单克隆抗体的发明过程
抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法[发明专利]
![抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/18fd62c13169a4517623a389.png)
专利名称：抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法
专利类型：发明专利
发明人：张宇霞,连晓雯,李儒,杜惠芬,李克生,武星,裴瑞萍,宋海珍
申请号：CN201510066124.4
申请日：20150209
公开号：CN104650223A
公开日：
20150527
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：⑴制备免疫接种的小鼠；⑵骨髓瘤细胞培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；⑶将脂环酸芽孢杆菌向免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且获得脾细胞，经分散脾细胞得到脾细胞沉淀物；⑷培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心得到骨髓瘤细胞沉淀物；⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮脾细胞沉淀物、骨髓瘤细胞沉淀物并混合，经离心得到沉淀物；⑹沉淀物离心、悬浮，即得融合细胞；⑺将融合细胞进行培养、测定，确定杂交瘤细胞；该杂交瘤细胞进行克隆、筛选得到杂交瘤细胞系；⑻制备单克隆抗体：将杂交瘤细胞系按常规方法进行单克隆抗体生产即得。
本发明快速、特异性高。
申请人：甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心
地址：730010 甘肃省兰州市城关区南河路2168
国籍：CN
代理机构：兰州中科华西专利代理有限公司
代理人：李艳华
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单克隆抗体和基因工程抗体
疾病诊断和治疗
基因工程抗体可以用于疾病的 诊断和治疗，如肿瘤免疫治疗 、自身免疫性疾病治疗等。
药物研发
基因工程抗体可以作为药物研 发中的靶点筛选、药物设计和 优化等环节的重要工具。
基因工程抗体的优缺点
优点
基因工程抗体具有高度的特异性和亲和力，能够针对特定抗原进行高灵敏度检测和靶向治疗；同时， 基因工程抗体可以通过基因工程技术进行改造和优化，提高其稳定性和功能。
抗体的分类和发展历程
天然抗体
由免疫系统自然产生的抗体，类型多样，特异性各 异。
单克隆抗体
通过杂交瘤技术制备的单一抗体，具有高度特异性 ，可用于治疗和诊断。
基因工程抗体
利用基因工程技术改造的抗体，如人源化抗体、小 分子抗体等，具有更好的治疗潜力和应用前景。
抗体的分类和发展历程
单克隆抗体技术最初诞生于20世纪70年代，由两位科学家Kohler 和Milstein发明。该技术通过将具有特定抗体的B淋巴细胞与骨髓 瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而筛选出能够持续稳定产生单 一抗体的细胞系。单克隆抗体在临床治疗和诊断领域发挥了重要 作用，如治疗癌症、自身免疫性疾病等。
100%
生物治疗
用于治疗肿瘤、自身免疫病、感 染性疾病等，通过与药物结合或 直接作用于靶点发挥作用。
80%
免疫学研究
用于研究免疫应答机制、细胞信 号转导等。
单克隆抗体的优缺点
优点
高度特异性、易于制备和纯化、 可大量生产、稳定性好等。
缺点
制备过程复杂、成本高、可能引 发免疫反应等。
03
基因工程抗体
挑战
机遇
单克隆抗体和基因工程抗体的研发和生产成 本较高，同时存在免疫原性和副作用等问题， 需要进一步研究和改进。
单克隆抗体的应用及其发展
单克隆抗体的应用及其发展摘要：1975 年德国学者Kohler 和英国学者Milstein 发明了杂交瘤技术。
他们成功地将骨髓瘤细胞和产生抗体的B 淋巴细胞融合为杂交瘤细胞，这种合成的杂交瘤细胞稳定、有致瘤性、能产生抗体，其分泌的抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，故称之为单克隆抗体(简称单抗)。
自从鼠源单抗之后，单抗历经了鼠源性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人源性抗体4 个发展阶段。
近年来随着分子生物学和细胞生物学的发展，单克隆抗体的应用已日益普及，单抗理论几乎应用到生物学研究的每一个区域。
单克隆抗体制备技术的发展也就显得尤为重要。
关键词：单克隆抗体、应用、发展趋势一、单克隆抗体的应用自1975年Kohler和Milstein报道，通过细胞融合建立能产生单克隆抗体的杂交瘤技术以来，这个最基础的具有开创性的理论在生物科学的基础研究以及医学，预防医学，农业科学等领域的广泛应用和实践，充分显示它对生命科学各领域产生的巨大而深远的影响，由于单抗有着免疫血清或抗体无法比拟的优点，迄今全世界已研制成数以千计的单抗，有的已投入市场，有的正在进行应用考核和深入观察。
1.1 单抗在诊断学中的应用单抗应用最广泛的是诊断，主要用于病原诊断，病理诊断和生理诊断，随着微生物学，寄生虫学，免疫学的研究进展，人类对感染性和寄生虫性疾病有了新的认识，一个病原体存在着许多性质不同的抗原，在同一抗原上，又可能存在许多性质不同的属，种，群，型特异性抗原，采用杂交瘤技术，可以获得识别不同抗原或抗原决定簇的单抗，从而可以对感染性疾病和寄生虫病进行快速准确的诊断，同时可以用于调查疾病流行情况，流行毒株或虫株的分类鉴定，为病原的防疫治疗提供资料。
目前应用单抗诊断试剂诊断的人，畜禽，植物等病毒、细菌或寄生虫病已上百种，其中乙肝，狂犬病，乙型脑炎等人兽共患病三十余种；鸡新城疫，马立克，猪瘟等畜禽病二十余种；植物病毒病十余种；人，畜禽细菌病二十余种，弓形虫、疟疾、旋毛虫等寄生虫病三十余种.另外，单抗还成功应用于含量极微的激素、细菌毒素、神经递质和肿瘤细胞抗原的诊断。
单克隆抗体
1.历史：1.1免疫学起源于中国。
远在唐代开元年间（公元713~741年），中国古代医师便发明了用人痘苗预防天花。
1.2发展1.2.1第一代抗体——多克隆抗体制备技术1890年德国学者贝苓（Behring）和日本学者北里在Koch研究所首先从抗原被动免疫后获得的免疫血清中发现，即多克隆抗体。
1891年，贝苓用动物抗血清成功地治疗了一个白喉患者，这是世界上第一次用人工被动免疫方法治疗病人的事例。
为此，他在1901年获得了诺贝尔奖。
1.2.2第二代抗体——单克隆抗体制备技术50年代末，Burnet创立了“细胞系选择学说”。
该学说认为，每个B淋巴细胞有独特的受体，只能接受某种抗原决定簇的刺激。
这一理论的确立为随后建立的第二代抗体制备技术奠定了理论基础。
两大技术的基础：一是1958年Nossal和Littleflel创建的“细胞融合技术”，一是1962年Potter和Boyce 建立的“人工诱导浆细胞瘤技术”。
于是，1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体技术。
1.2.3第三代抗体——基因工程抗体制备技术：1973年DNA重组技术或称基因工程技术的建立，被认为是20世纪生物学的一项最伟大的成就，这一技术被很快渗透到生命科学的各个领域。
进入80年代，日本学者Tonegawa利用基因工程技术首先成功地克隆了免疫球蛋白的V区和C区基因，并证明了B淋巴细胞发育中的基因重排现象，为基因工程抗体的制备奠定了基础，因而于1987年获得了诺贝尔奖。
1984年，美国学者Morrison等制备和表达成功第一个基因工程抗体——人鼠嵌合抗体，开创了制备基因工程抗体的先河。
2.单克隆抗体2.1定义：是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。
2.2一般过程：通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。
单克隆抗体的制备
第十一章单克隆抗体的制备1975年Kǒhler和Milstein首先报道用细胞杂交技术使经绵羊红细胞（SRBC)免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,建立起第一个B细胞杂交瘤细胞株,并成功地制得抗SRBC的单克隆抗体（monlclonalantibody,McAb）。
迄今世界已研制成数以千计的McAb。
单克隆抗体的理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制，并且来源容易，所以一问世便受到欢迎和重视。
在医学领域中，McAb在诊断疾病、判断预后、防治疾病以及疾病机制研究等方面起着巨大的促进作用。
为此，两位发明者于1984年获得诺贝尔医学奖。
第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠细胞作小鼠骨髓瘤细胞。
脾淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长（选择原理后见），小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
其原理从下列几个主要步骤阐明。
（一）细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的碑细胞。
脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。
选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。
目前常用的B细胞瘤株有：P3-X63-Ag8(KǒhlerandMilstein，1975)，P3-NSI/1-Ag4-1(KǒhlerandMilstein，1976)，X63-Ag8.563(Kearneyetal，1979)，Sp2/0-Ag14(Schulmanetal，1978)等，这些细胞株皆为HAT敏感细胞株。
制备单克隆抗体的原理
制备单克隆抗体的原理
单克隆抗体是一种高度特异性的抗体，可以识别并结合到特定的抗原上。
制备
单克隆抗体的原理主要包括抗原免疫、细胞融合、筛选和鉴定等步骤。
首先，制备单克隆抗体的第一步是抗原免疫。
通常选择小鼠或兔子等动物作为
免疫动物，将目标抗原注射到动物体内，激发动物产生特异性抗体。
在免疫过程中，抗原会激发动物体内的B细胞产生抗体，其中包括对抗原特异性的B细胞。
接下来是细胞融合。
将免疫动物体内的B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞具有B细胞产生抗体的能力，同时又具有骨髓瘤细胞
的无限增殖能力，从而可以长期稳定地产生单克隆抗体。
随后是筛选和鉴定。
通过细胞培养和克隆技术，筛选出产生特定单克隆抗体的
杂交瘤细胞，并将其进行扩增。
接着，利用ELISA、Western blot等方法对单克隆
抗体进行鉴定，确定其对目标抗原的特异性和亲和力。
最后是大规模生产。
经过筛选和鉴定的单克隆抗体细胞株可以进行大规模的培
养和生产，以满足科研和临床的需求。
总的来说，制备单克隆抗体的原理是通过抗原免疫、细胞融合、筛选和鉴定等
步骤，最终获得特异性的单克隆抗体。
这种单克隆抗体在生物医学领域具有广泛的应用前景，可以用于疾病诊断、药物研发、免疫治疗等方面，对于促进医学科研和临床应用具有重要意义。
单抗制备流程
单抗制备技术原理和流程单克隆抗体简单回顾机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌一组能与抗原特异性结合的免疫球蛋白，即抗体。
抗原上可以引起机体产生抗体的结构叫做抗原决定簇，或者抗原表位，一个抗原可以有多个不同的抗原表位。
由单一B淋巴细胞产生仅识别某一特定抗原表位的抗体为单克隆抗体。
由多种B 淋巴细胞产生，识别多个抗原表位的抗体被称为多克隆抗体。
图1. 抗原表位与抗体分子的特异性结合。
单克隆抗体的特点特异性高：单抗特异性太高，以至于无法跨物种应用。
抗体组成：仅有一种抗体亚型组成，比如IgG1、IgG2、IgG3。
批次差异：和多抗一样，容易产生批次间差异。
实验检测：由于单抗特异性高，因此检测时，产生的背景更少，结果重现性。
抗原变异：但是相比于多抗，单抗对微小抗原变化（如轻微变性、糖基化异质性、多态性）的包容性更弱。
但可以通过合并靶抗原相同的两种及以上抗体进行补偿。
抗体制备：对制备技术要求高，制备杂交瘤细胞的时间较长，花费更高，制备周期更长。
单克隆抗体的应用1.分析抗原的细微结构及探测抗原的特定结构域；2.可用于分离、特征化及纯化特定分子抗原；3.产品可直接用于临床诊断和治疗，或用于以单抗为弹头的“生物导弹”药物，直接导向肿瘤等。
单克隆抗体的制备单抗制备的方法主要包括杂交瘤技术和展示抗体库技术。
实验室主要用杂交瘤技术，而大规模生产中主要用杂交瘤技术或者展示抗体库技术。
抗体库技术的要求更高，制备时间更短，易于人源化，因此更适合规模生产。
杂交瘤技术发展多年，颇受认可，实验操作较为简单，可生产特异性强的单抗，因此在大多数实验室中应用。
1. 杂交瘤技术关于杂交瘤技术，我们已经开展过几次专题解读，这里不再赘述。
您可以移步查看下列文章：杂交瘤技术简述及基本原理杂交瘤细胞系如何建立杂交瘤筛选—选择培养基筛选杂交瘤筛选—特异性抗体筛选杂交瘤细胞克隆方法图2. 杂交瘤技术制备单克隆抗体原理示意图。
2. 抗体库技术抗体库技术是在已知抗体基因序列的前提下，将基因序列克隆到相应载体（比如噬菌体，哺乳细胞等），进行重组抗体的表达。
凝集性卡他莫拉菌单克隆抗体及其制备方法和应用[发明专利]
专利名称：凝集性卡他莫拉菌单克隆抗体及其制备方法和应用专利类型：发明专利
发明人：康业,王羽,吴培钿,何小维,黄幼珍
申请号：CN201811320776.6
申请日：20181107
公开号：CN111157735A
公开日：
20200515
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种凝集性卡他莫拉菌单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)获取非凝集性卡他莫拉菌，进行常规的培养，得菌液，将所述菌液在冰浴中超声破碎，收集上清液，得耐受原；
(2)获取凝集性卡他莫拉菌，进行常规的培养，得菌液，将所述菌液在冰浴中超声破碎，收集上清液，得免疫原；(3)耐受阶段：采用所述耐受原对小鼠进行初次免疫，并在10±2min、24±1h、48±1h分别腹腔注射环磷酰胺(Cy)，测定效价；(4)免疫阶段：小鼠耐受后，采用所述免疫原和免疫佐剂继续免疫小鼠，测定效价，再进行杂交瘤细胞融合，即得凝集性卡他莫拉菌单克隆抗体。
该抗体纯度高、亲和力强、特异性高。
申请人：广州万孚生物技术股份有限公司
地址：510663 广东省广州市萝岗区科学城荔枝山路8号
国籍：CN
代理机构：广州华进联合专利商标代理有限公司
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单克隆抗体产生
克隆的成熟发展
抗体产生机制的发现
细胞融合技术的逐渐成熟
克隆
1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物 可能性”的演讲上采用“克隆 (Clone)”的术语。科学家把人 工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克 隆技术” 第一个时期是微生物克隆时期
第二个时期是生物技术克隆时期
第三个时期是动物克隆时期
抗体
1890年德国学者Behring（贝苓）和日本学者北里用白喉外毒 素免疫动物时发现，在被免疫的动物血清中有一种能中和外毒 素的物质，称为抗毒素。将此免疫血清被动转移给正常动物， 使后者获得了中和外毒素的能力。同年 Behring 又与Kitasato 将白喉抗毒素正式用于白喉的治疗，开创了人工被动免疫疗法 之先河。为此，Behring 于 1901年获得诺贝尔医学和生理学 奖。后来，人们相继发现了凝集素、沉淀素等能与细菌或细胞 特异性反应的物质，统称为抗体；而将能引起抗体产生的物质 称为抗原，从而确立了抗原和抗体的概念。
乔治斯·克勒 1946年生于西德慕尼黑，在西德的弗莱堡大学攻 读生物学。后到英国医学研究院生物学研究所的米尔斯坦研究 室留学。 1976年至1984年在巴塞尔免疫研究所工作。1984年 起在马克斯.普朗克免疫学研究所从事研究工作，1986年起在弗 莱堡大学担任教授，1995年因肺炎逝世。享年48岁。他是最年 轻的诺贝尔生理学及医学奖金得主，获奖时年仅38岁。
1962年，日本科学家发现日本血凝型病毒能引起艾氏腹水瘤细 胞融合的现象。 1965年，英国科学家进一步证实了灭活的病毒在适当的条件下 也可以诱发动物细胞融合。
单克隆抗体发明人
色萨·米尔斯坦 是一位阿根廷籍和英国籍的分子生物学家。出生 于阿根廷的巴伊亚布兰卡（Bahia Blanca）。他于1952年毕业 于布宜诺斯艾利斯（University of Buenos Aires），并于 1957年获得了博士学位。1958年，他依靠英国议会奖学金开 始在英格兰剑桥大学研究生物化学，并于1960年获得了第二个 哲学博士学位。究出一种技术把鼠细胞和人细胞聚合， 产生一种称为“杂种瘤”的细胞，然后让这种鼠细胞进行天性 繁殖，也就是诱发产生大量抗感染的抗体。这项技术是“七十 年代生物医学方面最重要的一项方法论进展”。他们从事的遗 传工程研究能导致对从癌到感冒等疾病的治疗方法。他们从事 免疫系统的研究和“发现生产单克隆抗体的原理”做出了卓越 的贡献。
因而同丹麦医学家耶恩共同获得了1984年诺贝尔生理学及医学 奖金。
单克隆抗体问世以来，由于其独有的特征已迅速影响应用于医 学很多领域。主要在以下几个领域。
1．检验医学诊断试剂
2．蛋白质的提纯
3． 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术
问题
研究单克隆细胞抗体是否有初衷？如果有的话是什么？
1975年丹麦学者耶恩（N.K.Jerne，1911～）创立了天然抗体 选择学说及免疫系统的“网”学说，从而阐明了抗体产生的机 制。
细胞融合
20世纪30年代，科学家们相继在肺结核，天花，水痘，麻疹等 疾病患者的病理组织中观察到多核细胞。 20世纪70年代，科学家们在蛙的血细胞中也看到了多核细胞的 现象，但是当时科学发展水平的限制，没有给予足够重视。