水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻转基因实验方法与步骤
水稻转基因实验操作方法步骤一、水稻愈伤组织的诱导（一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天；3）继代培养。
用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。
（二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将适量种子放入10ml离心管中（100颗左右），倒入75%酒精消毒2分钟；2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5-6遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗；2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，暗培养培养3周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状，去除种子和芽），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周（2周愈伤组织更为松散）。
（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周）二、农杆菌培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100µl于4ml YEP（含50mg/lKan和50mg/l Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0（颜色接近橙黄色）。
水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻愈伤组织的诱导实验报告实验目的：本实验旨在探究水稻愈伤组织的诱导方法，为将来的水稻遗传改造研究提供参考。
实验材料和仪器：1. 材料：水稻种子、MS培养基、植物生长调节剂2,4-D、生长调节剂TDZ、无菌器具、琼脂、无菌操作室。
2. 仪器：无菌操作台、显微镜、实验室平衡器等。
实验步骤：1. 生物材料准备：选取幼苗期生长良好、品种鲜明的水稻种子作为材料。
将水稻种子进行表面消毒，处理方法为分别用70%的酒精和5%的次氯酸钠(1:1)混合消毒3-5分钟，然后充分清洗。
2. 建立组织培养体系：将消毒后的水稻种子在无菌操作台上进行分离培养。
将种子取出后，从胚乳中取出胚轴，用剪刀消毒后放入含有MS培养基的无菌培养瓶中，置于无菌操作室中进行培养。
在35-37°C下连续培养3-5天。
3. 筛选愈伤组织：将培养2-3天的胚轴等植物试管苗等组织放置在含有不同浓度的2,4-D和TDZ的培养基中，培养10-15天。
筛选出生长具有愈伤能力的组织，采用显微镜等方法进行观察，并进行相应的分离和培养。
4. 愈伤组织的维持和复壮：将筛选出的愈伤组织维持在含有2,4-D和TDZ的培养基中，定期进行转移或分离。
当愈伤组织增生至一定程度后，将其转移到不含激素的培养基中，进行复壮。
实验结果：在实验过程中，我们选择了4个不同浓度的2,4-D和TDZ进行培养，筛选出了愈伤组织，并进行了维持、修复工作。
经过5次转移和增殖培养，我们成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。
结论：本实验采用的方法可行，成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。
本研究为今后的水稻遗传改造和抗性育种提供了良好的基础。
愈伤组织制作实验
摘要水稻成熟种子具有细胞全能性。
本实验以错误!未找到引用源。
+2,4-D为基本培养基，添加NAA和6-BA为分化培养基，对水稻种子材料进行体外培养，诱导形成愈伤组织，并进行分化。
在培养基中添加一定量的激素给种子形成愈伤组织提供动力。
结果表明，在合适的培养条件下愈伤组织的分化程度很高，但培养基因素或光照条件使得褐化现象严重。
关键词水稻成熟种子组织培养愈伤组织诱导分化激素1前言细胞工程是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。
其常用技术手段有植物组织培养，植物体细胞杂交、动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等。
根据细胞类型的不同，可以把细胞工程分为植物细胞工程和动物细胞工程两大类。
本实验主要综述细胞工程中植物细胞工程的植物组织培养这一技术手段。
植物组织培养技术的应用范围包括快速繁殖、培育无病毒植物，通过大规模的植物细胞培养来生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等。
植物组织培养，诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织在分化形成植物体。
在植物组织培养中，由于植物细胞具有全能性，即植物的体细胞具有母体植株全部遗传信息并会发育成为完整的个体。
因而，每一个植物细胞可以像胚胎细胞一样，经离体培养再生成为植株。
随着细胞工程技术的不断发展，植物细胞和组织培养这一细胞工程技术也无例外地得到发展，目前已在许多植物上，特别是在农林生产实践中得到了广泛应用。
尤其在林木优良品种和无性系的快速繁殖方面进展较快。
本实验旨在利用NAA和6-BA的组合调控来诱导水稻成熟种子的愈伤组织，加深对外植体消毒、接种的无菌操作技术，学习外植体愈伤组织诱导的方法。
水稻愈伤转化
水稻愈伤组织转化一、实验目的1.掌握植物组织培养的基本原理；2.学习水稻愈伤组织的诱导方法；3.学习农杆菌转化法的原理，掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法；4.学习转基因植株的各种鉴定方法（包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH等），同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。
二、实验原理1.植物组织培养植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等，在人工控制的培养基上培养，使其生长、分化以及形成完整植株的技术。
自1902年Haberlandt 首先用紫鸭跖草( Tradescantia )的叶片栅栏组织进行培养来，植物组织培养已有100余年历史。
用于离体培养的各种植物材料称为外植体（explant）。
根据外植体的类型，又可将组织培养分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。
（从这个角度讲，本学期的实验属于胚胎培养。
）植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。
2.基因工程基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。
这种利用基因工程技术获得的植物一般称为“基因工程植物”。
自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，成功进行转基因的植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例，有些转基因产品已进入市场。
通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。
3.农杆菌转化法转基因的方法有很多，对于植物而言，最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。
农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌，其内含Ti质粒：T-DNA（Transferre DNA）区：农杆菌Ti 质粒中向植物中转移并整合进植物基因组中的部分。
水稻愈伤组织培养
水稻愈伤组织的诱导李希北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与技术系，北京，100083摘要：以水稻种子为外植体，研究了外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过程。
结果表明水稻种子接种在诱导培养基上两天已产生愈伤组织发芽2mm，四天愈伤组织呈现浅黄色发芽5-10mm，6天愈伤组织颜色加深发芽1-2cm，8天愈伤组织为橙黄色发芽2-3cm，无杂菌污染。
关键词：水稻种子外植体诱导愈伤组织引言自Niizeki和Oono1968年首次获得水稻花粉植株以来，水稻组织培养取得了很大的进展，如各种水稻品种愈伤组织的诱导、继代、植株再生培养基的筛选，遗传特性，基因工程转化体系的建立等等。
水稻种子愈伤组织的诱导是这些研究的基础，因此掌握外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过程至关重要。
以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。
外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。
对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用。
本次试验使用的诱导剂为2,4-D，诱导率为100%。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1实验材料水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；1.1.2仪器设备及用具超净工作台培养室、培养皿：￠9cm×2枪形镊量筒：100mL×2三角瓶：50mL×2(无菌)；废液缸；保鲜膜；标签纸1.1.3试剂及培养基试剂：75%酒精，2%NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)培养基：诱导培养基：MS+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8）1.2 实验方法1.2.1 MS固体培养基配制：由于实验室中的MS培养基已含有蔗糖和琼脂，所以直接按照41.5g/L的浓度配置。
实验中配置50ml培养基，需依次加入2.075gMS，0.1mg2,4-D；用NaOH或HCl调节PH=5.8；高压蒸汽锅121℃灭菌20min。
水稻成熟胚愈伤组织诱导及其植株再生
ｅ ｒ ｏ ｎ ｒ ｅ ａ ｘ ｌｎｓ ａ ｄ ｒｇ ｎ ｒｔ ｎ ｐａ ｔ ｗ ｒ ｂ ａｎ ｄ ｓ ｃ ｅ ｓ ｌ ．Ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｈ ｗ ｄ ｔａ ｍｂ ｓｉ ｉ ｓｅ ｐａ ｔ， ｎ ｅ ｅ ｅ ａ ｏ ｌ ｓ ｅ ｅ ｏ ｔ ｅ ｕ ｃ ｓｆ ｌ ｈ ｅ ｕｔ ｓ ｏ ｅ ｔ ｙ ｃ ｉ ｎ ｉ ｕｙ ｓ ｈ ２，水稻基 因工程 的基 础技术 ， 在水 稻遗传 改 良中具 有重要 的作 用 。因此 ， 建
立一个高效再生体系是实现基 因转化 的先决条件。１ ５ ，ｍ ｍｙ 等开始水稻组织培养 ， ９ 年 Ａ ｅｉ ６ ａ 几十年来 ，
研究者先后从水稻各部位诱导出愈伤组织和再生植株。虽然 ， 幼穗、 幼胚、 花粉粒 、 花药愈伤组织诱导率 高， 愈伤组 织质 量好 而受 到青 睐被广泛 用于水 稻 的遗传 转 化 、 品种 培育 中。但 上述 材 料 多受 季 节 限 制 ，
关键词 ： 水稻 ； 成熟胚 ； 愈伤组织 ； 再生植株 中图分类号 ：５ １ ￥１ 文献标 识码 ： Ａ 文章编号 ：０ １ ３０ ２０ ）６ ８ ０ １０ —４３ （Ｏｒ ｏ —８９— ３ ７
ＣａｌｓＩ ｄ ｃｉｎ ａ ｄ Ｐ ａ ｔＲｅ ｅ ｅ ａｉ ｎ ｏ ａ ｕ ｅ Ｅｍｂ ｙ ｓｉ ｃ ｌ ｎ ｕ ｔ ｎ ｌｎ ｇ ｎ ｒ ｔ ｆＭ ｔ ｒ ｕ ｏ ｏ ｒ ｏ Ｒｉｅ ｎ
１２３ 生根培 养基 ．．
以 Ｍ 为基本培养基 ， Ｓ 蔗糖 ３ Ｌ ｐ ．。 Ｏ ／ ，Ｈ５８ ｇ
１ 材料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
供试材料为早锦 １ 、 田小町［ ８ 号 秋 ６］ ￣ 两个水稻品种。
１ ２ 方 法 ．
１２ １ 愈伤 组 织诱 导培 养基 ．．
诱导培养实验报告
一、实验目的1. 掌握植物组织培养的基本原理和操作技术。
2. 熟悉愈伤组织诱导培养的方法和过程。
3. 学习分析愈伤组织诱导培养过程中可能遇到的问题及解决方法。
二、实验原理植物组织培养技术是利用植物细胞的全能性，将植物的器官、组织或细胞在人工控制条件下，通过脱分化、再分化等过程，培育成完整的植株或具有经济价值的生物材料。
愈伤组织是植物组织培养过程中的一种中间产物，是植物细胞脱分化、再分化过程中的一种重要阶段。
三、实验材料与试剂1. 材料：水稻种子、无菌水、无菌滤纸、剪刀、镊子等。
2. 试剂：1/2MS培养基、蔗糖、琼脂、活性炭、氯化钙、2,4-D、NAA、6-BA等。
四、实验方法与步骤1. 种子表面消毒（1）将水稻种子放入无菌水中浸泡30分钟；（2）用无菌滤纸吸干种子表面的水分；（3）将种子放入含有1%氯化钙溶液中浸泡10分钟；（4）用无菌水冲洗3次，每次1分钟；（5）将种子放入含有70%乙醇的溶液中浸泡30秒；（6）用无菌水冲洗3次，每次1分钟；（7）将种子放入含有1%次氯酸钠溶液中浸泡10分钟；（8）用无菌水冲洗5次，每次2分钟。
2. 外植体接种（1）将消毒后的种子放入含有1/2MS培养基的培养皿中；（2）用无菌镊子将种子均匀分布在培养皿底部；（3）用无菌滤纸覆盖种子，保持培养皿内湿润；（4）将培养皿放入培养箱中，温度设置为25℃，光照时间为12小时/天。
3. 愈伤组织诱导（1）当外植体长出白色愈伤组织时，将愈伤组织转移到含有2,4-D 2 mg/L和NAA 1 mg/L的1/2MS培养基中；（2）将愈伤组织放入培养皿中，保持培养皿内湿润；（3）将培养皿放入培养箱中，温度设置为25℃，光照时间为12小时/天。
4. 愈伤组织继代培养（1）当愈伤组织生长到一定大小后，将其转移到含有2,4-D 1 mg/L和NAA 0.5 mg/L的1/2MS培养基中；（2）将愈伤组织放入培养皿中，保持培养皿内湿润；（3）将培养皿放入培养箱中，温度设置为25℃，光照时间为12小时/天。
愈伤组织制作实验
摘要水稻成熟种子具有细胞全能性。
本实验以错误!未找到引用源。
+2,4-D为基本培养基，添加NAA和6-BA为分化培养基，对水稻种子材料进行体外培养，诱导形成愈伤组织，并进行分化。
在培养基中添加一定量的激素给种子形成愈伤组织提供动力。
结果表明，在合适的培养条件下愈伤组织的分化程度很高，但培养基因素或光照条件使得褐化现象严重。
关键词水稻成熟种子组织培养愈伤组织诱导分化激素1前言细胞工程是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。
其常用技术手段有植物组织培养，植物体细胞杂交、动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等。
根据细胞类型的不同，可以把细胞工程分为植物细胞工程和动物细胞工程两大类。
本实验主要综述细胞工程中植物细胞工程的植物组织培养这一技术手段。
植物组织培养技术的应用范围包括快速繁殖、培育无病毒植物，通过大规模的植物细胞培养来生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等。
植物组织培养，诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织在分化形成植物体。
在植物组织培养中，由于植物细胞具有全能性，即植物的体细胞具有母体植株全部遗传信息并会发育成为完整的个体。
因而，每一个植物细胞可以像胚胎细胞一样，经离体培养再生成为植株。
随着细胞工程技术的不断发展，植物细胞和组织培养这一细胞工程技术也无例外地得到发展，目前已在许多植物上，特别是在农林生产实践中得到了广泛应用。
尤其在林木优良品种和无性系的快速繁殖方面进展较快。
本实验旨在利用NAA和6-BA的组合调控来诱导水稻成熟种子的愈伤组织，加深对外植体消毒、接种的无菌操作技术，学习外植体愈伤组织诱导的方法。
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水稻愈伤组织的诱导实验
报告
This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
水稻愈伤组织的诱导
一、实验目的
1、掌握外植体的消毒方法和接种技术；
2、了解愈伤组织诱导的过程。
二、实验原理
以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。
愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。
外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。
对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展着剂（吐温20）以增强消毒效果。
三、实验材料与用具
1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；
2、试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)；
3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（）；
4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（￠9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL）2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。
四、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒
用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。
之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。
2、种子去壳
选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备30粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。
3、操作者双手的清洗与消毒
在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。
（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！）
4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行）
用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。
5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作）
将脱谷壳米粒转到一50mL无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO，不时摇动搅拌，共处理30分
钟→弃NaCLO →用无菌水洗3次，每次停留1分钟→倒去无菌水，将种子从三角瓶转到带无菌滤纸的无菌培养皿中吸干。
6、接种与观察
将吸干的消毒种子用无菌的镊子接入培养基并均匀放置，每皿接10粒，每人共接种2皿。
接种完成后，将培养皿盖上并用保鲜膜封口，然后将接种有材料的培养皿移出超净台，贴上标签写明日期、接种人，按照班级统一放入一篮子，再将篮子放入培养室进行25℃暗培养。
注意每隔2-3天前来观察一次实验现象，1周后调查计算污染率，14天后调查计算愈伤组织诱导率。
五、实验结果 本次实验我组未出现被污染的种子，污染率均为0 。
说明实验过程中，我组成员操作规范，保证所接种的种子均不受到污染。
最后，我组的2个培养皿分别可以诱导出7和8株水稻苗，诱导率分别为70%和80% 。
六、 讨论与分析
1、 本实验出现污染的原因分析。
×100% 形成愈伤组织的种子数
污染率(%)= ×100% 污染的种子数 接种的总种子
诱导率 接种的总种子数
1）外植体消毒不彻底，表面有较多微生物残留；
2）实验用具如镊子等消毒不彻底，在操作过程中把微生物带到种子上，污染种子；
3）实验前，超净工作台没有充分消毒，台内（主要是空气中）还残留有较多微生物；
4）培养皿密封措施做得不好，致使培养期间有微生物进入到培养皿中，并生长繁殖。
2、降低实验中的污染率的方法。
1）外植体、实验用具、超净工作台均需彻底消毒；
2）做好密封措施；
3）操作时勿离酒精灯太远；
4）尽量缩短操作时间；
5）定时更换消毒液（75%酒精、2% NaCLO）。
3、分析与愈伤组织诱导形成有关的因素。
1）外植体的状态（分化的程度）；
2）诱导培养的环境（光线、水分、温度等）；
3）植物激素的作用。