第4章多肽与蛋白质类药物
多肽和蛋白质类药物的发展过程
多肽和蛋白质类药物的发展过程在20世纪60年代至70年代，科学家们开始关注多肽和蛋白质类药物的制备和分离技术。
同时，他们也开始研究多肽和蛋白质类药物的结构与功能之间的关系。
这一时期研究的重点是单一多肽和蛋白质类药物，如单链胰岛素和重组生长激素。
20世纪80年代是多肽和蛋白质类药物发展的一个重要转折点。
随着基因工程技术的发展，科学家们能够通过重组DNA技术生产大量的多肽和蛋白质。
这种技术的应用极大地促进了多肽和蛋白质类药物研究的进展。
在这一时期，重组胰岛素、重组生长激素和重组干扰素等药物相继问世。
20世纪90年代至21世纪初，多肽和蛋白质类药物的研究进入了一个全新的阶段。
科学家们开始发展更加复杂的多肽和蛋白质类药物，如抗体药物。
抗体药物通过靶向疾病相关的分子目标，实现治疗效果。
这种药物以其高度的专一性和生物活性在临床上取得了显著的效果。
近年来，多肽和蛋白质类药物的研究和应用迎来了新的突破。
科学家们通过改变多肽和蛋白质的结构，增强其稳定性和生物活性。
同时，他们还通过改变给药途径和剂型，提高多肽和蛋白质类药物的生物利用度和稳定性。
这些新的技术和方法为多肽和蛋白质类药物的发展提供了更多的可能性。
总的来说，多肽和蛋白质类药物的发展经历了多个阶段。
从最初的分离和制备技术到基因工程技术的应用，再到复杂多肽和蛋白质类药物的研发，多肽和蛋白质类药物在生物医药领域发挥着越来越重要的作用。
未来，随着科学技术的进一步发展，多肽和蛋白质类药物的研究和应用将迎来更大的突破。
多肽与蛋白质类药物
B. 对蛋白质类药物进行结构修饰
多肽、蛋白质类药物分类
3.3.1 反相高效液相色谱
3.3.1 反相高效液相色谱
分离机理：
①用C4～C8烷基作配基，将配基键合在固定基质上作为固定相 ，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流 动相（流动相极性大于固定相）。
②蛋白质分子中既有亲水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH 等），也有疏水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和-CH等）。
理论上，每公顷红花田可生产出1公斤人胰岛素原料药。
3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法
加拿大渥太华大学生物技术研究中心的科研人员也利 用另两种高产作物——烟草和水稻植株生产出了一种 名为“胰岛素样生长因子”(ILGF)的新型降血糖药物 。
据称，ILGF的降糖效果甚至优于常规口服降糖药。 如果ILGF能通过临床试验并成功上市，或将成为前景
3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法
加拿大SembioSys生物工程公司利用北美洲普遍栽培的高 产油料作物——红花作为转基因植物“平台”，成功生 产出“红花子来源人胰岛素”，
该胰岛素顺利通过动物实验与Ⅰ～Ⅱ期临床试验，其药 代动力学与药效学试验结果与美国礼来利用大肠杆菌表 述胰岛素基因生产的重组DNA人胰岛素基本一样。
多肽和蛋白质的物化性质
4. 变性 ➢ 天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下，
其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生 物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性， 称之为蛋白质的变性作用(denaturation)。 ➢ 变性蛋白质和天然蛋白质最明显的区别是溶解度降低
多肽和蛋白质药物口服吸收机制及策略的研究进展
在研究方法上，多肽和蛋白质药物口服吸收机制及策略的分析主要依赖于体 外实验、体内实验和数学模型等手段。体外实验包括对药物理化性质的分析、药 物在模拟胃肠道环境中的稳定性评估等；体内实验包括药代动力学分析、药物分 布和排泄等；数学模型则可以对药物吸收过程中的各种因素进行量化分析，有助 于深入理解吸收机制。
（1）调节细胞功能：多肽类药物可以调节细胞生长、分化、凋亡等过程， 从而达到治疗疾病的目的。
（2）抑制酶活性：一些多肽类药物可以抑制特定酶的活性，从而降低疾病 的发生和发展。
（3）调节免疫反应：多肽类药物可以调节免疫反应，包括细胞免疫和体液 免疫，从而达到治疗免疫相关疾病的目的。
3、多肽类药物的临床应用
在吸收机制分析方面，研究者们已明确了多种吸收途径，如淋巴途径、细胞 旁路途径和跨细胞途径等。这些途径在药物的吸收速度和程度上有着不同的影响。 例如，淋巴途径可以提高药物的生物利用度，而细胞旁路途径则可以迅速地将药 物分布到组织中。对于跨细胞途径，研究者们正在深入探讨其具体机制，以便为 药物设计和优化提供更多指导。
为确保口服蛋白多肽类药物制剂的稳定性，需在制剂制备过程中建立严格的 质量控制体系。一方面，要原料药的选取，保证原料药的质量和稳定性；另一方 面，要采用合适的制剂工艺和稳定剂，以延缓药物在储存和使用过程中的降解。 同时，应重视杂质的排除，防止其对药物疗效和安全性的影响。
临床试验是评价口服蛋白多肽类药物制剂疗效和安全性的关键环节。应遵循 国际通用的GCP（药物临床试验质量管理规范）原则，设立合理的试验方案，明 确评价标准，并采用适当的统计学方法进行分析。在试验过程中，要确保受试者 的权益和安全，同时密切不良反应的发生情况，以便对药物进行全面评估。
多肽类药物可根据其来源、功能和结构进行分类。根据来源，多肽类药物可 分为天然多肽、合成多肽和重组多肽。根据功能，多肽类药物可分为细胞因子抑 制剂、神经递质抑制剂、酶抑制剂等。根据结构，多肽类药物可分为环状多肽、 线状多肽和嵌合多肽。
多肽和蛋白质药物及核酸类药物的生产
化学合成
利用化学合成方法，合成多肽 或蛋白质。
分离纯化
通过各种分离纯化技术，如色 谱、电泳等，将目的多肽或蛋 白质从其他杂质中分离出来。
核酸类药物的生产工艺流程
基因克隆
将目的基因克隆到载体上，构建重组DNA分子。
转录与翻译
将重组DNA分子导入细胞或微生物中，转录并翻 译成目的核酸。
提取与纯化
通过各种提取和纯化技术，如离心、沉淀、色谱 等，将目的核酸从其他杂质中分离出来。
液相合成
直接在液相中合成核酸类药物，但操作较为繁 琐。
修饰与改造
对合成的核酸进行修饰和改造，以提高其稳定性和生物活性。
03 生产工艺流程与质量控制
多肽和蛋白质药物的生产工艺流程
01
02
03
04
基因工程
利用基因工程技术，将目的基 因导入细胞或微生物中，表达
并产生多肽或蛋白质。
细胞培养
通过培养细胞，使细胞大量增 殖并产生多肽或蛋白质。
基因工程方法生产多肽和蛋白质药物通常用于生产具有高生物活性、低免疫原性 和低毒性的蛋白质或多肽药物。这些药物可用于治疗各种疾病，如糖尿病、肝炎 、癌症等。
化学合成法生产多肽和蛋白质药物
化学合成法生产多肽和蛋白质药物是 通过化学反应将氨基酸或其他有机分 子连接在一起形成多肽或蛋白质的过 程。这种方法通常需要多个化学反应 步骤，并且需要精确控制反应条件和 纯化过程。
质量控制成本
为了确保核酸类药物的质量和安全性，需要进行严格的质量控制和检 测，这些质量控制和检测的成本也是生产成本的一部分。
市场前景与竞争格局分析
市场前景
随着生物技术的不断发展，多肽和蛋白质药物及核酸类药物的应用领域不断扩大，市场需求也在不断增长。未来， 随着新药研发的加速和新治疗方法的出现，多肽和蛋白质药物及核酸类药物的市场前景将更加广阔。
多肽类药物
多肽类药物多肽和蛋白质类生物药物按药物的结构分类可分为：氨基酸及其衍生物类药物、多肽和蛋白质类药物、酶和辅酶类药物、核酸及其降解物和衍生物类药物、糖类药物、脂类药物、细胞生长因子和生物制品类药物。
结构分析多肽的定性至少应包括氨基酸分析、序列分析及质谱分析。
纯肽的氨基酸分析可提供该多肽的氨基酸组成和数量。
序列分析则提供氨基酸残基的精确排列顺序。
基于多种技术的质谱, 如快原子轰击、电喷雾、激光解吸, 经常用于提供多肽的相对分子量及其序列信息。
肽谱是蛋白质或多肽通过酶解得到的肽片段经分离和分析所得到的“指纹图谱”。
当多肽含有20 个以上的氨基酸残基时, 肽谱分析对多肽结构研究和特性鉴别具有重要意义。
2. 1 氨基酸分析用于氨基酸分析的水解方法主要是酸水解, 同时辅以碱水解。
酸水解中使用最广泛的是盐酸(一般浓度为6mo löL )。
多肽于110 ℃真空或充氮的安瓿瓶内水解10～24 h, 然后除去盐酸。
水解过程中氨基酸遭破坏的程度与保温时间有线性关系, 因此该氨基酸在多肽中的真实含量可通过以不同的保温时间对相应时间的样品中该氨基酸的含量作图, 用外推法求出。
高氨基酸分析仪的使用使氨基酸的分析越来越准确, 如W aters 公司的氨基酸分析系统的检出限已达100 fmo l。
2. 2 序列分析氨基酸测序主要为化学法, 酶法也有一定的意义。
化学法以Edman 降解法最为经典, 它对所有氨基酸残基具有普适性和近乎定量的高产率, 是近50年N 2端顺序分析技术的基础。
Edman机理的液相(旋转杯) 自动蛋白顺序分析仪在1967 年推出。
近年来不断对其改进, 其灵敏度已达到可以对0. 1pmo l 的样品进行常规分析。
2. 3 质谱(mass spect romet ry,M S)质谱以质量分析为基础, 可提供化合物的分子量以及一些结构信息。
1980 年代以后发展了许多新的“软电离”技术, 使其在蛋白质多肽分析中的应用越来越广。
多肽、蛋白质类药物给药系统
多肽、蛋白质类药物给药系统摘要随着重组DNA技术的发展．基因工程肽和蛋白质药物的大规模生产已成现实，这类药物应用于临床的数量越来越多。
与传统的化学合成约物相比，其优点受到了广泛的关注，即与体内正常生理物质十分接近，更易为机体吸收，其药理活性高、针对性强、毒性低。
但由丁多肽、蛋门质类约物(1)分子质量大、稳定性高、易被胃肠道中的的蛋白水解酶降解；(2)生物半衰期短、生物膜渗透性差、生物利用度不高、不易通过生物屏障等，故其给药系统的研究一直足约剂学领域的一个热点。
许多学者曾尝试对肽类、蛋白质类约物进衍化学修饰、制成前体药物、应用吸收促进剂、使用酶抑制刺、采用离子电渗法皮肤给药以及设计各种给药系统解决上述问题．此炎药物一般注射给药，基本剂型足注射剂和冻粉针剂，常需频繁注射，患者顺从性差，且加重了患者的身体、心理和经济负担。
近年来，脂质体、微球、纳米粒等制剂新技术发展迅述歼逐渐完善，国内外学者将其广泛应用于多肽、蛋白质炎约物给约系统(drug deiivery system，DDS)的研究中，为此炎药物的临床应用铺平了道路。
本文就多肽、蛋白质类约物的给药系统及新技术进行综述。
主要介绍注射给药系统和非注射给约系统，及其下属几个分支。
重点介绍非注射给药系统。
关键字给药系统注射非注射l 新型注射给药系统1.1 控释微球制剂为了达到多肽、蛋白质类药物控制释放，可将其制成生物可降解的微球制剂。
目前已经实际应用的生物可降解材料主要有淀粉、明胶、葡糖糖、清蛋白、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PIGA)、聚邻酯、聚内酯和聚酐等；其中PLGA最为常用，改变乳酸乙醇酸的比例或相对分子质量，可得到不同降解时间的微球。
PLGA 微球相对于常规注射剂具有如下优点：(1)释药周期长，避免频繁给药；(2)使用安全；(3)药理作用增强；(4)避免发生明显的不良反应；(5)生物利用度显著提高。
1.2 脉冲式给药系统普通注射剂(疫苗、类毒素)一般至少接种3次，才能确保免疫效果，血药浓度波动大，且不能保证在疾病发作时相应的血药浓度。
13-2多肽与蛋白质类药物
下丘脑激素
甲状腺激素 胰岛激素 胃肠道激素
胸腺激素
表皮生长因子（EGF），转移因子（TF）， ），转移因子 （2）多肽类细胞生 表皮生长因子（EGF），转移因子（TF）， 心钠素（ANP）等。 长调节因子 心钠素（ANP） 骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、 （3）含有多肽成分 骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、 的其它生化药物 脑氨肽、蜂毒、蛇毒、胚胎素 胚胎素、 助应素、 脑氨肽、蜂毒、蛇毒 胚胎素、 助应素、 神经营养素、胎盘提取物、 提取物、 神经营养素、胎盘提取物、花粉 提取物、 脾水解物、肝水解物、心脏激素等。 脾水解物、肝水解物、心脏激素等。
二、多肽与蛋白质类药物的制造方法
蛋白质与多肽类药物的提取分离与纯化法 多肽与蛋白质的化学合成法 基因工程法
（ 一） 蛋白质药物
原料选择
发 酵 沉 淀
变性 复性
生物 组织 破碎 提取
上清液
蛋白质纯化 纯度 活性鉴定
合格 不合格
精品
1、原料选择
2、提取
3、分离纯化
纯化 根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。 根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。
1963年 固相合成（1963年R.B.Merrifield 创立，并因此获1984年获诺贝尔化学奖） 创立，并因此获1984年获诺贝尔化学奖） 1984年获诺贝尔化学奖
→将氨基酸的C-末端固定在不溶性树脂上，然后将此树脂 将氨基酸的C 末端固定在不溶性树脂上， 上几次缩合氨基酸，延长肽链，合成蛋白质。 上几次缩合氨基酸，延长肽链，合成蛋白质。
例如：人胰岛素（Insulin） 例如：人胰岛素
B30 A8 ;A10 ;B30 B28 ;B29 B28 A21 ;B31 ;B32 B30去除；B29修饰
多肽和蛋白质类药物
甲状腺激素 胰岛激素
胃肠道激素
胸腺激素
甲状旁腺激素（PTH）、降钙素（CT）
胰高血糖素、胰解痉多肽
胃泌素、胆囊收缩素－促胰酶素（CCK-PZ）、肠泌 素、肠血管活性肽（VIP）、抑胃素（GIP）、缓激 肽、P物质
胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子
4
多肽类药物分类
多肽类细胞生长调 表皮生长因子（EGF），转移因子（TF），心
意方法本身的回收率的高低。
12
纯化方法选择指南
13
END
谢谢大家！
粘蛋白
胃膜素、硫酸糖肽、内在因子等。
胶原蛋白 碱性蛋白质
明胶、阿胶等 硫酸鱼精蛋白
蛋白酶抑制剂
胰蛋白酶抑制剂
凝集素
PHA、ConA
7
多肽与蛋白质类药物的制造方法
重点
提取分离纯化法（重点） 化学合成法
微生物发酵法
蛋白质药物
重点
原料选择
发酵
沉淀
变性 复性
上清
生物 组织 破碎 提取
蛋白质纯化
纯度 活性鉴定
合格
不合格
精品9
原料选择 提取
重点
10
纯化 根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。
1.根据蛋白质的pI的不同进行纯化，其方法有：
1）pI沉淀法
2）pI沉淀法与盐析法相结合
3）等电聚焦法
2.蛋白质分子形状和大小的不同进行纯化，其方法有
1）凝胶过滤
2）超滤法
3） 离心法
4）透析法
3.蛋白质的溶解度不同进行纯化，其方法有：
a)盐溶与盐析法
b）结晶法
c）有机溶剂沉淀法
4.蛋白质电离性质不同进行分离：离子交换法 5.蛋白质功能专一性不同进行纯化：亲和层析法 6.蛋白质在溶剂系统中分配不同进行纯化：萃取法 7.蛋白质的选择性吸附的性质进行纯化：吸附法 8.蛋白质的其他特殊性质进行纯化
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
多肽与蛋白质类药物
第一节 多肽及蛋白质类药物的生产方法 第二节 多肽类药物 第三节 蛋白类药物
多肽与蛋白质类药物
第一节 多肽及蛋白质类药物的生产方法
1.蛋白质类药物的分离纯化
2.多肽与蛋白质的化学合成
3. 基因工程法
第二节 多肽类药物
第三节 蛋白类药物
多肽与蛋白质类药物
（五）纯度检查
确定protein 的纯度标准一般为： 分子大小是否均一，电荷是否均一，是否
具有恒定的氨基酸组成，是否具有单一的N 端和C端残基，能否结晶，进一步纯化时生 物活性是否有所提高等。
（五）纯度检查
常用蛋白质纯度检查的方法有： 1．HPLC或FPLC 2．电泳均一性 3．免疫化学法 4．生物测定法 5. 分光光度法：A280/A260为1.75
1982年第一个基因重组产品--人胰岛素
优点：①可以大量生产过去难以获得的生 理活性蛋白和多肽；②提供足够数量的生 理活性物质，以便对其进行深入研究，扩 大应用范围；③生理活性物质作为药物使 用时存在的不足之处，可以通过基因工程 和蛋白质工程进行改造和去除；④利用基 因工程可获得新型化合物，扩大药物来源。
9．根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质。 SOD
（四）溶液中蛋白质浓度的测定
1. UV法 （1）280nm光吸收法 （2）280nm和260nm的吸收差法
蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280-0.74A260 2. 双缩脲法:540nm 3. 福林-酚试剂法:750nm 4. 考马斯亮蓝G-250染色法:595nm
（一）材料选择
原料来源包括动物、植物及微生物等。选 择原料时应考虑来源丰富、目的物含量高、 成本低且易于提取的材料。
同时应考虑其种属、发育阶段、生物状态、 来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌 或细胞等因素的影响。
㈡提取
是分离纯化的第一步，是将目的物从复杂 的生物体系中转移到特定的人工液相体系 中。提取的总要求是最大限度的把有效成 分提取出来，关键是溶剂的选择。
多肽在生物体内的浓度很低，在血液中一般 为 1010 ~ 1012,m但ol它/ L们的生理活性很强，在调 节生理功能时起着非常重要的作用。
概述
活性多肽主要是从内分泌腺、组织器官、分泌细 胞和体液中产生或获得的。
1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽——催产素（OT）。 到了60、70年代神经肽的研究进入高潮。同时，由于很多脑活性肽
促皮质素（ACTH），促黑激素（MSH） ② 下丘脑激素：
促甲状腺激素释放激素（TRH），生长素抑制激素 （GRIF） ③ 甲状腺激素：
甲状旁腺激素（PTH），降钙素（CT）。 ④ 胰岛激素：
研究活性多肽结构与功能的关系及活性多肽之间结构的异 同与其活性的关系 , 将有助于设计和研制新的活性多肽药 物。
临床上有一些确有疗效的组织提取制剂其有效成分有的还 不十分清楚，从活性肽或细胞生长调节因子的角度去研究 它们的物质基础和作用机制，预计可获得成效
主要多肽类药物
1．多肽激素 ① 垂体多肽激素：
多肽与蛋白质的化学合成
多肽合成可以验证一个新的多肽的结构； 设计新的多肽，用于研究结构与功能的关 系；为多肽生物合成反应机制提供重要信 息；也是多肽药物制备的有效方法。
多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程， 合成一般从C端向N端进行。
固相法合成多肽省时、省料、便于计算机 控制、便于普及推广
主要步骤：
第一节 多肽及蛋白质类药物的生产方法 第二节 多肽类药物
1.概述 2.主要多肽类药物 3.主要多肽类药物制备 第三节 蛋白类药物
多肽与蛋白质类药物
第一节 多肽及蛋白质类药物的生产方法 第二节 多肽类药物 第三节 蛋白类药物
1.概述 2.主要蛋白质类药物的制备
蛋白质类药物的分离与纯化
（一）材料选择 （二）蛋白质提纯的一般方法 （三）蛋白质的分离和纯化 （四）溶液中蛋白质浓度的测定 （五）纯度检查
也存在于胃肠道组织中，从而推动了胃肠道激素的研究. 到了70年代，生物技术的发展更开拓了多肽药物的新领域——细胞
生长调节因子。现已发现的细胞生长调节因子已近100种.
概述
许多活性蛋白质和多肽都是由无活性的蛋白质前体，经过 酶的加工剪切转化而来的。它们中间许多有共同的来源， 相似的结构，甚至还保留着若干彼此所特有的生物活性。
多肽类
概述
由氨基酸缩合而成的化合物称为多肽，它 们是通过一个氨基酸分子的-NH与另一分子 氨基酸的-COOH脱去一分子水形成-CONH-键而相互连接起来的。
概述
一般将50或50个以下的氨基酸残基组成的化 合物，列入多肽。多数无特定空间构象，某 些多肽也有一定构象，但其构象的坚固性远 不如蛋白质，其构象的浮动性很大。
⑴基团保护：把不应与接肽试剂发生作用 的官能团，加以封闭和保护。肽链形成之 后，再将保护剂去除。
⑵肽的合成：液相合成 固相合成
⑶合成肽链的纯化
基因工程法
基因工程技术就是将重组对象的目的基因 插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构 成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并 使目的基因在工程菌内进行复制和表达的 技术。
选择标准：首先对制备物有最大的溶解度， 并在提取中尽可能减少一些不必要的成分。
㈢蛋白质提纯的一般方法
1．根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质。 2．根据蛋白质分子形状和大小不同来纯化蛋白质。
㈢蛋白质提纯的一般方法
3．根据溶解度的不同来纯化蛋白质。 4．根据电离性质的不同来纯化蛋白质。
对蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换纤维 和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等 为骨架的离子交换剂，主要是取其具有较大的蛋白 质吸附容量，较高的流速和分辨率等优点。
㈢蛋白质提纯的一般方法
5．根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质 亲和层析法 固相化金属亲和层析：干扰素、胃肠道多肽
6．根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来 纯化蛋白质。
7．根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋 白质
㈢蛋白质提纯的一般方法
8．根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋 白质。