双歧杆菌发酵工艺研究

双歧杆菌发酵工艺研究

双歧杆菌是人和动物肠道内最重要的生理性细菌之一，具有维持生态平衡、生物拮抗、免疫调节和营养等多方面的生理功能。本文介绍了双歧杆菌的发酵工艺研究进展，主要对发酵工艺的菌种选育、培养基优化、培养方式三个方面进行了阐述，并对双歧杆菌的发展前景进行了分析和展望。

标签：双歧杆菌；发酵工艺；研究进展双歧杆菌（Bifidobacterium）最早是由法国巴斯德研究所的Henry Tissier(1899)从母乳喂养婴儿粪便中分离获得呈不规则形态的革兰氏阳性杆菌。双歧杆菌主要寄生在人和动物的肠道内，对宿主发挥生物屏障、营养、免疫、延缓衰老、抗肿瘤等生理作用。双歧杆菌是人体肠道内的正常菌群之一，其存在和数量随着年龄增长而变化，是人体健康的风向标[1]。早在20世纪中，人们就利用双歧杆菌制成活菌制剂治疗腹泻等疾病，并且得到了长足的发展。其中提供菌体得率，获得更多的活菌体，一直都是双歧杆菌的研究重点。由于液体发酵具有发酵速度快、周期短和产量高的特点，目前大多数双歧杆菌发酵都采用液体发酵工艺。其发酵流程一般采用如下路径：菌种活化→种子液培养→发酵罐放大培养→菌体收集。

通过发酵工艺的优化可大幅度提高菌体得率，降低生产成本，提高经济效益。本文主要在菌种选育、培养基组分的优化、发酵条件的优化、发酵设备工艺的完善及培养方式创新等方面探讨了双歧杆菌发酵研究的相关进展。

1菌种选育

性能优良的菌株是进行良好发酵的前提。根据不同的要求，选育出不同性能的菌株。由于双歧杆菌属于专性厌氧菌，且不耐酸。因此大大增加了培养难度，提高了生产成本。为减弱生产及储存过程中氧气的摄入对双歧杆菌的毒害，日本已筛选出较耐氧的双歧杆菌，但完全需氧的菌株尚未选育出。为了能够活着到达人体肠内，也筛选出耐酸及耐胆汁的双歧杆菌。目前改善和提高双歧杆菌耐氧性的方法主要是逐步驯化或基因诱变[2]。近年来，许多学者采用多种基因工程手段，构建具有优良性能的双歧杆菌菌株。例如采用基因组重组方法，构建具备不同特定优良性状的双歧杆菌多态性文库，通过多重递归原生质体融合(RPF)使菌株之间进行基因交换重组，最终获得具有多种优良性状于一体的重组双歧杆菌菌株。也有实验将专性厌氧短双歧杆菌和典型上面发酵的啤酒酵母进行原生质体细胞融合获得了具有耐氧性的融合子，明显改善了双歧杆菌的耐氧性。

2培养基优化

双歧杆菌对营养要求严格，不同种的菌株对营养要求也有所差异。性能优良的培养基可显著提高菌体得率，延缓迟滞期。目前对双歧杆菌培养基成分的优化主要是对碳源、氮源、矿物元素、双歧因子等的筛选。

2.1碳源双歧杆菌以有机碳源作为能源和碳源。葡萄糖等单糖和一些低聚糖

类可作为菌体的主要的碳源，但双歧杆菌不能直接利用淀粉、纤维素等多聚糖类。双歧杆菌体内含有的许多人和动物体内所不具有的糖代谢酶。许多促进双歧杆菌生长的碳源大多是能被双歧杆菌利用但不能被人和动物机体利用的糖类，除乳酮糖外，主要为寡糖，乳寡果糖、寡半乳糖、大豆寡糖[3]。由于葡萄糖、果糖等单糖可被菌体快速利用，目前绝大多数双歧杆菌培养基都使用由单糖和其他聚糖组成的复合碳源，而很少只含有单一碳源。

2.2氮源双歧杆菌的蛋白酶活性通常较弱，甚至缺乏必要的蛋白酶，最适氮源为蛋白质的水解产物:蛋白胨、肽类和氨基酸等。Azao对低浓度下，碳源和氮源是否是生长限制性因子进行了研究，结果表明，葡萄糖不是生长限制性因子；而氮源，特别是酵母抽提物是生长限制性因子。1993年Klaver F A等报道将17个双歧杆菌菌株在纯牛奶中进行培养，结果又有15个菌株不能生长。但在添加酪蛋白降解产生的肽和氨基酸后即可获得生长，这是因为这些菌株缺乏分解蛋白的酶。实验表明:人为添加动物性复合氨基酸，能够使双歧杆菌活菌数目获得明显提高，且活菌数目的衰减也会衰减[4]，如果培养基中缺乏天冬氨酸，双歧杆菌的活性降低50%[5]；酵母膏中富含核苷酸、蛋白质等物质，对活菌数目有明显影响，在培养基中不加或少量添加酵母膏，菌体停止生长或很快死亡。研究发现，这此物质均为含有硫的多肽类物质，如果它们的二硫键被还原或烷基化则失去促双歧杆菌生长的活性。

2.3矿物元素双歧杆菌要求矿物元素如钠、钾、磷、硫、铜、铁、镁、钙、锰和锌等。铜、铜、锌是双歧杆菌超氧化物歧化酶的主要组成部分，其含量对菌体生长有显著地影响。NovikG.I等在青春双歧杆菌94-BIM的培养基中添加一天然隧石粉时获得的矿物质，可显著提高菌体生长速率，降低代时，增加如乙酸、乙醇和乳酸等代谢物的积累和胞外蛋白酶的表达水平。此外，双歧杆菌能够合成维生素B1，B2，B6和K等，而它们生长需要的维生素B2，B5，B6，B12等维生素B是组成各种酶的活性基本成分，如果缺失，其酶类没有活性，菌体不能生长。

2.4双歧因子自然界中存在一些能够促进双歧杆菌增殖的物质，我们把这些物质称之为双歧因子[6]。由于双歧因子可明显促进双歧杆菌的增殖，大量学者对双歧因子进行了大量研究。根据近年国内外双歧因子研究情况，从目前已报道的双歧因子文献分析，它主要包括低聚糖、蛋白质及其水解产物、天然植物和中草药提取物类等。广泛筛选合适的双歧因子，促进双歧杆菌的增殖，获得更多的活菌体，无论是对双歧杆菌机理研究还是创造经济价值，都具有重要意义。

3培养方式与菌体收集

发酵罐配有温度和pH值控制系统，并可同时进行补料，实现微生物的自动化培养，已经成为规模化发酵双歧杆菌的首选反应容器。为了实现双歧杆菌的高密度培养，同时考虑到双歧杆菌严格的培养条件和营养要求，许多研究者对双歧杆菌在发酵罐上的高密度培养进行了大量的研究，采用的方法有分批补料培养、过滤培养和连续培养等[7]。曹郁生等报道了利用自己组装的连续培养装置，对两歧双歧杆菌的厌氧连续培养方法进行了研究。控制连续培养系统pH值为6.0，

采用了种不同的稀释率，以检查稀释率对培养物的影响，当达到稳定状态时，分别对其活菌数量、乳酸和乙酸的产量进行了分析。与静置批量培养相比，连续培养方法得到的菌液中活菌数较高，活力好，单位容积的产量较高。Kwon[8]利用深层生物膜反应器(submerged membrane bioreactor)实现了对B.bifidum的高密度培养，发酵36 h后，菌体密度可达到2.2×1010CFU/mL，较普通连续发酵提高了7.3倍。收集活菌体的方式大致有两种：膜过滤法和离心法[9]。目前双歧杆菌的手机多采用离心法。此法渐变、快捷、适于商业化生产。

4展望

由于雙歧杆菌属于专性厌氧菌，且对营养要求严格，因此给双歧杆菌的发酵带来了很大困难。随着微生态理论的发展和生物工程技术的进步。通过进一步选育更高耐氧耐酸的菌种，优化培养基成分，改进培养方式等手段来进一步优化双歧杆菌发酵工艺。相信随着双歧杆菌发酵工艺的进一步提高，双歧杆菌必将在食品、医药以及饲料等方面发挥更重要的作用。

参考文献：

[1]郭本恒.益生菌[M].化学工业出版社,2004:213-247.

[3]吕兵,项建琳.应用原生质体融合技术改善双歧杆菌的耐氧性[J].食品科学,2005,26(4):83-86.

[4]林娟,邱宏端,谢航,等.耐氧耐酸双歧杆菌的选育[J].福州大学学报,2003,31(3):368-371.

[5]刘彦亮.黄芪及其它中草药对双歧杆菌增菌的影响研究[D].河北农业大学,2008.

[6]唐涌镰,王凌华,黄瑞珊,等.耐氧青春与婴儿双歧杆菌共同发酵营养需求[J].上海交通大学学报1997,31（4）:86-89.

[7]金世琳.双歧杆菌的功能-健康科学的探索[J].中国乳品工业,1999,27（3）:40-43.

[8]何湘,刘大伟,孙忠科,等.长双歧杆菌NCC2705葡萄糖与乳糖代谢的比较蛋白质组学[J].微生物学报,2008,48（11）:1451-1453.

[9]李青青.耐氧性双歧杆菌的筛选及其生理特性与应用研究[D].浙江大学,2010.