高效液相色谱分类及工作原理

阳离子交换： 阳离子交换：
R
SO3 H
- +
+
M
+
R
SO3-M+
+ H+
阴离子交换：
R
NR3+Cl-
+
X
-
R
NR3+X-
+ Cl-
一般形式：
R一A＋B ＝ R－B＋A
达平衡时，以浓度表示的平衡常数（ 达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应 的选择系数）： 的选择系数）：
KB / A
[B]r [ A] = [B][ A]r
X + nSad = Xad + nS
达平衡时,有 达平衡时 有
Kad
[ X ad ][S] = n [ X ][Sad ]
n
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂 为吸附平衡常数， 其中 为吸附平衡常数 上保留强，难于洗脱。 值小,则保留值弱 上保留强，难于洗脱。Kad值小 则保留值弱，易 值小 则保留值弱， 于洗脱。试样中各组分据此得以分离。 于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通 值可通 过吸附等温线数据求出。 过吸附等温线数据求出。
这类固定相的多孔层厚度小、孔浅， 这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相 对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大， 对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大， 渗透性好，装柱容易， 渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平 较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 最大允许量受限制。 最大允许量受限制。
柱之内径
长度
填充材料粒度
使用压力
分离时间
㈡与气相色谱法比较，HPLC的优点 与气相色谱法比较， 的优点
1.分析对象广 分析对象广 气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化 合物； 合物 ； HPLC不受样品挥发性和热稳定性 不受样品挥发性和热稳定性 的限制，适用于高沸点、热稳定性差、 的限制 ， 适用于高沸点 、 热稳定性差 、 摩 尔质量大的物质。原则上讲， 尔质量大的物质 。 原则上讲 ， 几乎可以分 析除永久气体外所有的有机和无机化合物。 析除永久气体外所有的有机和无机化合物 。
2.固定相 固定相
（l）多孔型离子交换树脂 它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联 聚合物，直径约为5 20μm μm， 聚合物，直径约为5～20μm，有微孔型和大 孔型之分。 孔型之分。 （2）薄膜型离子交换树脂 它是在直径约对30μm的固体惰性核上， 凝聚1～2μm厚的树脂层。 （3）表面多孔型离子交换树脂 它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅 胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。
• 高压液相色谱对于挥发性低、热稳定性差、分 高压液相色谱对于挥发性低、热稳定性差、 子量大的高分子化合物以及离子型化合物的分 离尤为有利。如氨基酸、多肽、蛋白质、 离尤为有利。如氨基酸、多肽、蛋白质、生物 核酸、甾体、类脂、维生素、 碱、核酸、甾体、类脂、维生素、抗菌素等均 可进行分离分析定量。 可进行分离分析定量。
（4）离子交换键合固定相 ） 它是用化学反应将离子交换基团键合 到惰性载体表面。它也分为两种类型。 到惰性载体表面。它也分为两种类型。 一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。 一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。 另一种是键合微粒载体型，它的载体是 另一种是键合微粒载体型， 多孔微粒硅胶。 多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子 交换固定相，它的优点是机械性能稳定， 交换固定相，它的优点是机械性能稳定， 可使用小粒度固定相和高柱压来实现快 速分离。 速分离。
3.流动相 流动相
流动相称作洗脱剂。 一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂 一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。 在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极 性强的洗脱剂； 性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性 弱的洗脱剂。 弱的洗脱剂。
三、离子交换色谱法（IEC） 离子交换色谱法（ ）
此法是利用离子交换原理和液相色谱技 此法是利用离子交换原理和液相色谱技 术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一 种分离分析方法。 种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物 通常都可用离子交换色谱法进行分离。 质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。 它不仅适用无机离子混合物的分离， 它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用 于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、 于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白 质等生物大分子。因此，应用范围较广。 质等生物大分子。因此，应用范围较广。
缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。 缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。
第二节
HPLC的主要类型 的主要类型
液一液分配色谱法（ 一、液一液分配色谱法（LLPC） ）
在液-液色谱中 流动相和固定相都是 在液 液色谱中,流动相和固定相都是 液色谱中 液体,它能适用于各种样品类型的分离和分 液体 它能适用于各种样品类型的分离和分 无论是极性的和非极性的， 析，无论是极性的和非极性的，水溶性和 油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。 油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。
2.固定相 固定相
液液色谱的固定相由载体和固定液 组成。常用的载体有下列几类： 组成。常用的载体有下列几类： （1）全多孔型载体：由硅胶、硅藻土等 ）全多孔型载体：由硅胶、 材料制成，直径约100 µm的全多孔型颗 材料制成，直径约 的全多孔型颗 粒。 这类固定相由于颗粒很细， 这类固定相由于颗粒很细，孔仍然 较浅，传质速率快，易实现高效、高速。 较浅，传质速率快，易实现高效、高速。 特别适合复杂混合物分离及痕量分析。 特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
㈠经典LC与HPLC比较 经典 与 比较
经典LC 经典LC 1~5cm 50~100cm 50~100cm 150µm~200µ 150µm~200µm 1~10atm 10atm 0.5h~天 h~天 HPLC ~0.4cm 15~50cm 15~50cm 4µm~10µm m~10µ 50~200atm 50~200atm ~10min 10min
2．固定相 ．
液 － 固吸附色谱所用固定相多是一些 吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、 吸附活性强弱不等的吸附剂 ， 如硅胶 、 氧 化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多， 化铝 、 聚酸胶等 。 由于硅胶的优点较多 ， 如线性容量较高，机械性能好，不溶胀， 如线性容量较高 ， 机械性能好 ， 不溶胀 ， 与大多数试样不发生化学反应等，因此， 与大多数试样不发生化学反应等 ， 因此 ， 以硅胶用得最多。 以硅胶用得最多。 目前最广泛使用的还是5～10 µm的全 目前最广泛使用的还是5 多孔型微粒填料。 多孔型微粒填料。
第一节 高效液相色谱法概述
一、理论基础：速率理论 理论基础：
B H = A + + Cu u
A为涡流扩散项 B/u分子扩散项 Cu项即传质阻力项
二、HPLC技术 技术
采用高压输液泵，高效微粒固定相和高 采用高压输液泵， 灵敏度检测器。 灵敏度检测器。
三、HPLC特点 特点
高压、高速、高效、高灵敏度、 高压、高速、高效、高灵敏度、样品回 收方便。 收方便。
二、液一固吸附色谱法(LSAC) 液一固吸附色谱法(LSAC)
液一固吸附色谱是以固体吸附剂作 为固定相， 为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体 颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。 颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。 液固色谱实质是根据物质在固定相上的 吸附作用不同来进行分离的。 吸附作用不同来进行分离的。
（2）表面多孔型载体（薄壳型微珠载 ）表面多孔型载体（ ）：由直径为 由直径为30 体）：由直径为 ~ 40µm的实心玻璃球 µ 的实心玻璃球 和厚度约为1 的多孔性外层所组成。 和厚度约为 ~ 2 µm的多孔性外层所组成。 的多孔性外层所组成 目前，这种载体粒度为5 目前，这种载体粒度为 ~ 10 µm。 。
⑶化学键合固定相：它是将各种不同有机基 化学键合固定相：
团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。 团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。 它代替了固定液的机械涂渍， 它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产 生对液相色谱法迅速发展起着重大作用， 生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以 认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。 认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。 它是目前应用最广泛的一种固定相。 它是目前应用最广泛的一种固定相。 据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学 据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学 3/4 键合固定相上进行的。 键合固定相上进行的。
式中[A]r，[B]r 分别代表树脂相中洗脱剂离子 ， 式中 （A）和试样离子（B）的浓度，[A]、[B]则代表 ）和试样离子（ ）的浓度， 、 则代表 它们在溶液中的浓度。 它们在溶液中的浓度。 KB/A越大，说明 离子交换能力越大，越易保 越大，说明B离子交换能力越大 离子交换能力越大， 离子电荷越大， 留而难于洗脱。一般说来， 离子电荷越大 留而难于洗脱。一般说来，B离子电荷越大，水 合离子半径越小， 值就越大。 合离子半径越小， KB/A值就越大
1．离子交换原理 ．
离子交换色谱法是利用不同待测离子对 固定相亲和力的差别来实现分离的。 固定相亲和力的差别来实现分离的 。 其固定 相采用离子交换树脂， 相采用离子交换树脂 ， 树脂上分布有固定的 带电荷基团和可游离的平衡离子。 带电荷基团和可游离的平衡离子 。 当待分析 物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的 平衡离子进行可逆交换， 平衡离子进行可逆交换 ， 其交换反应通式如 下：
3．流动相 ．
根据所使用的流动相和固定相的极性程 将其分为正相分配色谱 反相分配色谱。 正相分配色谱和 度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。
正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性， 正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性， 它适用于极性化合物的分离。 它适用于极性化合物的分离。其 流出顺序是极性小的先流出 是极性小的先流出， 流出顺序是极性小的先流出，极 性大的后流出。 性大的后流出。 反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性， 反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性， 它适用于非极性化合物的分离， 它适用于非极性化合物的分离， 其流出顺序与正相色谱恰好相反