蛋白质多肽类药物
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生物制药多肽与蛋白质类药物
• b．种子培养基 1％蛋白胨、0.5％酵母提取 物、0.5％NaCl。
• c．种子摇瓶培养 在4个1000mL三角瓶中， 分别装入250mL种子培养基，分别接种人干 扰素αⅡb基因工程菌，30℃摇床培养10h，
第28页/共46页
• d．发酵培养基 1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、 0.01％NH4Cl、0.05％NaCl，0.6％ Na2HPO4、0.001％CaCl2、0.3％KH2PO4、 0.01％MgSO4、0.4％葡萄糖、50mg/ml氨 苄西林、少量消泡剂。
第9页/共46页
• 沉淀4加原体积l/25000量pH=8.0的 0.1mol/L PBS溶解，调至pH=7~7.5，对 PBS(pH=7.3)透析，过夜，离心，收集上清液， 检测，得IFN-B。上清液3中加盐酸使pH值降 至3.0，离心，得沉淀5。沉淀5加入原体积 1/5000量的pH=8、0.1mol/L PBS溶解，加 NaOH调节pH=7~7.5，对PBS(pH=7.3)透 析过夜，离心收集上清液，检测，得IFN-A。 每份灰黄层约能制备100万单价的纯化干扰素。
第10页/共46页
• 此法特点是一次纯化量大，回收率高于60％； 经济，简便，易于普及。效价可达1.2×108 U/ml，比活2.2×106 U/mg(蛋白)。IFNA中干扰素含量占回收干扰素的82％，比活 也比较高。IFN1的比活较低[5×104 U/mg (蛋白)]，一般可作外用滴鼻剂或点眼剂等。
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• 将0.5µg平头末端cDNA用末端转移酶加15 个dC，并将2µg质粒pBB322在PstⅠ位点 线性化，用末端转移酶加15个dG，再将两者 连接，利用这种方法可产生新的PstⅠ位点， 利于从载体上再次切下cDNA。将产生的质 粒转化大肠杆菌HB101后，用微量板培养。 合成引物5′-CCTTCTGGAACTG- 3′，该序 列是IFN-α、β最长的不间断保守序列，用其 作引物可同时调出IFN-α、β。
• c．种子摇瓶培养 在4个1000mL三角瓶中， 分别装入250mL种子培养基，分别接种人干 扰素αⅡb基因工程菌，30℃摇床培养10h，
第28页/共46页
• d．发酵培养基 1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、 0.01％NH4Cl、0.05％NaCl，0.6％ Na2HPO4、0.001％CaCl2、0.3％KH2PO4、 0.01％MgSO4、0.4％葡萄糖、50mg/ml氨 苄西林、少量消泡剂。
第9页/共46页
• 沉淀4加原体积l/25000量pH=8.0的 0.1mol/L PBS溶解，调至pH=7~7.5，对 PBS(pH=7.3)透析，过夜，离心，收集上清液， 检测，得IFN-B。上清液3中加盐酸使pH值降 至3.0，离心，得沉淀5。沉淀5加入原体积 1/5000量的pH=8、0.1mol/L PBS溶解，加 NaOH调节pH=7~7.5，对PBS(pH=7.3)透 析过夜，离心收集上清液，检测，得IFN-A。 每份灰黄层约能制备100万单价的纯化干扰素。
第10页/共46页
• 此法特点是一次纯化量大，回收率高于60％； 经济，简便，易于普及。效价可达1.2×108 U/ml，比活2.2×106 U/mg(蛋白)。IFNA中干扰素含量占回收干扰素的82％，比活 也比较高。IFN1的比活较低[5×104 U/mg (蛋白)]，一般可作外用滴鼻剂或点眼剂等。
第14页/共46页
• 将0.5µg平头末端cDNA用末端转移酶加15 个dC，并将2µg质粒pBB322在PstⅠ位点 线性化，用末端转移酶加15个dG，再将两者 连接，利用这种方法可产生新的PstⅠ位点， 利于从载体上再次切下cDNA。将产生的质 粒转化大肠杆菌HB101后，用微量板培养。 合成引物5′-CCTTCTGGAACTG- 3′，该序 列是IFN-α、β最长的不间断保守序列，用其 作引物可同时调出IFN-α、β。
多肽与蛋白质类药物
A. 许多活性蛋白质、多肽都是由无活性的蛋白质前体，经 过酶的加工剪切转化而来的有共同的来源，相似的结构 ，保留着若干彼此所特有的生物活性。研究活性多肽结 构与功能的关系及活性多肽之间结构的异同与其活性的 关系，将有助于设计和研制新的活性多肽药物。
B. 对蛋白质类药物进行结构修饰
多肽、蛋白质类药物分类
3.3.1 反相高效液相色谱
3.3.1 反相高效液相色谱
分离机理：
①用C4～C8烷基作配基，将配基键合在固定基质上作为固定相 ，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流 动相（流动相极性大于固定相）。
②蛋白质分子中既有亲水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH 等），也有疏水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和-CH等）。
理论上，每公顷红花田可生产出1公斤人胰岛素原料药。
3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法
加拿大渥太华大学生物技术研究中心的科研人员也利 用另两种高产作物——烟草和水稻植株生产出了一种 名为“胰岛素样生长因子”(ILGF)的新型降血糖药物 。
据称，ILGF的降糖效果甚至优于常规口服降糖药。 如果ILGF能通过临床试验并成功上市，或将成为前景
3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法
加拿大SembioSys生物工程公司利用北美洲普遍栽培的高 产油料作物——红花作为转基因植物“平台”，成功生 产出“红花子来源人胰岛素”，
该胰岛素顺利通过动物实验与Ⅰ～Ⅱ期临床试验，其药 代动力学与药效学试验结果与美国礼来利用大肠杆菌表 述胰岛素基因生产的重组DNA人胰岛素基本一样。
多肽和蛋白质的物化性质
4. 变性 ➢ 天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下，
其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生 物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性， 称之为蛋白质的变性作用(denaturation)。 ➢ 变性蛋白质和天然蛋白质最明显的区别是溶解度降低
B. 对蛋白质类药物进行结构修饰
多肽、蛋白质类药物分类
3.3.1 反相高效液相色谱
3.3.1 反相高效液相色谱
分离机理：
①用C4～C8烷基作配基，将配基键合在固定基质上作为固定相 ，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流 动相（流动相极性大于固定相）。
②蛋白质分子中既有亲水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH 等），也有疏水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和-CH等）。
理论上，每公顷红花田可生产出1公斤人胰岛素原料药。
3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法
加拿大渥太华大学生物技术研究中心的科研人员也利 用另两种高产作物——烟草和水稻植株生产出了一种 名为“胰岛素样生长因子”(ILGF)的新型降血糖药物 。
据称，ILGF的降糖效果甚至优于常规口服降糖药。 如果ILGF能通过临床试验并成功上市，或将成为前景
3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法
加拿大SembioSys生物工程公司利用北美洲普遍栽培的高 产油料作物——红花作为转基因植物“平台”，成功生 产出“红花子来源人胰岛素”，
该胰岛素顺利通过动物实验与Ⅰ～Ⅱ期临床试验，其药 代动力学与药效学试验结果与美国礼来利用大肠杆菌表 述胰岛素基因生产的重组DNA人胰岛素基本一样。
多肽和蛋白质的物化性质
4. 变性 ➢ 天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下，
其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生 物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性， 称之为蛋白质的变性作用(denaturation)。 ➢ 变性蛋白质和天然蛋白质最明显的区别是溶解度降低
蛋白质多肽类药物
▪ 20世纪80年代 研究者克隆了人干扰素基因，实现了基因工程
rhuIFN的大规模生产。
▪ 到了20世纪90年代 以提高rhuIFN的生物利用度和药代动力学
为主要开发方向，进行了干扰素聚乙二醇（PEG）修饰，研制了长效 干扰素，减少了给药次数，提高了疗效。
▪ 1986年 第一个重组人α干扰素Roferon(Huffman-La Roche)上市,现
复杂的化学降解和物理变化而失活。
实用文档
蛋白多肽类药物的关键问题
提高稳定性的方法： （1）温和的生产条件如对温度、机械搅拌强度和有 机溶剂的选择，对无菌条件的控制，容器的吸附效 应，水分控制，低温冷藏等。 （2）设计正确的处方如PH、缓冲对、电解质；加 入适宜稳定剂、冻干保护剂、阻聚剂如非离子表面 活性剂、糖、甘露醇、山梨醇、PEG、人血清白蛋 白等以及制备包合物等。
实用文档
蛋白多肽类药物的关键问题 蛋白多肽类药物关键问题
▪1）结构特征：蛋白质分子的化学结构决定其活性；药物的空间结
构即二维、三维结构也同样影响生物活性；另外，多肽及蛋白质的分子 量常为数千至几十万，颗粒大小在l～100nm之间，不能透过半透膜。
▪2）体内外不稳定性：蛋白质药物在体内外环境可能经受多种
实用文档
▪粒细胞/单核细胞集落刺激因子GM-CSF（1985年Wong和克隆出人GM-CSF的cDNA，并实现了表 达，1993年张智清等人在国内首次克隆了人GM-CSFcDNA，并在大肠杆菌里获得表达）
▪其他造血相关因子
实用文档
人细胞因子
▪刺激网织红细胞的早期向血液中释放 EPO 的功效在一
定剂量范围内呈剂量依赖性，但剂量超过太大后并不增加药效。
实用文档
rHuEPO的应用
rhuIFN的大规模生产。
▪ 到了20世纪90年代 以提高rhuIFN的生物利用度和药代动力学
为主要开发方向，进行了干扰素聚乙二醇（PEG）修饰，研制了长效 干扰素，减少了给药次数，提高了疗效。
▪ 1986年 第一个重组人α干扰素Roferon(Huffman-La Roche)上市,现
复杂的化学降解和物理变化而失活。
实用文档
蛋白多肽类药物的关键问题
提高稳定性的方法： （1）温和的生产条件如对温度、机械搅拌强度和有 机溶剂的选择，对无菌条件的控制，容器的吸附效 应，水分控制，低温冷藏等。 （2）设计正确的处方如PH、缓冲对、电解质；加 入适宜稳定剂、冻干保护剂、阻聚剂如非离子表面 活性剂、糖、甘露醇、山梨醇、PEG、人血清白蛋 白等以及制备包合物等。
实用文档
蛋白多肽类药物的关键问题 蛋白多肽类药物关键问题
▪1）结构特征：蛋白质分子的化学结构决定其活性；药物的空间结
构即二维、三维结构也同样影响生物活性；另外，多肽及蛋白质的分子 量常为数千至几十万，颗粒大小在l～100nm之间，不能透过半透膜。
▪2）体内外不稳定性：蛋白质药物在体内外环境可能经受多种
实用文档
▪粒细胞/单核细胞集落刺激因子GM-CSF（1985年Wong和克隆出人GM-CSF的cDNA，并实现了表 达，1993年张智清等人在国内首次克隆了人GM-CSFcDNA，并在大肠杆菌里获得表达）
▪其他造血相关因子
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人细胞因子
▪刺激网织红细胞的早期向血液中释放 EPO 的功效在一
定剂量范围内呈剂量依赖性，但剂量超过太大后并不增加药效。
实用文档
rHuEPO的应用
蛋白质多肽类药物课件
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蛋白多肽类药物的关键问题
▪ 3）吸收特征: 蛋白质药物半衰期短、清除率高、 分子量大透股能力差、易受体内酶和细菌以及体 液的破坏、非注射给药生物利用度低，一般都仅 为百分之几，提高蛋白质药物吸收的方法一般有 化学修饰或制备成前体药物，使用酶抑制剂，吸 收促进剂，选择适宜剂型保护等。
25
.
LOGO
而提高人体运输氧的能力，提高人体最大摄氧量； 4）rHuEPO主要生理作用是调节红系前体细胞分化为成熟的红细胞,进而
维持外周血红细胞的水平, 临床上主要用于治疗肾衰后引起的贫血。
19
.
rHuEPO的不良反应 常见不良反应:
高血压: 大多发生于慢性肾衰病人，可能是Het快速 增加、血液粘稠度增高、周围血管阻力增加等所致 。
重组人抗凝血酶（ATryn）是2006年批准的、第一个由 转基因动物（羊）生产的重组药物。
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.
人骨形成蛋白
是最年轻的一组 第一个产品2001年批准上市
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.
融合蛋白
1）是为数很少的以抑制为作用机理的重组药物,仅有 3个
2）1998年批准的Enbrel(Amgen): 是TNF受体和IgG 的Fc片段的融合蛋白，含934个氨基酸，适应症为 风湿性关节炎
8
.
人造血因子
包括:
重组人促红细胞生成素: 1985年成功表达了重组人促红细胞生成素 (rhEPO，1989年上市第一个重组人促红细胞生成素。
新红细胞生成刺激蛋白(NESP): 美国 Amgen 公司研制的长效 EPO 制剂 , 于 2001 年 6 月底获得欧洲药物评审委员会批准 ,用于慢性肾衰引起的贫 血。NESP 是一种高糖基化 rhEPO 类似物,也是第一个被批准用于临床的 新型促红细胞生成素 ,具rhEPO 相似的作用机制即刺激红系造血。法国学 者Dalle等 ,于2001 年利用基因重组技术合成了一种二聚体 EPO ,由两个 EPO 及一个 9 肽连接而成的融合蛋白。
多肽和蛋白质类药物
甲状腺激素 胰岛激素
胃肠道激素
胸腺激素
甲状旁腺激素（PTH）、降钙素（CT）
胰高血糖素、胰解痉多肽
胃泌素、胆囊收缩素－促胰酶素（CCK-PZ）、肠泌 素、肠血管活性肽（VIP）、抑胃素（GIP）、缓激 肽、P物质
胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子
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多肽类药物分类
多肽类细胞生长调 表皮生长因子（EGF），转移因子（TF），心
意方法本身的回收率的高低。
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纯化方法选择指南
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END
谢谢大家！
粘蛋白
胃膜素、硫酸糖肽、内在因子等。
胶原蛋白 碱性蛋白质
明胶、阿胶等 硫酸鱼精蛋白
蛋白酶抑制剂
胰蛋白酶抑制剂
凝集素
PHA、ConA
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多肽与蛋白质类药物的制造方法
重点
提取分离纯化法（重点） 化学合成法
微生物发酵法
蛋白质药物
重点
原料选择
发酵
沉淀
变性 复性
上清
生物 组织 破碎 提取
蛋白质纯化
纯度 活性鉴定
合格
不合格
精品9
原料选择 提取
重点
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纯化 根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。
1.根据蛋白质的pI的不同进行纯化，其方法有：
1）pI沉淀法
2）pI沉淀法与盐析法相结合
3）等电聚焦法
2.蛋白质分子形状和大小的不同进行纯化，其方法有
1）凝胶过滤
2）超滤法
3） 离心法
4）透析法
3.蛋白质的溶解度不同进行纯化，其方法有：
a)盐溶与盐析法
b）结晶法
c）有机溶剂沉淀法
4.蛋白质电离性质不同进行分离：离子交换法 5.蛋白质功能专一性不同进行纯化：亲和层析法 6.蛋白质在溶剂系统中分配不同进行纯化：萃取法 7.蛋白质的选择性吸附的性质进行纯化：吸附法 8.蛋白质的其他特殊性质进行纯化
多肽与蛋白质类药物
两性物质的等电点会因条件不同（如在不同离子 强度的不同缓冲溶液中，或含有一定的有机溶媒的 溶液中）而改变。当盐存在时，蛋白质若结合了较 多的阳离子，则等电点向较高的pH值偏移。反之， 蛋白质若结合较多的阴离子，则等电点移向较低的 pH值。
用等电点法沉淀蛋白质常需配合盐析操作，而除 去不需要的杂蛋白时，常需配合热变性操作。
肝细胞生长因子是从肝细胞分化最旺盛阶段的胎 儿、胎猪或胎牛肝中获得的。若用成年动物，必须经 过肝脏部分切除手术后，才能获得富含肝细胞生长因 子的原料。
（3）生物状态 动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含 量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分泌使 胆汁排空，对胆汁的收集不利。严重再生障碍性贫 血症患者尿中的EPO含量增加。
葡聚糖凝胶含有少量的酸性基团，故有较弱的离子 交换作用，此外还有吸附作用。在纯化蛋白质时，可 采用mol／L），或者用与待分离蛋白质相同的标准 蛋白质预先使凝胶柱平衡，以期不损失所分离的蛋白 质。
3、根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋自质
蛋白质的溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂的 电解质性质及温度等多种因素的影响。在同一特定条 件下，不同蛋白质有不同的溶解度，适当改变外界条 件，可以有选择地控制某一种蛋白质的溶解度，达到 分离的目的。
应用最多的氨基保护剂是苄氧羰酰氯（Cbz-Cl）， 可用催化氢化法或钠氨法（用金属钠在液氨中处理） 除去保护基，也可用叔丁氧羰酰氯（BOC-Cl）作保 护剂，用稀盐酸或乙酸在室温除去保护基。
羧基保护剂通常用无水乙醇或甲醇在盐酸存在下 进行酯化，使羧基接上烷基。除去保护基可在常温下 用氢氧化钠皂化法。
等电聚焦电泳除了用于分离蛋白质外，也可用于 测定蛋白质的等电点。
2、根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质
多肽与蛋白质类药物-氨基酸多肽蛋白质
二.多肽与蛋白质类药物的制造方法
3.分离纯化
多肽及蛋白质的分离纯化是将提取液中的目的蛋 白质与其他非蛋白质杂质及各种不同蛋白质分离 开来的过程. 常用的分离纯化方法有: (1) 根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质 在等电点时蛋白质性质比较稳定,其物理性质如 导电性,溶解度,黏度,渗透压等皆最小,因此可利用 蛋白质等电点时溶解度最小的性质来制备蛋白质.
不十分清楚，从活性肽或细胞生长调节因子的角度去研究 它们的物质基础和作用机制，预计可获得成效
主要多肽类药物
1．多肽激素 ① 垂体多肽激素： 促皮质素(ACTH),促黑激素(MSH),催产素(OT) ② 下丘脑激素： 促甲状腺激素释放激素（TRH），生长素抑制激素（GRIF） ③ 甲状腺激素： 甲状旁腺激素（PTH），降钙素（CT）。 ④ 胰岛激素： 胰高血糖素γ，胰解痉多肽γ。 ⑤胃肠胃道激素： 胃泌素，胆囊收缩素一促胰激素（CCK-PZ）,缓激肽 ⑥ 胸腺激素： 胸腺素、胸腺肽, 胸腺血清因子
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（一）蛋白类药物的分类
6．碱性蛋白质
硫酸鱼精蛋白，存在于鱼类成熟的精子中，强碱
性。
7．蛋白酶抑制剂 胰蛋白酶抑制剂，亦称抑肽酶。
8．植物凝集素 PHA、ConA。
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（二）蛋白类药物作用方式
已从生化药物对机体各系统和细胞生长的调节 扩展到被动免疫、替代疗法、抗凝血剂以及蛋 白酶的抑制物等多种领域
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（三）应用基因工程技术制备重要的 蛋白类药物
已实现产品工业化的有几十种，并正从微生物 和动物细胞的表达转向基因动植物的表达。
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（四）蛋白质工程技术的应用
蛋白多肽肺部给药研究进展
蛋白多肽肺部给药研究进展近年来，随着生物医药技术的不断发展，蛋白质多肽肺部给药成为了尽管研究热点。
肺部给药是一种非常理想的给药途径，它具有吸收迅速、药效高、剂量易于控制等诸多优点，尤其对一些难以通过口服给药途径的药物来说，肺部给药可以克服口服给药的缺陷。
此外，肺部给药的药物低毒性、低副反应，是迄今为止最安全的给药方式之一。
因此，蛋白质多肽肺部给药领域的研究引起了广泛的关注和重视。
1、蛋白质多肽药物及其应用蛋白质多肽是一种由多个氨基酸残基组成的生物高分子，分子量一般在6000-10000之间，由于其具有高度特异性、高效治疗、安全性等优点，被广泛应用于药物治疗领域。
蛋白质多肽药物包括部分剪切酶抑制剂、利妥昔单抗、沙利度胺、糖皮质激素、肝素、白蛋白等。
在糖皮质激素类药物中，布地奈德是一种适用于过敏性鼻炎、哮喘等呼吸系统相关疾病的常用治疗药物。
在肝素类药物中，肝素盐酸盐、依诺佐肝素等普遍应用于防治深静脉血栓。
2、蛋白质多肽肺部给药的研究现状在肺部给药的研究中，针对蛋白质多肽类型的药物，研究人员开始尝试使用肺部给药途径，以期提高药物吸收效率、减少药物在体内的代谢和降低药物在体内的毒性。
因此，蛋白质多肽肺部给药途径成为了当前该领域的研究热点之一。
目前，国内外有许多研究团队致力于蛋白质多肽的肺部给药途径的研究，该研究领域在药品的性能、剂量、次数等方面都获得了重要进展。
许多研究中，研究人员通过改变蛋白质多肽的结构以提高其肺部选结、尝试使用吸入剂或气溶胶的形式给药等方式，以实现肺应用。
同时，还有研究人员致力于利用基因工程技术制造蛋白质多肽型药物以便进行肺部给药研究。
3、蛋白质多肽肺部给药的研究进展及意义蛋白质多肽肺部给药的研究已经成功地应用于药物治疗领域。
例如，布地奈德通过肺部递送给药已广泛应用于过敏性鼻炎、哮喘等疾病，其疗效已经得到证实。
又如，利妥昔单抗通过肺部给药后，其生物利用度能够显著提高，适应于肿瘤治疗领域。
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段的融合蛋白，含934个氨基酸，适应症为风湿性关节炎
3）1999年上市的免疫毒素Ontak（Ligand）：适应症
是皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL），是缺失细胞结合域的白喉毒素与IL-2的 N端133个氨基酸的融合蛋白。
4）2003年上市的Amevive（Biogen Idec）：是LEF-3
的CD2与IgG的Fc
精品课件
rHuEPO原理
•rHuEPO是一种酸性糖蛋白 •分子量:29.8士0．3kDa •1985年问世并成为注册药物。 •启动子构建成表达载体→不同的细胞株[有中国仓鼠卵细胞(CH0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)及C127
小鼠纤维细3]作为受体进行表达→获取rHuEPO。
• rHuEPO与EPO： 1）氨基酸序列完全相同，仅糖基部分有微小差别； 2）在结构上的不同是N-端唾液酸含量的差异； 3）作用极为相似，可以明显提高人体的红细胞数量及血红蛋白含量，从
▪ 20世纪80年代 研究者克隆了人干扰素基因，实现了基因工程
rhuIFN的大规模生产。
▪ 到了20世纪90年代 以提高rhuIFN的生物利用度和药代动力学
为主要开发方向，进行了干扰素聚乙二醇（PEG）修饰，研制了长效干 扰素，减少了给药次数，提高了疗效。
▪ 1986年 第一个重组人α干扰素Roferon(Huffman-La Roche)上市,
在此仅计为1个）
▪3个"重磅炸弹": Humulin（野生型胰岛素）、Humalog (Eli
Lilly，胰岛素突变体)、Lantus (Anvents，胰岛素突变体)
▪人生长激素（1985年第一个重组人生长激素Protropin(Genetech)
上市）
▪卵泡刺激激素 ▪其他激素
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人造血因子
重组人抗凝血酶（ATryn）是2006年批准的、第一个 由转基因动物（羊）生产的重组药物。
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人骨形成蛋白 是最年轻的一组 第一个产品2001年批准上市
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融合蛋白
1）是为数很少的以抑制为作用机理的重组药物,仅有3个 2）1998年批准的Enbrel(Amgen)：是TNF受体和IgG的Fc片
包括： ▪重组人促红细胞生成素: 1985年成功表达了重组人促红细胞生成素(rhEPO，1989年
上市第一个重组人促红细胞生成素。
▪新红细胞生成刺激蛋白(NESP)：美国 Amgen 公司研制的长效 EPO 制剂 ,于 2001
年 6 月底获得欧洲药物评审委员会批准 ,用于慢性肾衰引起的贫血。NESP 是一种高糖基 化 rhEPO 类似物,也是第一个被批准用于临床的新型促红细胞生成素 ,具rhEPO 相似的作 用机制即刺激红系造血。法国学者Dalle等 ,于2001 年利用基因重组技术合成了一种二聚 体 EPO ,由两个 EPO 及一个 9 肽连接而成的融合蛋白。
2)与以往的小分子药物相比，蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性 、生物功能明确、有利于临床应用的特点。由于其成本低、成功率高、安全 可靠，已公司首先将重 组胰岛素投放市场，标志着第一个重组蛋白质药物的诞生。
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基因工程蛋白质或多肽类药物
精品课件
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基因工程---蛋白质多肽类药 物
精品课件
基因工程蛋白质或多肽类药物
简介
分类
rHuEPO
蛋白多肽类药物
蛋白重组药物-8类
原理、方法、应用
精品课件
简介
基因工程被认为是21世纪最具主导地位的高新 技术之一，基因工程药物基本都是蛋白多肽类药物，对肿 瘤遗传性和非遗传性疾病有着特殊的疗效，随着科学与技 术的不断发展以及人民对生活质量的要求在不断提高蛋白 类药物的制备将发展为21世纪我国最具吸引力的新技术产 业之一。蛋白质和多肽类作为药物，具有生理活性强、免 疫原性低、疗效高等诸多优点，随着基因工程的不断发展 ，在人类治疗疾病中的地位也日趋重要，目前成为国际药 学界的研究重点之一 。
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蛋白多肽类药物的关键问题 蛋白多肽类药物关键问题
▪1）结构特征：蛋白质分子的化学结构决定其活性；药物的空间结
构即二维、三维结构也同样影响生物活性；另外，多肽及蛋白质的分子 量常为数千至几十万，颗粒大小在l～100nm之间，不能透过半透膜。
▪2）体内外不稳定性：蛋白质药物在体内外环境可能经受多种
简介
分类
rHuEPO
蛋白多肽类药物
蛋白重组药物：8类
原理、方法、应用
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重组蛋白药物分类
目前目前上市的蛋白重组药物大致可以分为以下几 类:
●多肽类激素药 ●人造血因子 ●人细胞因子 ● 人血浆蛋白因子 ● 人骨形成蛋白 ● 重组酶 ● 融合蛋白 ● 外源重组蛋白
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多肽类激素药
包括: ▪人胰岛素（1982年第一个重组人胰岛素Humulin (Eli Lilly)上市 ▪12种制剂（Novo Nordisk的8个速效、中效和长效重组胰岛素突变体
而提高人体运输氧的能力，提高人体最大摄氧量； 4）rHuEPO主要生理作用是调节红系前体细胞分化为成熟的红细胞,进而
维持外周血红细胞的水平, 临床上主要用于治疗肾衰后引起的贫血。
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rHuEPO的不良反应 常见不良反应：
▪高血压：大多发生于慢性肾衰病人，可能是Het快速增加、血液粘稠
度增高、周围血管阻力增加等所致。
▪粒细胞/单核细胞集落刺激因子GM-CSF（1985年Wong和克隆出人GM-CSF的cDNA，并实现了表达，1993年张 智清等人在国内首次克隆了人GM-CSFcDNA，并在大肠杆菌里获得表达）
▪其他造血相关因子
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人细胞因子
▪刺激网织红细胞的早期向血液中释放 EPO 的功效在一
定剂量范围内呈剂量依赖性，但剂量超过太大后并不增加药效。
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rHuEPO的应用
rHuEPO 适用于： ▪慢性肾衰贫血的治疗：此类贫血的一个主要原因是EPO 生成缺
乏。EPO 可谓替代治疗方法，其疗效达95％以上
▪艾滋病(AIDS)病人伴贫血 ▪肿瘤病人化疗所致贫血 ▪慢性病贫血 ▪造血干细胞疾病的贫血 ▪自体供血输注。
▲
背景
原理
应用
。
不良反应
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rHuEPO背景
在运动竞赛中兴奋剂的使用日益受到人们的重视。尽 管现在对兴奋剂的检测力度不断加大，但兴奋剂的使用并未 销声匿迹，不断有新的兴奋剂在悄悄使用。随着生物技术的 进步，运用基因重组技术开发出了许多重组激素类药物。如 重组人促红细胞生成素（ rHuEPO ），近些年来被滥用于一 些耐力性运动项目中，例如长距离跑、游泳、自行车等项目 。早期的一项来自德国的报告表明，有18名自行车运动员的 死亡与rHuEPO 的滥用有关。
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蛋白多肽类药物的关键问题
▪ 3）吸收特征：蛋白质药物半衰期短、清除率高、分子
量大透股能力差、易受体内酶和细菌以及体液的破坏、非 注射给药生物利用度低，一般都仅为百分之几，提高蛋白 质药物吸收的方法一般有化学修饰或制备成前体药物，使 用酶抑制剂，吸收促进剂，选择适宜剂型保护等。
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重组酶 1993年 第一个重组酶Pulmozyme(Genetech)上市
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外源重组蛋白
重组水蛭素(hirudin) 1986年 水蛭素的cDNA被克隆出来，获得了建立在多种载体上的
重组水蛭素，包括在大肠杆菌，枯草杆菌，酵母菌及真核细胞等的成 功表达。
1998年 重组水蛭素药物在德国正式上市 1999年 英国批准上市.复旦大学成功研制国家一类新药RGD-
▪癫痫发作：原因不明，偶见于慢性肾衰病人； ▪其它： 头痛、心动过速、恶心、呕吐、呼吸加快、透析管栓塞等。
运动员长期滥用rHuEPO 将可能导致上述症状的出现，严重者甚至导致死 亡。
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rHuEPO的应用 rHuEPO 的作用
▪促使红系祖细胞的增殖和分化，骨髓内红细胞池扩 大
▪促使红细胞的成熟和Hb 的合成
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简介
•概念
多肽和蛋白质类药物:指用于预防、治疗和诊断的多肽和蛋白质
类物质生物药物。
•特点
▪ 基本原料简单易得：主要以20种天然氨基酸为基本结构单元 ▪ 药效高，副作用低, 不蓄积中毒 ▪ 用途广泛，品种繁多，新型药物层出不穷 ▪ 研发过程目标明确,针对性强
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简介
1)蛋白质药物可分为: 多肽和基因工程药物 单克隆抗体和基因工程抗体 重组疫苗
现有5个同类产品，其中2个（组）为"重磅炸弹"，一是Pegasys（ Roche，PEG化的重组人α干扰素-2a）,另一组是Schering Plough的 PEG-Intron A/Intron A
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人血浆蛋白因子
▪重组人凝血因子Ø ▪重组人凝血因子× ▪重组人凝血因子Ù ▪组织血浆酶原激活物tPA ▪C反应蛋白 ▪重组人抗凝血酶
复杂的化学降解和物理变化而失活。
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蛋白多肽类药物的关键问题
提高稳定性的方法： （1）温和的生产条件如对温度、机械搅拌强度和有 机溶剂的选择，对无菌条件的控制，容器的吸附效 应，水分控制，低温冷藏等。 （2）设计正确的处方如PH、缓冲对、电解质；加入 适宜稳定剂、冻干保护剂、阻聚剂如非离子表面活 性剂、糖、甘露醇、山梨醇、PEG、人血清白蛋白等 以及制备包合物等。
Hirudin
2005年 获准正式进入一期临床试验。 2006年 两种水蛭素和一种水蛭素类似物已被美国FDA批准生产，
分别是lepirudin,desirudin,angianmax.)
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基因工程蛋白质或多肽类药物
简介
分类
rHuEPO
蛋白多肽类药物
蛋白重组药物：8类
3）1999年上市的免疫毒素Ontak（Ligand）：适应症
是皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL），是缺失细胞结合域的白喉毒素与IL-2的 N端133个氨基酸的融合蛋白。
4）2003年上市的Amevive（Biogen Idec）：是LEF-3
的CD2与IgG的Fc
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rHuEPO原理
•rHuEPO是一种酸性糖蛋白 •分子量:29.8士0．3kDa •1985年问世并成为注册药物。 •启动子构建成表达载体→不同的细胞株[有中国仓鼠卵细胞(CH0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)及C127
小鼠纤维细3]作为受体进行表达→获取rHuEPO。
• rHuEPO与EPO： 1）氨基酸序列完全相同，仅糖基部分有微小差别； 2）在结构上的不同是N-端唾液酸含量的差异； 3）作用极为相似，可以明显提高人体的红细胞数量及血红蛋白含量，从
▪ 20世纪80年代 研究者克隆了人干扰素基因，实现了基因工程
rhuIFN的大规模生产。
▪ 到了20世纪90年代 以提高rhuIFN的生物利用度和药代动力学
为主要开发方向，进行了干扰素聚乙二醇（PEG）修饰，研制了长效干 扰素，减少了给药次数，提高了疗效。
▪ 1986年 第一个重组人α干扰素Roferon(Huffman-La Roche)上市,
在此仅计为1个）
▪3个"重磅炸弹": Humulin（野生型胰岛素）、Humalog (Eli
Lilly，胰岛素突变体)、Lantus (Anvents，胰岛素突变体)
▪人生长激素（1985年第一个重组人生长激素Protropin(Genetech)
上市）
▪卵泡刺激激素 ▪其他激素
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人造血因子
重组人抗凝血酶（ATryn）是2006年批准的、第一个 由转基因动物（羊）生产的重组药物。
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人骨形成蛋白 是最年轻的一组 第一个产品2001年批准上市
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融合蛋白
1）是为数很少的以抑制为作用机理的重组药物,仅有3个 2）1998年批准的Enbrel(Amgen)：是TNF受体和IgG的Fc片
包括： ▪重组人促红细胞生成素: 1985年成功表达了重组人促红细胞生成素(rhEPO，1989年
上市第一个重组人促红细胞生成素。
▪新红细胞生成刺激蛋白(NESP)：美国 Amgen 公司研制的长效 EPO 制剂 ,于 2001
年 6 月底获得欧洲药物评审委员会批准 ,用于慢性肾衰引起的贫血。NESP 是一种高糖基 化 rhEPO 类似物,也是第一个被批准用于临床的新型促红细胞生成素 ,具rhEPO 相似的作 用机制即刺激红系造血。法国学者Dalle等 ,于2001 年利用基因重组技术合成了一种二聚 体 EPO ,由两个 EPO 及一个 9 肽连接而成的融合蛋白。
2)与以往的小分子药物相比，蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性 、生物功能明确、有利于临床应用的特点。由于其成本低、成功率高、安全 可靠，已公司首先将重 组胰岛素投放市场，标志着第一个重组蛋白质药物的诞生。
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基因工程蛋白质或多肽类药物
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基因工程---蛋白质多肽类药 物
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基因工程蛋白质或多肽类药物
简介
分类
rHuEPO
蛋白多肽类药物
蛋白重组药物-8类
原理、方法、应用
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简介
基因工程被认为是21世纪最具主导地位的高新 技术之一，基因工程药物基本都是蛋白多肽类药物，对肿 瘤遗传性和非遗传性疾病有着特殊的疗效，随着科学与技 术的不断发展以及人民对生活质量的要求在不断提高蛋白 类药物的制备将发展为21世纪我国最具吸引力的新技术产 业之一。蛋白质和多肽类作为药物，具有生理活性强、免 疫原性低、疗效高等诸多优点，随着基因工程的不断发展 ，在人类治疗疾病中的地位也日趋重要，目前成为国际药 学界的研究重点之一 。
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蛋白多肽类药物的关键问题 蛋白多肽类药物关键问题
▪1）结构特征：蛋白质分子的化学结构决定其活性；药物的空间结
构即二维、三维结构也同样影响生物活性；另外，多肽及蛋白质的分子 量常为数千至几十万，颗粒大小在l～100nm之间，不能透过半透膜。
▪2）体内外不稳定性：蛋白质药物在体内外环境可能经受多种
简介
分类
rHuEPO
蛋白多肽类药物
蛋白重组药物：8类
原理、方法、应用
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重组蛋白药物分类
目前目前上市的蛋白重组药物大致可以分为以下几 类:
●多肽类激素药 ●人造血因子 ●人细胞因子 ● 人血浆蛋白因子 ● 人骨形成蛋白 ● 重组酶 ● 融合蛋白 ● 外源重组蛋白
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多肽类激素药
包括: ▪人胰岛素（1982年第一个重组人胰岛素Humulin (Eli Lilly)上市 ▪12种制剂（Novo Nordisk的8个速效、中效和长效重组胰岛素突变体
而提高人体运输氧的能力，提高人体最大摄氧量； 4）rHuEPO主要生理作用是调节红系前体细胞分化为成熟的红细胞,进而
维持外周血红细胞的水平, 临床上主要用于治疗肾衰后引起的贫血。
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rHuEPO的不良反应 常见不良反应：
▪高血压：大多发生于慢性肾衰病人，可能是Het快速增加、血液粘稠
度增高、周围血管阻力增加等所致。
▪粒细胞/单核细胞集落刺激因子GM-CSF（1985年Wong和克隆出人GM-CSF的cDNA，并实现了表达，1993年张 智清等人在国内首次克隆了人GM-CSFcDNA，并在大肠杆菌里获得表达）
▪其他造血相关因子
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人细胞因子
▪刺激网织红细胞的早期向血液中释放 EPO 的功效在一
定剂量范围内呈剂量依赖性，但剂量超过太大后并不增加药效。
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rHuEPO的应用
rHuEPO 适用于： ▪慢性肾衰贫血的治疗：此类贫血的一个主要原因是EPO 生成缺
乏。EPO 可谓替代治疗方法，其疗效达95％以上
▪艾滋病(AIDS)病人伴贫血 ▪肿瘤病人化疗所致贫血 ▪慢性病贫血 ▪造血干细胞疾病的贫血 ▪自体供血输注。
▲
背景
原理
应用
。
不良反应
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rHuEPO背景
在运动竞赛中兴奋剂的使用日益受到人们的重视。尽 管现在对兴奋剂的检测力度不断加大，但兴奋剂的使用并未 销声匿迹，不断有新的兴奋剂在悄悄使用。随着生物技术的 进步，运用基因重组技术开发出了许多重组激素类药物。如 重组人促红细胞生成素（ rHuEPO ），近些年来被滥用于一 些耐力性运动项目中，例如长距离跑、游泳、自行车等项目 。早期的一项来自德国的报告表明，有18名自行车运动员的 死亡与rHuEPO 的滥用有关。
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蛋白多肽类药物的关键问题
▪ 3）吸收特征：蛋白质药物半衰期短、清除率高、分子
量大透股能力差、易受体内酶和细菌以及体液的破坏、非 注射给药生物利用度低，一般都仅为百分之几，提高蛋白 质药物吸收的方法一般有化学修饰或制备成前体药物，使 用酶抑制剂，吸收促进剂，选择适宜剂型保护等。
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重组酶 1993年 第一个重组酶Pulmozyme(Genetech)上市
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外源重组蛋白
重组水蛭素(hirudin) 1986年 水蛭素的cDNA被克隆出来，获得了建立在多种载体上的
重组水蛭素，包括在大肠杆菌，枯草杆菌，酵母菌及真核细胞等的成 功表达。
1998年 重组水蛭素药物在德国正式上市 1999年 英国批准上市.复旦大学成功研制国家一类新药RGD-
▪癫痫发作：原因不明，偶见于慢性肾衰病人； ▪其它： 头痛、心动过速、恶心、呕吐、呼吸加快、透析管栓塞等。
运动员长期滥用rHuEPO 将可能导致上述症状的出现，严重者甚至导致死 亡。
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rHuEPO的应用 rHuEPO 的作用
▪促使红系祖细胞的增殖和分化，骨髓内红细胞池扩 大
▪促使红细胞的成熟和Hb 的合成
精品课件
简介
•概念
多肽和蛋白质类药物:指用于预防、治疗和诊断的多肽和蛋白质
类物质生物药物。
•特点
▪ 基本原料简单易得：主要以20种天然氨基酸为基本结构单元 ▪ 药效高，副作用低, 不蓄积中毒 ▪ 用途广泛，品种繁多，新型药物层出不穷 ▪ 研发过程目标明确,针对性强
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简介
1)蛋白质药物可分为: 多肽和基因工程药物 单克隆抗体和基因工程抗体 重组疫苗
现有5个同类产品，其中2个（组）为"重磅炸弹"，一是Pegasys（ Roche，PEG化的重组人α干扰素-2a）,另一组是Schering Plough的 PEG-Intron A/Intron A
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人血浆蛋白因子
▪重组人凝血因子Ø ▪重组人凝血因子× ▪重组人凝血因子Ù ▪组织血浆酶原激活物tPA ▪C反应蛋白 ▪重组人抗凝血酶
复杂的化学降解和物理变化而失活。
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蛋白多肽类药物的关键问题
提高稳定性的方法： （1）温和的生产条件如对温度、机械搅拌强度和有 机溶剂的选择，对无菌条件的控制，容器的吸附效 应，水分控制，低温冷藏等。 （2）设计正确的处方如PH、缓冲对、电解质；加入 适宜稳定剂、冻干保护剂、阻聚剂如非离子表面活 性剂、糖、甘露醇、山梨醇、PEG、人血清白蛋白等 以及制备包合物等。
Hirudin
2005年 获准正式进入一期临床试验。 2006年 两种水蛭素和一种水蛭素类似物已被美国FDA批准生产，
分别是lepirudin,desirudin,angianmax.)
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基因工程蛋白质或多肽类药物
简介
分类
rHuEPO
蛋白多肽类药物
蛋白重组药物：8类