氨酸、天冬氨酸或天 冬酰胺残基。这个酶对精氨酸也具有活力，如在酶解天冬 氨酸氨转移酶时，发现它在部分赖氨酸残基氨端裂解外， 还同时裂解三个Arg-Leu（Ile）键 2）血纤维蛋白酶裂解血纤维蛋白原时也发现除裂解部分的 赖氨酸外，也裂解精氨酸氨端肽键 3) Myxobactcr AI-1是另一种Lys蛋白酶。 它是从一种粘细 菌中提取的，也能在赖氨酸残基的氨端裂解，条件是，赖 氨酸残基的羧端通常联有Tyr，Ala和Gln残基 4) 凝血酶样酶（thrombin enzyme) 是 Lys-Leu键的高特异 性Lys蛋白酶。