多肽及蛋白质类药物的发展过程

2.2.2喷雾冷冻干燥法(spray freeze drying) Nz_mVQ_-4
将多肽或蛋白质冻干粉和赋形剂（如糖类、表面活性剂、盐等）加入含可生物降解聚合物的有机溶剂中超声混匀，通过一喷头以雾状喷至液氮中使多肽或蛋白质迅速冷冻固化，再将所得的冷冻颗粒冻干，去除有机溶剂即得。在该法中，不同喷雾条件所获得蛋白质的稳定性不同，其由所用仪器设备确定。减小微球直径能减少蛋白质微球的突释效应[11]。制备过程中使用无水溶剂，避免了油水界面对蛋白质的影响，但在喷雾过程中蛋白质接触的气液界面同样影响其稳定性，所以在制备过程中须加入各种稳定剂。Im_;
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2.2制备工艺ubn__`w=w$ Nhomakorabea制备多肽及蛋白质类药物微球的常用方法包括复乳溶媒蒸发/萃取法、喷雾冷冻干燥法、相分离法、喷雾干燥法等。整个制备工艺中，蛋白质的稳定性、包封率、突释效应是重点考察因素。以下着重介绍最常用的两种方法。B*+3A!__{s
2.2.1复乳溶媒蒸发/萃取法(double-emulsion solvent evaporation / extraction method) p__:__9)}y
3.1.2改进制备工艺&uw_j&-u?_
多肽或蛋白质通过高速搅拌包合在海藻酸钙盐中而形成含药微芯，再以可生物降解聚合物用复乳溶媒萃取法制备微球。Zhou等利用该法制得的人血清白蛋白PELA微球的包封率高、表面光滑、稳定性高，第一天突释效应小于用传复乳溶媒萃取方法制备所得的微球[19]。adG=L9 "n
近年来的研究主要在对毫微粒表面进行修饰，如在毫微粒表面连接各种生物粘附材料，如脱乙酰壳多糖、Carbopol®等。Kawashima等研究者[3]采用乳化溶剂扩散法在降钙素的PLGA毫微粒表面覆盖一层粘附材料脱乙酰壳多糖后，与原PLGA毫微粒相比，虽然药物扩散形式没有显著改变，但能明显降低血钙水平，且能维持48小时。Lubben等报道[1]，脱乙酰壳多糖及其衍生物能有效提高亲水性大分子物质的吸收，因其能增加细胞间的紧密连接的开放而有利于药物的细胞旁转运。_P`K?_k<
土温20或土温80在喷雾过程中，不仅占据雾滴的气液界面，减小气液界面张力，而且减慢液体流向雾滴的速度，进而减少蛋白质与疏水界面接触的时间，抑制了不溶性蛋白质的聚集，同时干燥和再水化时又起到了保护作用，致使蛋白质稳定性提高[14，15]。_-jc8_ku3*
多元醇或糖类（如海藻糖、甘露醇、果糖、乳果糖、蔗糖等）在一定浓度下能抑制多肽或蛋白质在油水界面的聚集，有效防止其结构和功能方面的变化和进一步失活[16]。将这类物质分散在蛋白质表面，通过其与水相互作用，增加水的表面张力，提高体系自由能，蛋白质变性则会进一步增加这种热力学的不稳定性，因而蛋白质溶液在糖类存在下能保持稳定[17]。3:Aw._-,i\
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3、存在问题%e_c9`0^4S
3.1多肽及蛋白质稳定性} PD]e*z{Z
复乳溶媒蒸发/萃取法制备微球时，蛋白质易于在油水界面聚集而变性。傅立叶变换红外光谱（FTIR）显示，蛋白质均匀分散在微球空穴内，其中大部分分布在微球内部孔穴壁上，这可能是在形成w/o型初乳时蛋白质聚集在油水界面层所造成的[12]。所以，形成稳定的w/o型初乳、减少多肽或蛋白质在油水界面间的聚集是将这类药物成功包封在微球中的关键。抑制蛋白质聚集、提高蛋白质在制备过程中稳定性的方法有：在内水相加入各种稳定剂（如表面活性剂、多元醇、PEG等）、改进制备工艺、改善内水相pH和在外水相加入附加剂等。b_&;i4__[
该法是目前制备多肽或蛋白质类药物微球的最普遍方法，其一般步骤为[9，10]：将药物溶解在水或缓冲液（如磷酸盐缓冲液）中，加入含聚合物材料的有机溶媒（如二氯甲烷或醋酸乙酯等）中，搅拌形成初乳（w1/o）；将该初乳迅速倒入另一高速搅拌的水溶液(w2)中，形成w1/o/w2型复乳，继续搅拌至有机溶媒蒸发完后，即形成固态微球，或将所得复乳加入第三种能溶解有机溶媒和水、但对聚合物材料不溶的溶媒（如异丙醇）中，复乳中的有机溶媒和水被提取后固化成球；最后干燥待用。Genentech公司的rhGH微球即是以PLGA为材料采用该方法制备而成的。wL__'tGA_v
1.2口服制剂a:(.{z?nM
多肽及蛋白质类药物应用于口服须克服两大障碍，一是抑制胃肠道各种酶对其降解，二是选用合适的制剂形式及载体材料使药物透过生物屏障。粒径范围处于1－1000nm的毫微粒制剂是目前研究最多的口服多肽制剂，但毫微粒的表面带电荷情况及聚合物疏水性能均影响多肽在小肠部位的吸收。_s__-_H_e_
海藻糖即使在很低的浓度下也能显著提高蛋白质的稳定性，甘露醇能减少蛋白质单体的损失，但要求其最好以非结晶形式存在，并与相同的蛋白质固态相结合，防止其与蛋白质相分离而不能提高蛋白质的稳定性[14]。g_U7@}___P
吸附动力学研究表明[18]，在制备微球时，一旦初乳形成，PLGA和PEG就能马上吸附在油水界面。在内水相中加入PEG400，能在形成初乳时置换油水界面的多肽或蛋白质，减少与有机相的接触，从而提高其在制备过程中的稳定性，且不影响微球形态结构。然而在微球固化时，PEG又会影响多肽或蛋白质与PLGA聚合物层的结合，相对增加了其在微球表面的含量，同时由于PEG的亲水性特征，加大了多肽或蛋白质微球在释放初期的释放量。;P9P2&_c8c
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1、多肽及蛋白质微球制剂的主要类型BV_pRk_UC"
1.1注射剂?_YO$NYwE
采用可生物降解聚合物为骨架材料，将多肽及蛋白质药物制成微球制剂用于肌肉或皮下注射，给药后随着聚合物的降解，药物以扩散、溶蚀方式释放，可达到缓释长效的目的[2]。_tu6Q7CjW8
），肌肉注射后可缓释1或2个月。这类制剂中，只有10个氨基酸的LHRH类似物微球的研究最为成功，第一个多肽微球产品——曲普瑞林于1986年问世，随后亮丙瑞林、布舍瑞林、高舍瑞林、那法瑞林等长效微球制剂相继上市。2000年美国Genentech公司推出了重组人生长激素（rhGH）PLGA微球（Nutropin p;_ _V_H_g
聚合物分子量大小和浓度对微球的表面形态和内部结构也有影响。分子量大、浓度高，其溶液的粘度增加，形成的微球粒径较大、表面孔隙少，药物释放相对较慢，突释效应也相对较小。但聚合物分子量大，其所形成的初乳稳定性差，聚合物乳滴易于合并。z@nJ-_*'U8
通过化学聚合方法将聚合物与某一功能团共价结合，可改变聚合物的疏水性或亲水性、以及聚合物链的流动性和弹性，从而达到提高被包封药物稳定性、改善药物释放的目的。Zambaux等报道[8]，将PLA与单甲氧基聚环氧乙烷（MPEO）以一定比例（75/25）共价结合，再与PLA混合用复乳法制备具有抗凝作用的蛋白C微球，由于MPEO提高了PLA链亲水性、降低了PLA玻璃化转变温度，从而增加了PLA链流动性和弹性，而蛋白C的包封率又与聚合物中的疏水作用有关，所以按一定比例将PLA与PMEO-PLA混合作为膜材料制备微球，则既提高了蛋白C的包封率，又减少了水和蛋白C的扩散，从而减少了药物突释效应。_EPQ_
3.1.1加入稳定剂h _&3*O[`_
在内水相加入一定的非离子型表面活性剂（如PVA、Pluronic® F68、Poloxamer 188和311、土温20、司盘80等）能提高初乳的稳定性，防止乳滴合并，同时能抑制多肽或蛋白质在油水界面聚集，并减少突释效应。但这种稳定作用具有浓度依赖性：即减少内水相PVA浓度，药物包封率减小，突释效应增大。这可能是由于药物与PVA的相互作用增加，从而防止了药物溶解和扩散至外水相[13]。_sp4J_%_2b
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2、多肽及蛋白质类药物微球的制备P2S$Dk_<\X
2.1常用材料X=<_-rFW
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用于制备多肽或蛋白质类药物的微球材料主要有两大类：可生物降解聚合物（biodegredable polymer）和及生物粘附材料(bioadhesive material)。S_;_vE__ %
生物粘附材料是一类能对粘膜产生粘附作用的材料，主要有Carbopol®、脱乙酰壳多糖(chitosan)、羟丙基纤维素(HPC)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)等,这类材料主要用在口服及鼻腔给药的微球制剂。qn+_b__*4_
可生物降解聚合物是指一些能在水、酶作用下降解的高分子聚合物，包括天然和人工合成两类。前者包括明胶、葡聚糖、白蛋白、脱乙酰壳多糖、海藻酸钠、透明质酸钠等；后者主要有聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚乳酸聚氧乙烯嵌段共聚物（PELA）、聚丙稀酸酯（PEC）[6]等。其中应用最广泛、研究最多的是PLGA，它不仅具有生物相容性、无免疫应答和降解产物毒性小的优点，而且可通过调节两个单体比例(PLAGA)及聚合条件改变聚合物在体内降解速度的特点[7]，但其亲脂性强、对水溶性药物（包括多肽蛋白质及疫苗）的亲和力不高。PELA是一种新型的可生物降解聚合物，由PLA和PEG（5－50％）通过开环聚合反应制得。将亲水性的PEG链接到疏水性的PLA网状结构表面，提高了PLA对亲水性物质如多肽蛋白质等的亲和力，从而提高了这类物质的包封率、降低了药物的突释效应而获得稳定而持续的释放效果。l0_m\2Ttf
将多肽或蛋白质类药物包封在水凝胶中形成微粒，再通过一定方法制备微球。蛋白质被包封在水凝胶微粒中，既保护其在制备时免遭有机溶媒破坏，防止其向油水界面扩散，同时由于水凝胶微粒具有快速良好的溶胀性，能吸收大量含药水溶液，在释放时也避免了与疏水和周围酸性微环境接触，提高了蛋白质在制备和释放时的稳定性[20]。Woo等将牛血清白蛋白包封在羟乙基淀粉的丙烯酸酯（acHES）水凝胶中制成微粒，再与PLGA通过溶媒萃取/蒸发法制得的微球不仅态圆整、表面光滑、包封率高，而且提高了蛋白质活性，降低了突释效应[21]。j9___zK=eG
另外，将毫微粒的疏水性聚合物骨架上连接亲水性聚合物侧链，可大大提高多肽药物的吸收，这可能是由于亲水性聚合物能打开小肠上皮细胞间的紧密连接。'v"{frh_ _