发酵工艺研究

毕业论文（设计） 题 目 普那霉素发酵工艺研究 姓 名 管其君 学 号 3010402011

分院(系) 生物与化学工程分院

专业班级 生物工程（1）班

指导教师 金志华

2005年 6 月 14 日

宁波理工学院 I

摘要 分析了普那霉素发酵过程中种龄、初始pH值、发酵时间等工艺条件变化对普那霉素产量的影响规律，确定了最佳的发酵工艺条件。考察了不同碳氮源浓度的培养基对普那霉素产量的影响，优化了培养基成分。此外，在发酵液中添加大孔吸附树脂来解除终产物抑制方面作了尝试，发现添加大孔吸附树脂显著提高了普那霉素的产量，发酵水平达到1.49g/L。

关键词：普那霉素；始旋链霉菌；发酵；优化；大孔吸附树脂 Abstract The effects of seed age, initial pH, fermentation time on pristinamycins fermentation were studied and the most suitable fermentation conditions were determined. Also, the effects of medium containing with different concentration of carbon source and nitrogen source on pristinamycins fermentation were studied and the optimized medium was confirmed. By adding macroporous adsorbent resins into medium, the pristinamycins production was increased further, and the output of pristinamycins reached 1.49g/L

Keywords: pristinamycins; Streptomyces prinstinaespiralis; fermentation; optimization; macroporous adsorbent resins 目录 摘要……………………………………………………………………………Ⅰ

Abstract ………………………………………………………………………Ⅱ

第一章 文献综述 1.1前言 …………………………………………………………………1

1.2 普那霉素概述 ……………………………………………………1

1.2.1普那霉素的特点 ………………………………………………1

1.2.2作用机理…………………………………………………………2

1.2.3合成途径…………………………………………………………2

1.2.4奎奴普汀Quinupristin 和达福普汀Dalfpristin…………3

1.2.5生产工艺…………………………………………………………3 1.3、本课题的研究内容 …………………………………………4

第二章 材料与方法

2.1实验材料 ……………………………………………………………5

2.1.1菌种………………………………………………………………5

2.1.2 培养基 …………………………………………………………5

2.1.3试剂与仪器 ……………………………………………………5

2.2 实验方法 ………………………………………………………6

2.2.1 培养方法 ………………………………………………………6

2.2.2分析方法 …………………………………………………………6

2.2.2.1菌体量………………………………………………………6 2.2.2.2 还原糖（DNS法）……………………………………………6 2.2.2.3氨基氮 （甲醛法）……………………………………………6 2.2.2.4 pH值 …………………………………………………………6 2.2.2.5普那霉素（HPLC）……………………………………………7 2.2.2.6发酵液的预处理方法…………………………………………7 第三章 结果与讨论

3.1标准曲线的绘制 ……………………………………8

3.1.1 普那霉素标准曲线 ……………………………………8 3.1.2 葡萄糖标准曲线………………………………………8 3.2 普那霉素的全波长扫描图谱 ……………………9 3.3发酵液的预处理 ……………………………………9

3.3.1萃取剂的选择 …………………………………………9 3.3.2萃取对象的选择………………………………………10 3.4 HPLC 图谱 …………………………………………11

3.5生长曲线 …………………………………………11 3.6接种菌龄对普那霉素产量的影响…………………12

3.7培养基初始pH值对普那霉素产量的影响 ………13 3.8添加树脂对普那霉素产量的影响 ………………14

3.9 C源和Ｎ源对普那霉素产量的影响 ……………15 3.9.1 C源的影响……………………………………………15 3.8.2 Ｎ源的影响……………………………………………16 第四章 小结 …………………………………………17

第五章 参考文献………………………………………18

致谢 …………………………………………………………19 1

第一章 文献综述 1.1前言 从青霉素广泛使用以来，抗生素早已经成为人类抵抗病菌微生物的重要手段。但由于抗生素的滥用，临床上病原菌的种类和药敏类型均发生了很大的变化，各种各样的抗性基因也出现得越来越频繁[1]。耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA），耐万古霉素和替考拉宁的粪肠球菌等多重耐药性细菌的出现使得越来越多的抗生素失去效用。抗生素产业发展到今天，需要不断开发新成员，以应对新的抗药性细菌的产生。 链霉菌是主要的抗生素产生菌之一。Selman Waksman等人[2]从灰色链霉菌（S.griseus）中发现了链霉素，这是继青霉素后发现的第二种很有应用价值的抗生素。此后，一系列由链霉菌产生的抗生素陆续被发现。 发酵是一种很复杂的生化过程，其好坏涉及诸多因素。除了菌种的生产性能，还与发酵工艺有密切关系。发酵工艺一向被认为是一门艺术，即使有多年的经验也不易掌握。发酵生产受许多因素的影响和工艺条件的制约，不同菌种、培养基和生产水平都会对产量造成极大的差异。作为小分子物质的抗生素，其合成更是需要多种复合酶的参与，其工艺控制亦更为复杂[2]。

1.2普那霉素概述 1.2.1普那霉素的特点 普那霉素是由始旋链霉菌（S.prinstinaespiralis）产生，属于链阳性菌素类抗生素，由两类化学性质不同的物质组成：属于B族链阳性菌素的普那霉素I(PIA、PIB、PIC)和属于A族链阳性菌素的普那霉素Ⅱ(PⅡA、PⅡB)， 其化学结构见图1和图2。 普那霉素IA和普那霉素ⅡA是其主要成分，两者作用于细菌核糖体，抑制蛋白质的合成。对大多数格兰氏阳性菌和部分格兰氏阴性菌有效[1]。体外实验表明普那霉素IA和普那霉素ⅡA联合使用可使其抗菌活性比各组分单独使用高10 2

倍以上[3] 。这种协同作用扩展了该类抗生素的抗菌谱，使之对细菌表现为杀菌作用，而各组分单独使用则表现为抑菌作用[3] 。同时，由于存在两种结构完全不同的组分，该类抗生素耐药性获得较缓慢。 表1.普那霉素的组成成分

普那霉素ⅠA 普那霉素ⅡA 图1普那霉素的化学结构式 1.2.2作用机理 A、B族两组分都连接在细菌核糖体的50S亚基上来抑制蛋白合成，A、B组分与细菌核糖体转移酶部位结合。 A组分阻止tRNA与核糖体结合及肽键形成从而阻断多肽链的延长； B组分可能干扰多肽链的释放。A组分还可能通过改变核糖体构型使B组分与核糖体亲和力增强，所以两者具有协同抗菌活性 [4]。 1.2.3合成途径 普那霉素ⅠA由3-羟基吡啶羧酸、L-苏氨酸、D-氨基丁酸、l-脯氨酸、αN-甲基-4-二甲基氨基-L-苯丙氨酸、4-酮-L-六氢吡啶羧酸、L-苯甘氨酸组成。生物合成过程中包括前体的合成、分枝六肽的生物合成和大环的修饰。示踪实验证明普那霉素ⅠA的结构类似物维吉尼霉素S1起源于苯丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨

成分 分子式 分子量 PⅠA C45H54O10N8 866 PⅠB C44H52O10N8 852 PⅠC C44H52O10N8 852 PⅡA C28H35O7N3 525 PⅡB C28H37O7N3 527 3

酸、赖氨酸、和脯氨酸[5,8]。 普那霉素ⅡA的基本骨架起源于缬氨酸、7个乙酸单位、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸和来自丝氨酸的噁唑环。缬氨酸是普那霉素PⅡA生物合成的起始单位[5,8]。在始旋链霉菌和一些其他的链阳性菌素A的产生菌体内获得了14C标记PⅡB到PⅡA的高水平转化，也已经证明了原始霉素ⅡA是由前体原始霉素ⅡB通过单氧化酶和原始霉素ⅡA合成酶转化而来的。运用基因工程技术已经成功的克服了普那霉素ⅡA合成代谢中的瓶颈[6]。 普那霉素ⅡA合成酶是SnaA和SnaB基因相应的多肽异源二聚体，snaA、snaB被Blanc 等人成功克隆[7]。Sezonov 等人将编码此二聚体的snaA和snaB引入始旋链霉菌，使普那霉素ⅡB完全转化为普那霉素ⅡA[10]。

1.2.4奎奴普汀（Quinupristin） 和达福普汀（Dalfpristin） 由于普那霉素水溶性差，不易制成肠外制剂，因此其临床应用受到限制。天然的普那霉素IA和ⅡA经化学修饰得到的水溶性衍生物RP59500（商品名Synercid）则可以解决这一问题，它是由奎奴普汀与达福普汀以30:70（W/W）的比例混合制成。RP59500由法国安万特公司开发，其在快速治疗重症病人方面疗效显著，它们的化学结构见图2。

Quinupristin (RP 57669) 30% Dalfpristin (RP 54476) 70% 图2. RP59500

1.2.5生产工艺 国外对有关普那霉素的生物合成相关酶及基因已有较多的研究报道[6] ，对