水稻愈伤组织的诱导
一、请教关于水稻愈伤组织的问题
组培常见英汉对照abortion（败育）adenine（腺嘌呤）agar （琼脂）anther（花粉）apical（顶端的）aseptic(无菌的) auxin（生长素）axillary bud （腋芽）callus，calli（愈伤组织）cellular totipotency（细胞全能性）cellulase（纤维素酶）cellulose（纤维素）centrifuge（离心）chloroplast（叶绿体）chromosome doubling（染色体加倍）colony（细胞团，菌落）cybrid（cytoplasmic hybrid,胞质杂种）cytokinin（细胞分裂素）cytoplasm（细胞质）degeneration （败育）dedifferentiation （脱分化）redifferentiation（再分化）dicotyledonous（双子叶的）dihaploid（二单倍体）diploid （二倍体）dissect（剥离）dormancy（休眠）eliminate （除去）embryo（胚胎）embryoid（胚状体）embryogenesis（胚胎发生方式）epidermis（表皮，上表皮）excise（切除）explant （外植体）filter paper（滤纸）gelose（琼脂糖）genetype（基因型）germplasm（种质）global embryo （球型胚）haploid（单倍体）heterokaryon（异核体）homozygous（纯合的）hormone （激素）interspecific（种间的）intraspecific（种内的）in vitro（体外）in vivo（活体）kinetin（激动素）macerozyme（离析酶）male sterile（雄性不育）medium（培养基）membrane（膜）meristem（分生组织）meristem culture（茎尖培养）micropropagation（微繁）microspore（小孢子）monocotyledon/moncots（单子叶植物）nod culture （茎段培养）organelle（细胞器）organgenesis（器官发生方式）osmotic（渗透的）pith（髓）plantlet（小植株，苗）pollen culture （花粉培养）pollinate（授粉）protocorm（PLB）原球茎protoplast fusion（原生质体融合）rapid propagation（快繁）regeneration（再生）self-incompatibility （自交不亲和）shoot tip（茎尖）sodium hypochlorite（NaClO）somatic embryo（体细胞胚）somatic hybridization（体细胞杂交）somatic hybrid（体细胞杂种）stem（茎）stem tip culture（茎尖培养）sterilant（消毒剂）sterile distilled water（蒸馏水）sterilization（消毒）stock plant （母株）subculture (继代) sucrose（蔗糖）terminal bud（顶芽）transfer （转移）virus eradication（脱毒）常用缩略语ABA（脱落酸）CM（椰子汁）CPW（细胞-原生质体清洗液）DMSO（二甲基亚砜）IAA（吲哚乙酸）IBA（吲哚丁酸）KT（激动素）NAA（萘乙酸）PEG（聚乙二醇）LH（液氮）CH（水解酪蛋白）GA3（赤霉素）一、请教关于水稻愈伤组织的问题:我的水稻愈伤组织经过转化后，基本上不分化，听说TDZ能帮助分化，请问是用TDZ完全代替KT，还是按一定比例加入？还有就是在分化过程中还需要再加入潮霉素和羧苄吗？我用的水稻品系是台北309，以前的分化培养基为MS+0.5/l谷氨酰胺+0.5g/l脯氨酸+0.3g/l水解酪蛋白+2mg/l KT+0.5mg/l 6BA+0.2mg/l NAA+300MG/L羧苄+50MG/L潮霉素。
水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻愈伤组织的诱导实验报告实验目的：本实验旨在探究水稻愈伤组织的诱导方法，为将来的水稻遗传改造研究提供参考。
实验材料和仪器：1. 材料：水稻种子、MS培养基、植物生长调节剂2,4-D、生长调节剂TDZ、无菌器具、琼脂、无菌操作室。
2. 仪器：无菌操作台、显微镜、实验室平衡器等。
实验步骤：1. 生物材料准备：选取幼苗期生长良好、品种鲜明的水稻种子作为材料。
将水稻种子进行表面消毒，处理方法为分别用70%的酒精和5%的次氯酸钠(1:1)混合消毒3-5分钟，然后充分清洗。
2. 建立组织培养体系：将消毒后的水稻种子在无菌操作台上进行分离培养。
将种子取出后，从胚乳中取出胚轴，用剪刀消毒后放入含有MS培养基的无菌培养瓶中，置于无菌操作室中进行培养。
在35-37°C下连续培养3-5天。
3. 筛选愈伤组织：将培养2-3天的胚轴等植物试管苗等组织放置在含有不同浓度的2,4-D和TDZ的培养基中，培养10-15天。
筛选出生长具有愈伤能力的组织，采用显微镜等方法进行观察，并进行相应的分离和培养。
4. 愈伤组织的维持和复壮：将筛选出的愈伤组织维持在含有2,4-D和TDZ的培养基中，定期进行转移或分离。
当愈伤组织增生至一定程度后，将其转移到不含激素的培养基中，进行复壮。
实验结果：在实验过程中，我们选择了4个不同浓度的2,4-D和TDZ进行培养，筛选出了愈伤组织，并进行了维持、修复工作。
经过5次转移和增殖培养，我们成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。
结论：本实验采用的方法可行，成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。
本研究为今后的水稻遗传改造和抗性育种提供了良好的基础。
日本晴水稻悬浮细胞系
配方：N6D培养基液体培养基：NB + 蔗糖(3％) + 2，4-D (2 mg/L)；预处理溶液：NB + 脱落酸(0.26µg / L) + 脯氨酸(10％) + 蔗糖(10％) + 二甲基亚砜(10％)；冷冻保护剂：二甲基亚砜(10％) + 聚乙二醇(10％) + 蔗糖(10％)方法：1 愈伤组织诱导1.1 种子消毒75%酒精洗种子10s；用无菌水清洗种子3次；加50% 次氯酸钠（没过种子），和1ml 吐温，摇晃10min，倒掉废液，用无菌水洗3~6次；在超净台里，加50% 次氯酸钠摇10min，用灭菌水洗5次，至水清澈为止。
1.2 摆米将洗好的种子用勺子捞起，放到无菌的滤纸上，用镊子将米摆到N6D培养基上，用封口膜封好。
1.3 愈伤的获得一段时间后，种子的一侧有一个白色的芽冒出，那是下胚轴。
同时，我们将会看到在下胚轴的根部有一个白色的不透明的团块，用镊子将其剥离，放到新的N6培养基上。
每次选择那些颜色鲜黄或乳白、表面有光泽、用镊子轻触感觉特别松软，对比之下生长速度快的愈伤组织进行继代培养。
2 悬浮细胞系的建立2.1 细胞悬浮培养150 mL的三角瓶中加入50 mL液体培养基，用镊子将好的愈伤块破碎后加入三角瓶内，每瓶大约加新鲜的愈伤组织10 g左右，放人摇床中暗培养。
摇床速度为110~130 r·min，温度设置为(26+1)℃。
在细胞悬浮培养的初期，继代周期为3~5 d 继代1次，1个月后10 d 继代1次。
大约2个月后，悬浮细胞进入旺盛生长阶段。
2.1 继代方法将要继代的装有悬浮细胞系的三角瓶放在超净台上静止几分钟，然后轻轻向下倾斜瓶口将里面的液体倒掉大约整个液体体积的3/4。
最后，加入和倒掉液体体积相等的新鲜的液体培养基即可。
注意，在操作过程中，要在倒掉液体前和封口前将瓶口和瓶颈用酒精火焰灭菌。
2.3 理想悬浮细胞系的获得悬浮细胞开始稳定生长后，当三角瓶(150 mL)中的悬浮细胞已经繁殖到原来的几倍以上时，将速度调为150 r/min，继续进行悬浮培养。
水稻愈伤转化
水稻愈伤组织转化一、实验目的1.掌握植物组织培养的基本原理；2.学习水稻愈伤组织的诱导方法；3.学习农杆菌转化法的原理，掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法；4.学习转基因植株的各种鉴定方法（包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH等），同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。
二、实验原理1.植物组织培养植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等，在人工控制的培养基上培养，使其生长、分化以及形成完整植株的技术。
自1902年Haberlandt 首先用紫鸭跖草( Tradescantia )的叶片栅栏组织进行培养来，植物组织培养已有100余年历史。
用于离体培养的各种植物材料称为外植体（explant）。
根据外植体的类型，又可将组织培养分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。
（从这个角度讲，本学期的实验属于胚胎培养。
）植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。
2.基因工程基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。
这种利用基因工程技术获得的植物一般称为“基因工程植物”。
自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，成功进行转基因的植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例，有些转基因产品已进入市场。
通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。
3.农杆菌转化法转基因的方法有很多，对于植物而言，最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。
农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌，其内含Ti质粒：T-DNA（Transferre DNA）区：农杆菌Ti 质粒中向植物中转移并整合进植物基因组中的部分。
水稻愈伤组织培养
水稻愈伤组织的诱导李希北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与技术系，北京，100083摘要：以水稻种子为外植体，研究了外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过程。
结果表明水稻种子接种在诱导培养基上两天已产生愈伤组织发芽2mm，四天愈伤组织呈现浅黄色发芽5-10mm，6天愈伤组织颜色加深发芽1-2cm，8天愈伤组织为橙黄色发芽2-3cm，无杂菌污染。
关键词：水稻种子外植体诱导愈伤组织引言自Niizeki和Oono1968年首次获得水稻花粉植株以来，水稻组织培养取得了很大的进展，如各种水稻品种愈伤组织的诱导、继代、植株再生培养基的筛选，遗传特性，基因工程转化体系的建立等等。
水稻种子愈伤组织的诱导是这些研究的基础，因此掌握外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过程至关重要。
以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。
外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。
对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用。
本次试验使用的诱导剂为2,4-D，诱导率为100%。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1实验材料水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；1.1.2仪器设备及用具超净工作台培养室、培养皿：￠9cm×2枪形镊量筒：100mL×2三角瓶：50mL×2(无菌)；废液缸；保鲜膜；标签纸1.1.3试剂及培养基试剂：75%酒精，2%NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)培养基：诱导培养基：MS+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8）1.2 实验方法1.2.1 MS固体培养基配制：由于实验室中的MS培养基已含有蔗糖和琼脂，所以直接按照41.5g/L的浓度配置。
实验中配置50ml培养基，需依次加入2.075gMS，0.1mg2,4-D；用NaOH或HCl调节PH=5.8；高压蒸汽锅121℃灭菌20min。
不同培养基对水稻胚性愈伤组织诱导及分化的影响
表 1 不同水稻品种在不同培养基上出愈率的比较 Tab le 1 R ice callus indu ct ion rate in d ifferent m edia
基本 培养基 NB MS LS 龙特普 接种数 愈伤数 出愈率 标准差 442 211 236 414 203 220 93 6 % 0 001062 96 2 % 0 001551 93 2 % 0 008269 日本晴 接种数 愈伤数 出愈率 标准差 228 236 253 206 191 220 90 2 % 0 008181 80 9 % 0 012366 80 7 % 0 027029
1 , 2 2 2 2 2
植物基因工程 及分 子生物 学技术 的发 展, 为 作物 遗传育种 开辟 了一 条崭 新的 途径。水 稻 ( O ryza sa tiva L. )是世界上最重要的粮食作物之一, 培育优质高产抗 逆的 水稻品 种是育种 学家的 追求, 遗 传转化技 术为实 现这一愿望提供了可能性。水稻遗传转化的 基础是获 得优 良的水 稻愈伤组 织, 愈伤 组织状 态直接决 定了遗 传转化的效率。 水稻愈伤组织的诱导, 常用的外植体 是未成熟胚、 原生质体和成熟胚。由未成熟胚获得的愈伤 组织绿苗 分化 率高, 但 由于未 成熟胚材 料来源 受时间和 空间上 的限制, 消弱了它的实用性; 以原生质体作为 水稻遗传 转化的受体, 转 化效率 较高, 但 培养 过程比 较繁 琐, 且 培养周期长; 而以成熟胚诱导胚性愈伤, 不受 时间和季
收稿日期 : 2010- 11- 25 ; 修回日期 : 2010- 12- 24
节限制, 且操作简便, 但不同的水稻品种的愈 伤诱导率 有很 大差异, 因此提高 主要栽 培品种成 熟胚的 培养力 和植株再生能力是一项关键因素。 在基本培养基方面, 朱根发 等认 为, N 6- M S 培养 基交替继代能使粳稻愈 伤组织 分化能力 提高 。植 物组织培养中, 影响培养力的因素是多方面 的, 而植物 激素是愈伤 组织 诱导 和绿 苗分 化的 关键 性 因素
水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻愈伤组织的诱导实验报告
实验目的：
通过诱导方法获取水稻愈伤组织，为后续的基因转化等实验打下基础。
实验材料和设备：
水稻种子、MS培养基、2,4-D溶液、NaClO溶液、无菌操作
器材、显微镜等。
实验步骤：
1.种子消毒：将水稻种子放入1% NaClO溶液中浸泡10分钟，再用去离子水洗净后，放进无菌操作室中。
2.种子发芽：将消毒后的种子放进含有营养的MS培养基中，
在25℃下进行光照培育。
3.愈伤组织诱导：将发芽后的幼苗从培养基中取出，用无菌水
清洗。
将茎部和叶片等不同部位的组织嫁接在含有2,4-D溶液
的MS培养基上，培养在25℃下、光照下，观察诱导组织的
生长情况。
4.分离愈伤组织：当组织生长到一定大小后，用无菌操作器材
将组织用无菌剪刀分离下来。
5.愈伤组织培养：将分离出的愈伤组织放入含有NAA、BA、MS培养基中进行培养。
结果分析：
在诱导的茎部和叶片等不同部位，均出现了白色愈伤组织的诱导生长。
经过分离和培养，得到了纯化的愈伤组织。
通过显微镜观察发现，愈伤组织的细胞间隙变窄，胞间质增多，中心细胞数量增多，细胞核增大，一些细胞内的小器官也出现转化现象。
结论：
通过2,4-D溶液的诱导方法，可以在水稻幼苗的不同部位诱导出白色愈伤组织，愈伤组织的分离和培养也取得了成功。
实验结果为后续的基因转化、基因工程等实验提供了基础。
水稻成熟胚愈伤组织诱导及其植株再生
水稻成熟胚愈伤组织诱导及其植株再生
危晓薇;王冬梅;祖木热木·吐尔逊
【期刊名称】《新疆农业科学》
【年(卷),期】2007(044)006
【摘要】利用水稻成熟胚为外植体,接种在NB培养基上,分别附加不同的外源激素,以诱导愈伤组织并促其分化,最终获得水稻再生植株.结果表明:2,4-D对愈伤组织诱导起决定性作用,当它与低浓度的6-BA配比时更有利于前期愈伤组织的诱导,而高浓度的6-BA则有利于后期芽丛的分化.
【总页数】3页(P889-891)
【作者】危晓薇;王冬梅;祖木热木·吐尔逊
【作者单位】新疆农科院核生所,乌鲁木齐,830091;新疆农科院核生所,乌鲁木齐,830091;新疆农科院核生所,乌鲁木齐,830091
【正文语种】中文
【中图分类】S511
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水稻愈伤组织的诱导
一、目的
掌握外植体的消毒方法和接种技术；了解愈伤组织诱导的过程。
二、原理
以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。
愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。
外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。
对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。
三、实验材料
水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；
四、仪器设备及用具
超净工作台培养室、培养皿：￠9cm×2 枪形镊量筒：100mL×2 三角瓶：50mL×2(无菌)；废液缸；保鲜膜；标签纸
五、试剂及培养基
（一）试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)
(二) 培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8）
六、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒
用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。
之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。
2、种子去壳
选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备30粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。
3、操作者双手的清洗与消毒
在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并凉干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进
行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。
（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！）
4、超净台面的表明消毒（以下工作在超净工作台内进行）
用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。
5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一50mL 无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO ，不时摇动搅拌，共处理30分钟→弃NaCLO →用无菌水洗3次，每次停留1分钟→倒去无菌水，将种子从三角瓶转到带无菌滤纸的无菌培养皿中吸干。
6、接种与观察
将吸干的消毒种子用无菌的镊子接入培养基并均匀放置，每皿接10粒，每人共接种2皿。
接种完成后，将培养皿盖上并用保鲜膜封口，然后将接种有材料的培养皿移出超净台，贴上标签写明日期、接种人，按照班级统一放入一篮子，再将篮子放入培养室进行25℃暗培养。
注意每隔2-3天前来观察一次实验现象，1周后调查计算污染率，14天后调查计算愈伤组织诱导率。
七、结果与分析 1．本实验出现污染的原因分析，以及考虑如何降低实验中的污染率问题？
2．分析愈伤组织的诱导形成与哪些因素有关？
联系人：
1069068246@,755382261@,529791301@,407886041@qq.co m,1075902065@,1013536001@ ×100%
形成愈伤组织的种子数
污染率(%)= ×100% 污染的种子数 接种的总种子数
诱导率 (%)= 接种的总种子数。