水稻愈伤转化
提高水稻愈伤组织再生频率的研究
提高水稻愈伤组织再生频率的研究
水稻愈伤组织再生技术是一种常用的遗传转化技术，可用于基因工程及育种研究。
然而，水稻愈伤组织再生频率不稳定，成为限制其广泛应用的主要因素。
因此，研究提高水稻愈伤组织再生频率的方法对于促进水稻遗传转化技术的发展具有重要意义。
以下是一些可能有效的方法：
1.培养基优化：选择适宜的植物激素和营养物质组成，可以显著提高水稻愈伤组织的再生率。
2.制备高效再生诱导剂：添加适量的有机溶剂和蔗糖等成分，可以增强愈伤组织的再生能力。
3.细胞超微结构改变：通过电刺激、质膜通透剂等方法，改变细胞超微结构，使愈伤组织再生能力得到提高。
4.分子水平调控：通过细胞进程和信号途径的调控，可提高愈伤组织再生频率。
例如，通过转化适宜的基因，如MYB、PjLOX3和OsARF19等，可以显著提升水稻愈伤组织再生率。
总的来说，提高水稻愈伤组织再生频率的研究需要多种方法的综合应用，通过不同层次的调控，从整体上提高水稻愈伤组织再生能力，以推动水稻基因工程和育种研究的进展。
水稻转基因实验方法与步骤
水稻转基因实验操作方法步骤一、水稻愈伤组织的诱导（一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天；3）继代培养。
用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。
（二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将适量种子放入10ml离心管中（100颗左右），倒入75%酒精消毒2分钟；2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5-6遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗；2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，暗培养培养3周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状，去除种子和芽），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周（2周愈伤组织更为松散）。
（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周）二、农杆菌培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100µl于4ml YEP（含50mg/lKan和50mg/l Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0（颜色接近橙黄色）。
水稻转化方法
水稻转化方法1．愈伤组织的诱导选取成熟良好、饱满、无霉变的籼稻种子，用糙米机或人工方法去掉种子的内外粰，保留胚的完整性。
先用75%酒精消毒1 min，再浸泡于40% NaClO+0.1% Tween 20 溶液，并置于100 rpm的摇床上消毒30 min。
在超净工作台上，消毒后的去粰种子用无菌水洗涤5次以上，洗净后转移至装有无菌吸水纸的培养皿中吸干水分，再将去粰种子接种于诱导培养基中。
培养条件为32℃，持续光照（100 mole m-2 s-1）。
30天后即可得到较好的愈伤组织用于转化。
2．农杆菌的准备农杆菌选用水稻转化中常用的菌株Ag10。
将含有目的基因的表达载体通过电激转化法转入农杆菌Ag10，选取阳性菌株，再将阳性菌株划线于含合适抗生素的YEB固体平板培养基中，于28 ℃暗培养3天。
3天后，用接种针挑取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有100 mL AA 浸染培养基的150 mL灭菌三角瓶中，以此作为愈伤组织的农杆菌浸染液。
特别值得注意的是，农杆菌应充分分散，而且浓度不能太大（OD600=0.1），否则后续的脱菌效果不好。
3．愈伤组织和农杆菌的共培养挑取诱导30天并且生长良好的愈伤组织（长出的水稻芽与种子去掉）浸泡于装有100 mL 农杆菌浸染液的150 mL灭菌三角瓶中（在加入愈伤前，先加入150ml的AS,使AA液中AS的浓度为30mg/L），摇动5min。
同时，在共培养基平板上预先垫1张无菌滤纸，用1 mL 的AAM浸染培养基打湿，并除去气泡。
然后将浸染5 min后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于垫了滤纸的共培养基上于25℃黑暗培养3天。
4．农杆菌的洗脱将共培养3天后的愈伤组织置于250 mL锥形瓶中，先用无菌水洗涤4-5次，直至洗液清澈透明为止。
加入过滤灭菌的400 mg/L羧苄青霉素溶液适量，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min。
然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，再加入适量羧苄青霉素溶液，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min，然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，最后用无菌滤纸将愈伤组织吸干。
水稻愈伤组织褐化的机理及影响因素研究进展
基金项目上海市科技兴农项目（沪农科推字〔2021〕第1-3号）；安徽省科技重大专项（201903a06020011）。
作者简介吴浩然（1997—），男，安徽肥东人，助理农艺师，从事水稻遗传转化工作。
*通信作者收稿日期2022-06-09水稻愈伤组织褐化的机理及影响因素研究进展吴浩然张从合*王慧陈思黄艳玲杨力管昌红（安徽荃银高科种业股份有限公司/农业农村部杂交稻新品种创制重点实验室，安徽合肥230088）摘要在水稻愈伤诱导、愈伤继代等过程中，影响愈伤褐化因素较多，包括水稻基因型、培养条件、培养基成分以及继代时间等，且不同因素对愈伤褐化的影响程度不同。
本文简要概述了引起外植体和愈伤组织褐化的机理、褐化类型及引起褐化的因素，同时对其研究方向进行了展望，以期为植物组织培养提供参考。
关键词水稻；愈伤组织；基因型；褐化机理；抗氧化剂；多酚氧化酶中图分类号S511文献标识码A文章编号1007-5739（2023）05-0021-05DOI ：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.05.006开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：Research Progress on Browning Mechanism of Rice Callus and Its Affecting FactorsWU HaoranZHANG Conghe *WANG HuiCHEN SiHUANG YanlingYANG LiGUAN Changhong(Anhui Win-all Hi-tech Seed Co.,Ltd./National Key Laboratory for New Variety Development of Hybrid Rice of Ministry of Agriculture and Rural Affairs ，Hefei Anhui 230088)AbstractIn the process of rice callus induction and callus subculture,there are many factors affecting callusbrowning,including rice genotype,culture conditions,medium composition and subculture time,and different factors have different influence degrees on callus browning.In this paper,the mechanism,types and affecting factors of browning of explants and calli were briefly summarized,and the research direction was prospected,in order to providereferences for plant tissue culture.Keywordsrice;callus;genotype;browning mechanism;antioxidant;polyphenol oxidase褐化现象常见于水稻愈伤诱导和愈伤继代培养过程中，在褐化初期，愈伤组织颜色变深，呈现出棕色或黑褐色，并且会逐步扩散到周边其他愈伤，最后直至愈伤死亡。
实验七 基因枪转化
六、思考题
影响基因枪转化的因素有哪些？
基因枪 （biolistics, particle bombardment, microprojectile)
最早的基因枪是1987年美国康乃尔大学Sanford等研制成 功的火药基因枪，1990年杜邦公司推出其商品火药基因 枪PDS-1000系统。
压缩气体驱动的基因枪（PDS-1000/He）
PDS-1000/He基因枪是美国康乃尔大学Sanford等在原火 药基因枪的基础上设计改装的。它更加清洁、安全、能 更好地控制枪击动力，金属颗粒分散更加均匀，每枪之 间的差异小，且转化效率高。 用于基因枪的压缩气体有氦气、氢气、氮气等，其中氦 气压缩后具有更大的冲力，驱动金属颗粒的速度更高。 PDS-1000/He是利用不同厚度的聚酰亚胺薄膜做成可裂 圆片（repture disk），来调节氦气压力，当压力达到可 裂片的临界压力时，可裂片爆裂并释放出一阵强烈的冲 击波，使微粒子弹载体携带微粒子弹高速运动至钢硬的 阻拦网，微粒子弹载体变形并被阻遏，而微粒子弹继续 向下高速运动，轰击靶细胞和组织。
（4）打开气瓶，调节压力至2000psi；
（5）将易裂片、阻拦网和微弹载体安装进固定装臵中； （6）把培养皿放在托盘上，使愈伤都集中在托盘中间的圆圈 内，将托盘插入倒数第二档；
（7）打开基因枪的电源；
（8）打开真空泵； （9）关闭基因枪的门，按下抽真空键（Vac），当真空表读 数达到25 inches Hg.时，使键臵于“保持（Hold）”档； （10）按下射击键（Fire）直到射击结束； （11）按下放气键，使真空表读数归零； （12）打开基因枪门，取出培养皿，盖好盖子并用封口膜封 好
常用的渗透剂：甘露醇、山梨醇 方法: 生长旺盛的胚性愈伤组织，接种在添加0.4M甘露 醇的培养基中，4~8hr后进行基因枪转化。
农杆菌介导的水稻转化
农杆菌介导的水稻转化一．愈伤组织的培养1.愈伤组织的诱导成熟水稻种子去壳，用70%酒精处理2min，无菌水冲洗2~3次，再用25%次氯酸钠消毒处理15min，无菌水冲洗5~6次，将种子转到灭菌的培养皿上，于超净工作台上吹干。
接种到诱导培养基N6AD2.5上，28℃暗培养至长出愈伤组织（10 d左右）。
2.继代培养用无菌镊子将愈伤组织转移到继代培养基N6AD2上，28℃暗培养10 d。
继代培养两次后待用。
二．农杆菌的转化及培养1. 取农杆菌LBA4404感受态细胞于冰上融化，并在冰上取50uL感受态细胞于电击杯中，加入2.5uL pHB质粒，冰浴30min，电击，向电击杯中加入800uL SOC 混匀，将混匀后的液体转移至1.5mL离心管中，28℃，200rpm，振荡培养2h，13000rpm离心5min，去掉大部分上清液，用200uL枪头吹打悬浮，涂板于YEP(Rif 50mg/L, Kan 50mg/L)固体培养基上，28℃培养至长出菌落。
2. 挑取单菌落于5mL YEP(Rif 50mg/L, Kan 50mg/L)液体培养基中，200rpm振荡培养过夜，取2mL过夜培养的菌液于100mL相同的YEP液体培养基中扩大培养至OD600=0.5，5000rpm离心5min收集细胞，用N6A CO液体培养基重悬。
三．浸染与共培养1.选择生长状态良好的愈伤组织，用无菌镊子将其适当夹小，创造伤口，然后放在无菌烧杯中用菌液浸泡，一般浸染时间为10~30min，浸染时要不是摇动。
2.倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液。
3.将吸干菌液的愈伤组织置于铺有一层无菌滤纸的N6A CO固体培养基上，26℃暗培养2~3天，直至愈伤组织上出现少量菌斑为止。
四．脱菌与筛选1.共培养的愈伤组织放在广口瓶中，用无菌水清洗至清澈；2.浸泡于含500mg/L Cef 的N6A CO液体培养基中，在摇床上中速振荡30~60min；3.弃液，将愈伤组织用无菌滤纸吸干或放在超净工作台上吹干后接放在一筛培养基上，26℃暗培养3周，再转入二筛培养基上26℃暗培养3周。
一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效基因转化系统
＋Ｏ５ｍｇＬ Ｋ ． ． Ｔ＋Ｏ２ｍｇＬ Ｚ ） ． ．～ Ｔ 。另外 ， 还分析 了影 响Ｔ Ｄ Ａ 移 的多种 因素， ｎ ｌ 体种 类 、愈 伤组织 预培养 基和愈 伤 －Ｎ 转 ￣＃植 － 组 织继代 次数等 。采 用优 化的转化 程序 ， 水稻愈 伤组织转 化率 和植 株转化 率可 达７ ％以上 。 ０
ａ．２ ０ ） 验证 了该 系统 的适 用性 、 １ ０ ７， ， 可靠 性 和高效性 。
收稿 日期 ： ０ ７０ － ０ 接受 日期 ： ０ ７ １ 一 ９ ２ ０ —６２ ； ２ ０ — １Ｏ 基金项 目：国家 自然科 学基金 （ ｏ ３ ６ ０ ５ Ｎ ．０７１ ） ８ ‘通讯作 者 。Ｅ ｍａｌ ｃ ｏ ｇ ＠ｉ ａ ．ｃｃ － ｉ ｈ ｎ ｋ ｂ ｓａ ．ｎ ： ｃ
２ ０ ； ｔ １ ２ ０ Ｚｈ ａ ｇ ｅ １ ２ ０ Ｊ ａ ｇ ｅ ０ ４ Ｘｕ ｅ ． ０ ５； ｕ ｎ ｔａ ． ０ ６； ｉ ｎ ｔ ａ ， ，
成熟胚 的取用 ： 取消毒 后的成 熟种子 ， 用无菌水 浸 泡 ， — 小时 后， １ １ ２ ６ 转移 到无菌 培养皿 中， 用无 菌纸吸干
关键 词 农 杆菌介 导 的遗 传转 化， 成熟 胚诱 导 的愈伤组 织， 稻 水
陈惠 ， 原，种康 （０ ８． 赵 ２ ０ ） 一种 改进 的水稻成 熟胚 愈伤组 织 高效转化 系统 ． 物学 通报 ２ ， ２ — ３ ． 植 ５ ３２ ３１
水稻的遗传转化
水稻的遗传转化1）种子消毒：用75%乙醇浸泡去皮的水稻种子1min（剧烈摇动），再用2.5%的次氯酸钠分别处理两次，每次15min，然后用无菌水冲洗3-5次后均匀铺于诱导培养基上，不宜过多，一个培养皿大概14-20粒。
2）水稻愈伤组织的诱导和继代培养：消毒好的成熟种子在诱导培养基上28℃暗培养25-28天。
待愈伤组织长至合适大小，在培养基中来回剧烈摇动几次，使一些小块愈伤从大的组织块上脱离，从中挑选光滑、淡黄色、较硬、大小在2-3mm的胚性愈伤，均匀铺放在继代愈伤培养基上，28℃避光培养7-8天，即可用于农杆菌转化。
3）农杆菌介导的水稻愈伤组织转化及共培养：刮取已活化3天的农杆菌，放入液体共培养培养基中，用力打散，置摇床摇培0.5-2h，使得菌液的OD600在0.1-0.15（0.125最宜）之间。
将挑选的愈伤组织小粒放入已加农杆菌的液体培养基中，轻轻摇动几次，放置15-20min。
倒去菌液，用无菌滤纸吸干均匀的铺在已加滤纸的共培养基中。
愈伤在共培养培养基中22℃条件下暗培养3天。
4）转化愈伤组织的选择培养：共培养后的愈伤先用灭菌水洗涤三次，后用含头孢500mg/L的灭菌水浸泡30min，期间轻轻摇动，之后用滤纸吸干，均匀铺放在选择培养基上，28℃暗培养10天，之后进行第二次筛选，挑选淡黄色、生长状态良好的愈伤，均匀铺放在含潮霉素和头孢的选择培养基中，28℃暗培养15天。
5）愈伤组织的分化培养：挑选黄色、圆形的愈伤组织，均匀铺放在预分化培养基上，28℃暗培养7天。
之后挑选生长状态良好、淡黄色的胚性愈伤，放入分化培养基上，28℃光照培养30-60天左右，直至转基因小苗长出。
中间每隔25天左右将愈伤转移到新鲜的分化培养基上。
6）水稻的壮苗培养与移栽：将长出的小苗去掉周围的愈伤，在无菌条件下转移到1/2MS的壮苗培养基中，使根部浅插入培养基中，28℃光照培养（14h光/10h暗）。
当苗长至瓶口、约10cm以上时，打开瓶口所覆塑料膜，瓶内加入约1/3 的水，使苗暴露于空中炼化培养。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
水稻愈伤组织转化一、实验目的1.掌握植物组织培养的基本原理；2.学习水稻愈伤组织的诱导方法；3.学习农杆菌转化法的原理，掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法；4.学习转基因植株的各种鉴定方法（包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH等），同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。
二、实验原理1.植物组织培养植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等，在人工控制的培养基上培养，使其生长、分化以及形成完整植株的技术。
自1902年Haberlandt 首先用紫鸭跖草( Tradescantia )的叶片栅栏组织进行培养来，植物组织培养已有100余年历史。
用于离体培养的各种植物材料称为外植体（explant）。
根据外植体的类型，又可将组织培养分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。
（从这个角度讲，本学期的实验属于胚胎培养。
）植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。
2.基因工程基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。
这种利用基因工程技术获得的植物一般称为“基因工程植物”。
自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，成功进行转基因的植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例，有些转基因产品已进入市场。
通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。
3.农杆菌转化法转基因的方法有很多，对于植物而言，最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。
农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌，其内含Ti质粒：T-DNA（Transferre DNA）区：农杆菌Ti 质粒中向植物中转移并整合进植物基因组中的部分。
T-DNA区大小为10-30Kb，左右边界高度保守，为25bp正向重复序列。
根癌农杆菌进行转化时，只识别左右边界（尤其是右边界在转化时最为重要），而T-DNA区内为什么基因则不影响转化。
因此我们可以通过基因工程改造T-DNA区，转化目的基因。
毒性蛋白（Virulence）区：越20Kb，包括A、B、C、D、E、F、G等基因区，有些基因区含多个基因，形成操纵子结构。
毒性蛋白区在侵染植物细胞的过程中起重要作用。
4.农杆菌转化过程：1)植物受伤部位酚类化合物的分泌；2)附着（染色体毒性基因ChvA、ChvB）；3)VirA/G的双元系统感受受伤信号；4)其他 Vir基因的表达；5)T-DNA链的切出（VirD1+VirD2）；6)T-complex（T复合体）的形成；7)运输（从细菌中输出、进入植物细胞、入核）；8)整合。
植物受伤后的分泌物中含有酚类物质，这些酚类物质可以被农杆菌感知，借助于趋化性迁移至植物受伤部位，在ChvA、ChvB的帮助下，附着到受伤部位。
【因此在人工进行农杆菌侵染时，需要加入乙酰丁香酮（AS）吸引农杆菌，乙酰丁香酮即起到和植物受伤后分泌的酚类物质相同的作用。
】VirA识别植物受伤后分泌的酚类物质信号，进行自磷酸化，进而将磷酸化信号传VirG——这是典型的细菌双元信号传导系统。
VirG磷酸化后被活化，作为转录因子启动或增强各毒性蛋白的表达。
VirD2在 D1的帮助下识别T-DNA区25bp的边界序列，利用核酸外切酶的在第3、4碱基之间形成缺刻；VirD2的Tyr29与缺刻的5 ’端共价结合，DNA新链合成时便生成一条T-DNA单链，这条单链与VirD2和VirE2 结合形成T-complex。
T-complex通过细菌细胞壁上由11个VirB 蛋白和VirD4组成的通道从农杆菌进入植物细胞。
此外，VirD2含有NLS（核定位序列），能够引导T-complex进入细胞核，并帮助T-DNA插入植物染色体中。
VirE2是非特异DNA结合蛋白，包裹T-DNA单链，使DNA由随机卷曲状态转变为规则螺旋，这种形状使T-complex 容易穿过核孔。
此外，VirE2将T-DNA包裹，还可避免T-DNA从细菌向植物转移过程中被降解。
VirE2可在植物细胞膜上形成通道，使T-complex进入植物细胞；VirE2虽不含NLS序列，但亦可促进T-complex向核定向转运。
5.Ti质粒的改造：Ti质粒只有被解甲之后才能被应用于转基因实验中。
所谓解甲，是指去除对转基因有不良影响的基因，如生长素、细胞分裂素合成基因等。
现使用的工程菌株均使用双元载体。
双元载体由存在于工程菌株中的大质粒和方便体外操作的小质粒组成。
大质粒包含Vir区，负责侵染植物细胞、帮助T-complex转运等；小质粒约十几Kb，方便体外操作，包含T-DNA区、筛选标记等。
实际应用时，将目的基因插入T-DNA区即可。
三、实验用品1、实验仪器：镊子、灭菌滤纸、移液器、平皿、离心管、离心机、三角瓶、EP管、摇床、分光光度计、超净工作台等；2、实验材料：日本晴水稻种子、 EHA105农杆菌；3、实验试剂1)0.1% 升汞，无菌水等2)抗生素：利福平（Rif）、卡那霉素（Kan）、头孢霉素（Cef）、潮霉素（Hyg）3)培养基：①N6培养基：大量元素母液（50×）g/LKNO3141.5MgSO4·7H2O 9.25KH2PO420（NH4）2SO423.15微量元素母液（1000×） Mg/250mL KI 200 H 3BO 3 400 MnSO 4·4H 2O （MnSO 4·H 2O ） 1100 （834） ZnSO 4·7H 2O0.375钙盐母液（200×） g/250mL CaCl 2·2H 2O （无水CaCl 2）8.3 （6.27）铁盐母液（200×） g/250mL EDTA 加热溶解，FeSO 4常温溶解后倒入EDTA 中混匀，加热至60-70度，冷却备用。
FeSO 4·7H 2O 1.39 Na 2EDTA·H 2O1.865维生素母液（1000×） Mg/250mL 烟酸125 盐酸吡哆醇（VB 6） 125 盐酸硫胺素（VB 1） 250 甘氨酸250肌醇5g 定容至250mL ，浓度为200×（终浓度100mg/L ）附加有机成分 mg/L水解酪蛋白 500 配培养基之前加入谷氨酰胺 500 脯氨酸 500 蔗糖30g/L激素（根据不同培养基区别添加）mg/L2,4-D母液 2 70%终体积的酒精溶解，水定容NAA 0.5 无水乙醇溶解，水定容6BA 3 1M KOH溶解，水定容②YEP培养基蛋白胨酵母粉NaCl10g/L 10g/L 5g/L③侵染培养基：N6D2（N6加2mg/L 2,4-D）液体培养基+AS（100μM）④共培养培养基：N6D2+AS（100μM）固体培养基⑤筛选培养基1（初次筛选）：N6D2+Cef（600mg/L）+Hyg（25mg/L）固体培养基⑥筛选培养基2（二次筛选）：N6D2+Cef（300mg/L）+Hyg（50mg/L）固体培养基⑦分化培养基：N6+6-BA+NAA+Cef（300mg/L）+Hyg（50mg/L）固体培养基四、实验步骤（一）水稻愈伤组织的诱导：，无菌水冲洗3-5次，每次1.水稻种子去壳，0.1%升汞消毒15-20min（或4%次氯酸钠30min）10min，不断摇晃；2.滤纸吸干水分，将种子置于N6D2固体培养基上25℃暗培养诱导愈伤组织；一周时去除长出的芽；3.愈伤组织长至较大时（约2周）继代，培养至7天用于转化。
（二）农杆菌活化4.早上取甘油保存的农杆菌，加至3-5 ml YEP液体培养基中（含利福平R if25mg/l 和卡那霉素K an 50mg/l），28℃培养至晚上；5.农杆菌培养物，按200至500倍左右稀释，加入不含抗生素的Y EP 液体中，28℃过夜培养；6.测量O D600，培养至0.5左右；（三）农杆菌浸染及共培养7.将农杆菌培养物转移至灭菌离心管中，管壁标记液面位置，离心收集菌体；8.弃上清，倒置离心管，流尽剩余的Y EP；9.加入含100μM乙酰丁香酮（AS）的N6D2 液体培养基至标记位置，彻底重悬菌体（可先加入少量N6D2，重悬后将剩余的加入）；10.静置2h，期间收集待转化愈伤组织；11.将愈伤组织加入农杆菌悬液中，晃匀，静置30 min；12.倒掉多余液体，愈伤组织转到灭菌滤纸上，超净台吹15～20 min；13.将愈伤组织转到含100μM乙酰丁香酮N6D2固体培养基上，培养基上垫一层灭菌滤纸；14.黑暗中25℃度共培养3天；（四）筛选15.用含300mg/L 头孢霉素的无菌水冲洗愈伤组织3-5 次，每次10min，不断摇晃；洗至液体澄清（约需4-5次）；愈伤组织转到含600 mg/l 头孢霉素C ef 和25 mg/l潮霉素16.用灭菌滤纸吸干多余水份，Hyg 的N6D2 固体培养基（筛选培养基Ⅰ）上，筛选2周（可缩短至10天），期间注意去除有农杆菌增殖的愈伤组织块；17.愈伤组织转到含300 mg/l头孢霉素（Cef）和50 mg/l 潮霉素（Hyg）的N6D2固体培养基（筛选培养基Ⅱ）上，筛选2周；（五）植株再生18.将筛选获得的H yg 抗性愈伤组织转移到含3mg/l 6-BA 和0.5 mg/l NAA 的N6 培养基（不含2,4-D）,25°C 光照培养，诱导植株再生。
经2-3 周后，愈伤组织可出现绿点或小植株（小植株只是s hoot）；（以下步骤未进行）19.将含绿点或小植株的愈伤组织转移到生根培养基（1/2 MS大量元素和微量元素，1/2 N6维生素，10 g/l蔗糖），培养植株长大并诱导生根；20.2-4 周后，将茁壮的再生植株移出，室内水培壮苗2-3 天后，移栽至土中，苗期水刚好没过土即可。
（六）鉴定21.GUS染色：在生长状态良好的克隆上夹取少量愈伤组织，放入EP管中，加入少量X-Gluc染液至没过材料，37℃过夜染色；（以下步骤未进行）22.PCR检测：过程略。
五、实验结果1.愈伤组织诱导2.二次筛选平板（色泽浅而鲜艳的愈伤为阳性）。
从二次筛选的结果看，转化率在60%左右。
这些克隆在后续实验中大多可以继续生长愈伤，但随机选取4个克隆进行GUS染色均为阴性。
实际的转化率，应小于二次筛选的统计。
3.愈伤组织的再分化（已可见绿点，是再分化的标志，会长成芽）4.GUS染色鉴定（有愈伤组织被染成蓝色，证明是阳性克隆）六、结果分析及总结总体来说，整个实验下来，我们基本掌握了水稻组织培养、转基因及鉴定的方法。