麻痹性贝类毒素GTX2_3单克隆抗体在直接竞争ELISA检测方法中的应用

２． ３ ＧＴＸ２， ３ 单克隆抗体与 Ｃ２ 毒素的交叉反应 经 直 接 竞 争 ＥＬＩＳＡ 检 测 ， ＧＴＸ２， ３ 对 ＧＴＸ２， ３－
ＨＲＰ 结合 ＧＴＸ２， ３ 单克隆抗体的抑制作用呈剂量相 关 ， 而 相 同 浓 度 的 Ｃ２ 毒 素 对 ＧＴＸ２ ， ３－ＨＲＰ 结 合 ＧＴＸ２， ３ 单克隆抗体无明显的抑制作用， 见图 ３。表 明 ＧＴＸ２， ３ 单抗与 Ｃ２ 毒素无交叉反应， 该方法具有 良好的特异性。
分别用不同浓度的 ＧＴＸ２， ３ 毒素和 Ｃ２ 毒素 作 为直接竞争 ＥＬＩＳＡ 竞争剂， 检测 ＧＴＸ２， ３ 单抗与 Ｃ２ 毒素之间的交叉反应。
２． 结果 ２． １ ＧＴＸ２， ３－ＨＲＰ 偶联物的鉴定及工作浓度的确 定
经 直 接 ＥＬＩＳＡ 方 法 检 测 ， ＧＴＸ２， ３－ＨＲＰ 偶 联 物 能够与 ＧＴＸ２， ３ 单克隆抗体结合， 而 ＨＲＰ 不能与该 抗体结合， 见图 １， 表明 ＧＴＸ２， ３ 与 ＨＲＰ 偶联成功。 偶联物的工作浓度为 １ ∶３０。
０．７ ０．６ ０．５ ０．４ ０．３
０．２ ０．１
０ － １．０４－ ０．７４－ ０．４４
ｌｏｇ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒ ａｔｉｏｎ
ＧＴＸ２， ３ Ｃ２ ｔｏｘｉｎ
图 ３ ＧＴＸ２， ３ 单克隆抗体与 Ｃ２ 毒素的交叉反应 Ｆｉｇ ３． Ｃｒ ｏｓｓ－ｒ ｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ２ ｔｏｘｉｎ ｗｉｔｈ ＭｃＡｂ ａｇａｉｎｓｔ ＧＴＸ２， ３
罗辉武 １， ２ 向军俭 ２
【 摘要 】 目的 利用麻痹性贝类毒素 ＧＴＸ２， ３ 单克隆抗体建立麻痹性贝类毒素 ＧＴＸ２， ３ 直接竞争 ＥＬＩＳＡ（ ｄｃ－ＥＬＩＳＡ） 检测 方法。方法 通过过氧化反应将 ＧＴＸ２， ３ 与辣根过氧化物酶（ ＨＲＰ） 偶联。以兔抗小鼠 ＩｇＧ 多抗为包被抗体， ＧＴＸ２， ３ 为竞争剂， 与 ＧＴＸ２， ３－ＨＲＰ 竞争结合 ＧＴＸ２， ３ 单克隆抗体， 初 步 建 立 检 测 麻 痹 性 贝 类 毒 素 ＧＴＸ２， ３ 的 ｄｃ－ＥＬＩＳＡ， 并 用 该 方 法 检 测 ＧＴＸ２， ３ 单克隆抗体与 Ｃ２ 毒素之间的交叉反应。结果 直接 ＥＬＩＳＡ 检测证实 ＧＴＸ２， ３ 与 ＨＲＰ 偶联成功。ｄｃ－ＥＬＩＳＡ 检测麻痹性贝类毒素 ＧＴＸ２， ３ 的灵敏度为 １． ５ μｇ ／ ｍｌ， 工作范围为 １． ５ ～４０ μｇ ／ ｍｌ， ＧＴＸ２， ３ 毒素与 Ｃ２ 毒素无交叉反应。该方法具有良好的特异性。 结论 ｄｃ－ＥＬＩＳＡ 适用于麻痹性贝类毒素的快速检测。
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒ ａｔ （ｅ ％）
９０
８０ ７０ ６０
５０
４０
３０
２０
１０
０
５０
６０
Ｔｏｘｉｎ（ μｇ ／ ｍｌ）
图 ２ ＧＴＸ２， ３ 毒 素 对 ＧＴＸ２， ３－ＨＲＰ 结 合 抗 体 的 抑 制 作用
Ｆｉｇ ２． Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＧＴＸ２， ３－ＨＲＰ ｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＧＴＸ２， ３－ＨＲＰ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ
【Ａｂｓｔｒ ａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ（ ｄｃ－ＥＬＩＳＡ） ｆｏｒ ｐａｒａｌｙｔｉｃ ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ（ ＰＳＰ） ＧＴＸ２，３ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＭｃＡｂ ａｇａｉｎｓｔ ＧＴＸ２，３． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｏｕｐｌｅ ＧＴＸ２，３ ｗｉｔｈ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ （ ＨＲＰ） ｂｙ ｐｅｒｏｘｉｄｉｚｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｄｃ－ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ＧＴＸ２，３ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｕｓｉｎｇ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＰｃＡｂ ａｓ ｃｏａｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ＧＴＸ２，３ ａｓ ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ ｏｆ ＧＴＸ２，３－ＨＲＰ ｉｎ ｂｉｎｄ－ ｉｎｇ ｔｏ ＭｃＡｂ ａｇａｉｎｓｔ ＧＴＸ２，３． Ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭｃＡｂ ａｇａｉｎｓｔ ＧＴＸ２，３ ｗｉｔｈ Ｃ２ ｔｏｘｉｎ ｂｙ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｄｃ－ＥＬＩＳＡ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ＧＴＸ２，３ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ＨＲＰ． Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｄｃ－ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ＧＴＸ２，３ ｗｅｒｅ １．５ ａｎｄ １．５ ～４０ μｇ ／ ｍｌ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ＭｃＡｂ ａｇａｉｎｓｔ ＧＴＸ２，３ ｓｈｏｗｅｄ ｎｏ ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｃ２ ｔｏｘｉｎ． Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌ－ ｏｐｅｄ ｄｃ－ＥＬＩＳＡ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｄｃ－ＥＬＩＳＡ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＳＰ．
常 见 的 有 石 哈 房 毒 素 和 磺 酰 氨 甲 基 毒 素（ 如 Ｃ２ 毒 素） 等。我国南方沿海染毒贝类和有毒赤潮藻中常见 的 ＰＳＰ 是膝沟藻毒素 ＧＴＸ２， ３［ ５］ 。对于 ＰＳＰ 的免疫 学快速检测， 国外已有报道［ ６］ ， 也有相关的商品化 免疫学快速检测试剂盒上市。国外试剂盒价格昂贵， 且由于毒素种类的差异， 也不适合在我国大规模推 广， 而国内对于这方面的研究报道甚少。本文研究了 自制 ＧＴＸ２， ３ 单克隆抗体在直接竞争 ＥＬＩＳＡ 快速检 测 方 法 中 的 应 用 ， 并 初 步 建 立 了 ＧＴＸ２， ３ 的 ＥＬＩＳＡ 快速检测方法， 现将结果报道如下。
１． 材料与方法 １． １ 试剂
膝沟藻毒素 ＧＴＸ２， ３ 和 Ｃ２ 毒素 由 香 港 科 技 大 学 Ｈｓｉｅｈ 教 授 惠 赠 ； 辣 根 过 氧 化 物 酶（ ＨＲＰ） 为 Ａｍ－ ｒｅｓｃｏ 公司产品； 腹水型 ＧＴＸ２， ３ 单克隆抗体和兔抗 小鼠 ＩｇＧ 为暨南大学生命科学与技术学院分子免疫 学与抗体工程研究中心制备； 其余试剂均为分析纯。
基金项目： 国家自然科学基金项目（ ４０３７６０３０） ； 广州市科技 局 项 目（ ２００Ｊ－００４．０１） ．
作者单位： １ 惠州学院生命科学系（ 惠州 ５１６００７） ； ２ 暨南大学 生 命科学与技术学院（ 广州 ５１０６３２） ．
通讯作者： 罗辉武， Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｈｗ＠ｈｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
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中国生物制品学杂志 ２００８ 年 ８ 月第 ２１ 卷第 ８ 期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ａｕｇｕｓｔ ２００８， Ｖｏｌ． ２１ Ｎｏ． ８
Ａ４９２ Ａ４９２
－ ０．１４ ０．１８ ０．４８ ０．７８ １．０８ １．３８ １．６８
１． ２ ＧＴＸ２， ３ 与 ＨＲＰ 偶联物的制备 参照 Ｍｉｃｈｅｌｉ 等［ ７］ 的方法进行。反应完成后， 于
中国生物制品学杂志 ２００８ 年 ８ 月第 ２１ 卷第 ８ 期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ａｕｇｕｓｔ ２００８， Ｖｏｌ． ２１ Ｎｏ． ８
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中国图书分类号 Ｒ３９２－３３ 文献标识码 Ａ 文章编号 １００４－５５０３（ ２００８） ０８－０７１７－０３
【实验技术】
麻痹性贝类毒素 ＧＴＸ２， ３ 单克隆抗体在直接竞争 ＥＬＩＳＡ 检测方法中的 应用
２． ２ 直接竞争 ＥＬＩＳＡ 试验 用系 列 稀 释 的 ＧＴＸ２， ３ 毒 素 作 为 竞 争 剂 时 ， 其
对 ＧＴＸ２， ３－ＨＲＰ 结合到固相 ＧＴＸ２， ３ 单克隆抗体上 的抑制作用随着毒素浓度的增加而逐渐增强， 抑制 曲线见图 ２， 方程为 ｙ ＝ ０． １８５ Ｉｎｘ ＋ ０． １２５。当抑制 率为 ２０％ 时， 毒素浓度为 １． ５ μｇ ／ ｍｌ； 抑制率为 ８０％ 时， 毒素浓度为 ４０ μｇ ／ ｍｌ。因此该检测方法的灵敏 度为 １． ５ μｇ ／ ｍｌ， 工作范围为 １． ５ ～４０ μｇ ／ ｍｌ。
【Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ】 Ｐａｒａｌｙｔｉｃ ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ； ＧＴＸ２，３； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ； Ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ
麻痹性贝类毒 素 （ Ｐａｒａｌｙｔｉｃ ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ， ＰＳＰ） 主要由海洋赤潮藻中的亚力山大藻等产生， 是 最常见的赤潮毒素之一。ＰＳＰ 具有极强的神经毒性， 其作用机制为阻断细胞钠离子通道， 引起细胞膜内 外正常离子的流动失衡， 造成膜电位反常， 使人出现 眩晕、休克等神经中毒症状［ １］ 。ＰＳＰ 的化学结构类似 于具有两个胍基的嘌呤核， 属非蛋白质毒素， 在酸 性条件下稳定， 且不被人的消化酶所破坏［ ２］ 。ＰＳＰ 在 紫外线范围内不吸收， 其 ｐＫａ 值在 ８． ５ ～１１． ２ 之间， 旋光度约为 ＋ １３０［ ３］ 。当人类食入含有该类毒素的 食物时， 就会造成神经麻痹、呼吸困难甚至死亡。我 国是一个赤潮灾害多发的国家， 南北海区均存在可 产生麻痹性贝类毒素的赤潮藻， 且在多个采样点发 现多种贝类含有麻痹性贝类毒素［ ４］ 。ＰＳＰ 种类繁多，
分别将 ５０ μｌ １ ∶１００ 稀释的 ＧＴＸ２， ３ 单克隆抗 体、不同浓度的 ＧＴＸ２， ３ 毒素和适当稀释的 ＧＴＸ２， ３－ ＨＲＰ 偶联物混合， ３７℃ 反应 １ ｈ， 再将混合液加入到 用适当稀释的兔抗小鼠 ＩｇＧ 多抗包被的酶标板中， ３７℃保温 ０． ５ ｈ， 洗板 ３ 次， 测定 Ａ４９２ 值。以抑制率为 ２０％ 时的 ＧＴＸ２， ３ 毒素的浓度作为该检测方法的灵 敏度， 抑制率为 ２０％ ～８０％范围内的毒素浓度作为 该检测方法的工作范围。 １． ５ ＧＴＸ２， ３单抗与 Ｃ２ 毒素的交叉反应检测
３． 讨论 ＧＴＸ２， ３ 是小分子， 不能直接吸附于聚苯乙烯或