label free 蛋白组织学定量流程
proteome discoverer对label free数据的定量原理-概述说明以及解释
proteome discoverer对label free数据的定量原理-概述说明以及解释1.引言1.1 概述：Label Free技术是一种用于蛋白质组学研究的重要方法，它可以在不标记样本的情况下进行定量分析，节省时间和成本。
Proteome Discoverer是一款功能强大的蛋白质组学数据分析软件，能够对Label Free数据进行高效准确的定量分析。
本文将着重探讨Proteome Discoverer对Label Free数据的定量原理及其在蛋白质组学研究中的意义。
通过深入了解这些内容，我们可以更好地理解Label Free技术的工作原理，为未来在生物医学研究领域的应用提供有力支持。
1.2 文章结构本文将分为引言、正文和结论三部分。
在引言部分中，将简要介绍Proteome Discoverer软件和label free数据分析的背景和意义，明确本文的研究目的。
在正文部分，将详细介绍Proteome Discoverer软件的基本情况，包括其功能和特点；同时，将深入探讨label free数据分析的原理，包括原理的基本概念和技术实现方式；最后，将介绍label free数据的定量方法，包括其在生物学研究中的应用和局限性。
在结论部分，将对本文的主要内容进行总结，讨论Proteome Discoverer对label free数据的定量原理在生物学研究中的应用前景，并展望未来的研究方向。
整体结构清晰，层次分明，旨在全面探讨Proteome Discoverer对label free 数据的定量原理，为相关领域的研究提供参考和借鉴。
1.3 目的本文旨在探讨Proteome Discoverer对label free数据的定量原理，通过深入分析Proteome Discoverer软件的功能和label free 数据的分析原理，揭示其在蛋白质组学研究中的重要性和应用价值。
通过本文的研究，我们旨在帮助读者深入了解Proteome Discoverer在label free 数据分析中的作用和方法，为蛋白质组学研究提供更加精准和可靠的数据分析手段，促进该领域的发展和进步。
label free 定量原理 肽段 蛋白-概述说明以及解释
label free 定量原理肽段蛋白-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容可以包括以下内容：概述随着科学技术的不断进步，生物学研究领域的技术也在不断发展与创新。
其中，标签无依赖定量技术（label free技术）在近些年中备受关注和重视。
这项技术可以在不添加任何化学标记的情况下，对生物样本中的分子进行定量分析，具有高灵敏度和准确性的特点。
在这篇长文中，我们将详细介绍label free定量原理及其在蛋白质研究中的应用。
文章结构本文分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分将对label free定量原理、肽段和蛋白的重要性进行概述和介绍。
正文部分将详细阐述label free技术的概述和定量原理，以及肽段和蛋白在生物研究领域的应用。
最后，结论部分将对本文进行总结，并展望未来label free技术在生物研究中的发展前景。
目的本文的目的是介绍label free定量原理以及肽段和蛋白在生物研究中的应用。
通过对label free技术的概述和定量原理的详细解析，读者将能够了解到这项技术的原理和特点。
而对于肽段和蛋白的介绍，将展示它们在生物研究中的重要性和应用领域。
通过阅读本文，读者将能够全面了解label free技术、肽段和蛋白在生物研究中的作用，为相关领域的研究提供参考和指导。
1.2文章结构文章结构部分的内容可以按照以下方式编写：文章结构：本文将按照以下结构进行讨论。
首先在引言部分，我们将对label free 定量原理、肽段和蛋白进行简要介绍。
然后，在正文部分，我们将详细探讨label free定量原理、肽段及其在生物研究中的应用以及蛋白的结构、功能以及其在生物研究中的重要性。
最后，在结论部分，我们将对全文进行总结，并展望未来可能的研究方向。
通过这样的文章结构，读者可以系统地了解label free定量原理以及肽段和蛋白在生物研究中的重要性和应用。
同时，文章结构的清晰性也可以帮助读者更好地理解和掌握相关知识。
iTRAQ、TMT、Label-Free
百泰派克生物科技iTRAQ、TMT、Label-Free研究蛋白质含量的技术主要分为标记和非标记两种策略，其中iTRAQ和TMT为体外标记蛋白定量，Label-Free为非标记定量技术。
iTRAQ/TMT/Label-Free是三种不同的蛋白定量技术：iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）即同位素标记相对和绝对定量技术。
iTRAQ技术通过同位素标记来实现蛋白质定量研究，经水解的蛋白质多肽N末端或赖氨酸侧链基团可以被同位素标记，通过高精度质谱仪串联分析，可同时对最多8个样品进行鉴别和定量。
利用iTRAQ技术一次实验可实现多达8个样品蛋白质的高通量鉴定和定量，且该技术是在肽段水平上进行的体外标记，没有物种特异性限制，理论上可用于所有物种的蛋白质定量研究。
TMT（Tandem Mass Tag）中文名串联质量标签，其原理与iTRAQ基本相似，利用氨基酸N末端和赖氨酸残基与试剂标签之间形成共价结合实现对多肽的标记，然后通过串联质谱获得的离子峰强度和离子峰质荷比进行蛋白质的定性和定量分析。
一次TMT最高可同时标记16种不同的生物样品，与iTRAQ相比，TMT的通量更高；TMT报告基团间最小分子质量差为6/1000Da，iTRAQ报告基团间最小分子质量差为1Da，因此TMT比iTRAQ具有更高的分辨率，降低了实验误差。
Label Free蛋白定量技术，是将未标记的样品蛋白进行酶解，再将酶解得到的肽段进行质谱分析，利用质谱分析软件对质谱数据进行分析以计算蛋白质的含量。
可通过一级质谱得到的肽段峰强度、肽段峰面积以及液相色谱保留时间等数据信息来进行样品蛋白的定量分析。
Label Free无需使用昂贵的试剂标签就可以对样品进行高通量的定量分析，投入产出比较高。
此外，在鉴定蛋白质翻译后修饰时，->A:/label-free.html。
蛋白质谱数据label-free quantitation
Label‐free Quantitation Discover the significantlychanging features in your dataChengpin ShenCloudscientific4/27/2013Quantitation Method基于MS1 的非标记定量•计算来自于多次实验重复中校正得到的同一肽段丰度(Area under Curve) ; (即Match between Runs 方法)•可以比较多次生物学、技术重复性或者多组样品的差异•基于内标情况结果可以辅助进行绝对定量MS1Area + Isotopic Distribution = Abundancem/zRTRTm/z为何MS1 LFQ 比Spc 更复杂?•多次重复间校正（非常重要！）•归一化•MS1谱峰识别和丰度计算Alignment in different runs Normalization AUC CalcTime windowalignment in one run AUC CalcNormalizationVisualization of TIC+m/zRT RTm/zVisualization of TICMS1Area + Isotopic Distribution = Abundancem/zRTRTm/zMS1 LFQ可视化定量结果(Progenesis LC‐MS)质控•对于谱图鉴定来说，我们只需要考虑：1.二级碎裂效率;2.母离子峰强;3.扫描速度(MS2量越多, 鉴定的越多);4.分辨率(精度越高越准确)•而对于MS1非标定量来说，我们还需要确保:1.ESI喷雾连续性;2.样品中尽可能的不含有盐、PEG等污染物;3.MS1谱峰半峰宽尽可能一致;4.MS1的分离效率尽可能的好；5.采用精确校正的高分辨质谱(峰型良好的同位素峰分布)其他定性定量方法其实一样适用，不过经常会被忽略A good MS1Sample for quantitationData from Chengpin Shen Mol Biosystems 2012Replicate 1Replicate 2Replicate 3ESI 喷雾连续;盐污染少; 没有PEG 污染;保留时间窗口<1min;谱峰分离效果好(15min ‐75min of 90min LC) ;A good MS1Sample for quantitationCV range02040608010012014016018020005001000150020002500Maximum CVAverage 11.58%RT window avg 0.9minMS1 LFQ数据的质控案例•本例中两次重复试验其中一次ESI喷雾不连续:m/ztMS1 LFQ 数据的质控案例•本例中左图数据喷雾不连续、且含有PEG 污染，右图盐污染、空气峰强度较高:•Proper separation setup;m/z tm/ztMS1 LFQ数据的质控案例•保留时间窗口过宽，分离效果差，高丰度蛋白可能没有去干净，或者色谱柱填充有问题m/zt 26.0min 35.0minRT Window = 10minutesMS1 LFQ 数据的质控案例•分离梯度设置不佳，导致分离效率较低m/zt45.0minWhy is MS1 LFQ complex?•Data alignment •Normalization •Abundance CalcAlignment in different runs Normalization AUC CalcProgenesis LC ‐MS 谱峰校正原理•自动选择最佳“reference”样本作为校正的标准. •其他样本以此为标准进行保留时间对齐•依次对齐后，所有谱峰均能进行定量“overlay”reference scanother scanProgenesis LC‐MS 谱峰校正原理reference scanpeptide signalsother scanProgenesis LC‐MS 谱峰校正原理自动找到的对齐坐标• Progenesis会自动找到一系列“对齐坐标”用以将每个样本中的相同信号进行对齐Progenesis LC‐MS 谱峰校正原理单独的各个样本• 在校正之后, 分布模式相同的谱峰将进行共识别Co‐detection of dataNo expression change Small expression changeLarge expression change数据识别可以应用在2个甚至200个样本之间识别共流出肽段蓝色区域标明了该肽段的 所有同位素分布及丰度红色区域标明了共流 出肽段的丰度分布情 况Co‐detection of datapeptide ion identified in one sample, comparable across allNo missing data!Identification can be confirmed by any other sample(s)Analyse complex samplesInclusion listsMS Peptide QuantificationLocate peaks of significant expression behaviourAlignmentPeptide separation and RT shift correction MS‐MS IdentificationPeptide fragmentation“Protein” QuantificationResultsLC‐MS data alignment algorithms corrects for the positional bias introduced by the LCCo‐detection and relative quantification of all peptide ions and statistical tools to define subsets of experimental interestIntegration with search engines to identify peptide ions. Create inclusion lists for repeat analysis of peptides unidentified. Combining of all data at the protein level and calculation of the protein quantificationAnalyse fractionated samplesAnalysis of Each FractionReduce sample complexity but quantify more runsRecombine FractionsNormalise across fractions to see global viewProtein ViewQuantification & identification at the protein level View Peptide DataDelve into underlying peptide informationInclusion lists定量结果是否进行谱图校正的效果比较Progenesis AligenmentControl 1 _DNLTLWTSDIpS 441191 EDAAEEMKDAPK _QAFDEAISELDS 1260277 LpSEESYK _GLAYDIpSDDQQ 1129633 DITR _pSFQCELVFAK 324246 Control 2 351108 1292169 896475 260030 Control 3 184023 1239171 880010 228720 CV Treat 1 0.33 550744 Treat 2 501116 Treat 3 339250 CV 0.19 0.00 0.02 0.09Maxquant No AlignementControl 1 1104600 3960500 709050 2059500 Control 2 1205400 3540200 0 0 Control 3 CV 0 0.71 Treat 1 608060 Treat 2 672900 Treat 3 823280 CV 0.13 0.070.02 1013422 1002884 1006317 0.12 759156 0.15 154668 733623 128324 718231 1268043909300 0.05 1918100 2178200 2260900 495000 0.74 1186400 0.78 0 603210 0 6436600 #DIV/0! 727040 0.08CV plotCV plot1D‐LC or 2D‐LC2DLC 能够得到更多的蛋白鉴定结果和覆盖度，但是相对来说重现性比较差 1DLC 重现性较好，但限于分离效果和MS2的数量，鉴定数目和覆盖度会低些1.非标定量方法可以大大减少样本预处理的时间及对样品本身产生的干扰，并且可以实现最大量的定量及定性结果2.非标定量方法需要较好的色谱重现性，ESI喷雾连续性和污染物均会干扰其定量重现性3.非标定量方法需要进行正确的谱图校正，否则将影响其定量准确性和重现性。
4D定量蛋白质组
百泰派克生物科技
4D定量蛋白质组
定量蛋白质组学就是对系统中的不同蛋白质进行含量的精确鉴定，目前主要是根据基于质谱的技术对蛋白质进行含量鉴定。
常用的蛋白质定量技术如非标记定量策略（Label Free）和标记定量策略（iTRAQ、TMT、SILAC等），其基本原理都是将带标记的或未标记的蛋白质酶切消化成小分子肽段，再对小分子肽段进行HPLC-
MS/MS分析，通过对质谱数据进行生物信息学分析从而实现蛋白质的定量鉴定。
由此可见，基于质谱的蛋白质定量分析主要是基于质谱图所反映的肽段离子的理化性质来实现的。
4D定量蛋白质组学技术即利用4D质谱分析技术对蛋白进行定量分析，相比传统的3D定量蛋白质技术，4D质谱分析方法通过新增的离子淌度（mobility）这一维度可根据肽段离子的形状和碰撞面积（CCS）对其进行分析，能够检测质荷比（m/z）差值非常接近的肽段，对低丰度的肽段离子也能发挥很好的检测作用，在检测灵敏度以及准确度方面都有很大的提升。
百泰派克生物科技采用tims TOF Pro质谱平台结合nanoLC-MS/MS纳升色谱，提供高效灵敏的4D定量蛋白质组分析一站式服务技术包裹，您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的细胞寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括细胞培养、细胞标记、蛋白提取、蛋白酶切、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析，欢迎免费咨询。
labrlfree非标记定量蛋白质组学的分析方法
• Spearman Rank Correlation
– Only looks at ranking – Insensitive to outliers
• Ratio 95% Confidence Interval
– Tells us the typical range of ratios we would expect to see for values that are actually unchanged
– Comparison is WITHIN the mass spec run for SILAC, iTRAQ, and IPTL
• No chemical or metabolic labeling required • Compatible with virtually any sample
Volcano Plot of DAVID Analysis
Violin Plot of Significant Terms
SILAC Analysis Summary
• New plots help to detect interesting terms where there are few individual proteins that are significantly different, but the majority of the proteins are slightly different
Peptide LFQ Performance
Protein Raw Intensity LFQ Performance
Protein Spectral Counts LFQ Performance
Protein iBAQ LFQ Performance
非靶向蛋白组学定量技术
非靶向蛋白组学定量技术: SILAC, iTRAQ, TMT定量蛋白组学的研究意义人类基因组完整图谱于2003年正式公布，这标志着生命科学的里程碑性事件——人类基因组计划的顺利完成，生命科学研究也进入了后基因组时代。
这一计划的初始目的是在基因层面研究人类疾病机制，设计基因药物，进行精准医疗。
但是时隔十多年年过去了，效果远没预期的理想。
其中主要原因可能是，我们现有的研究工作和背景知识不足以将庞杂的基因组数据直接同人类疾病联系起来。
而蛋白组学能更直观的将基因与疾病联系起来，逐渐成为研究热点之一。
定量蛋白组学是将某一基因组或者某一复杂体系表达的全部蛋白质进行鉴定和精准定量的学科，是蛋白组学研究的重要分支。
基于质谱的蛋白质定量20实际80年代中期出现了MALDI（基质辅助激光解吸附电离）和ESI（电喷雾电离）两种软电离方法，可以将蛋白质或者多肽离子化，从而引入质谱仪种进行定性和定量分析，从此生物质谱技术成为蛋白组学最重要的分析工具之一。
图1. 生物质谱仪器。
利用生物质谱技术，主要有两种蛋白组学研究策略：Top-down strategy：Top-down（自上而下法）通常的做法是，先利用二维凝胶电泳分离蛋白，再将完整蛋白直接离子化后引入质谱分析，借助生信分析工具和蛋白数据库进行数据比对，从而实现对蛋白的鉴定。
Bottom-up strategy：Bottom-up（自下而上法）通常的做法是，先将样品用酶进行处理，多维色谱分离后引入质谱分析，再借助生信分析工具和蛋白数据库进行数据比对，最后实现对蛋白的鉴定。
蛋白定量分为相对定量和绝对定量，由于电泳技术具有重复性差等缺点，而多维色谱能将样品酶解物稳定分离，因此蛋白的绝对定量多采用自下而上的方法。
虽然绝对定量似乎更为理想，但是绝对定量更为复杂和昂贵，而相对定量在很多时候就能满足科研需求，因此，相对定量更为常用。
利于质谱技术，可根据特定质谱峰的信号强度来确定蛋白质含量，主要的方法又分为非靶向定量蛋白组学（标记定量和非标记定量）和靶向定量蛋白组学。
Labelfree蛋白质组定量技术
Labelfree蛋白质组定量技术
蛋白质非标记定量技术（label-free）是通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。
与iTRAQ技术相比，Label-free的技术优势就在于蛋白质不需要昂贵的同位素标签进行标记，所需样品总量少，耗费低。
Label-free技术可用于高通量的biaomarker筛选、蛋白质相互作用、蛋白质翻译后修饰等方面的定量比较分析。
常见问题
bel Free有哪些技术特点？
对液相色谱串联质谱的稳定性和重复性要求较高；无需昂贵的同位素标签作内部标准，实验耗费低；对样本的操作也最少，从而使其最接近原始状态，并且不受样品条件的限制，克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷。
2.iTRAQ和Label Free各有哪些优缺点？
（1）iTRAQ优点：1. 不受样品来源制约，几乎可对各种样品进行标记；2.通量高，可同时标记 2-8 个样本；3.可信度高，标记试剂的报告离子的相对分子质量较低，质谱在低分子量区的定性和定量较为准确；4.可进行翻译后修饰分析。
缺点：1. iTRAQ几乎可以与样品中的所有蛋白质相结合，容易受到污染蛋白的影响；2. 试剂昂贵，操作繁琐。
（2）Lable Free优点：1.样品需求量低；2.操作简便，不受样品的来源与通道数目的限制;3. 单次实验可鉴定和定量更多的蛋白质。
缺点：1. 在提取离子信号强度之前，需要对原始数据进行预处理，比较复杂；2. 准确性低，依赖质谱稳定性，在蛋白丰度差距较大时，无标的区分效率较好。
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label free 蛋白组织学定量流程
蛋白组织学定量是一种基于背景下自发荧光的单细胞成像技术，它可以在不同类型的
组织中高通量、高精度地定量蛋白质。
与传统的标记技术相比，该技术操作简单、精确度高、符合生物学实际，并且可以同时对多个蛋白进行定量，因此我们这里简要介绍一下label free蛋白组织学定量流程。
第一步：样品制备
首先需要获取组织切片，并进行石蜡包埋和切割。
当切片切得越薄时，定量效果就越佳，但是切得太薄会导致样品断裂。
一般而言，我们会将样品切成10um以下的薄片。
然后对薄片进行染色，染色可以提高单细胞的成像效果，但是染色过多会破坏蛋白的自发荧光，因此需要经过不断的实验来确定合适的染色强度和样品清洗的方法。
第二步：成像
成像最好选择激光共聚焦显微镜或别的高分辨率显微镜。
成像前，需要根据组织类型
确定激光的波长，以便最大限度地提高蛋白的自发荧光强度，并减少背景荧光的影响。
然
后利用激光扫描能力逐个扫描组织，并将收集到的荧光信号记录下来。
第三步：图像分析
收集到的图像可以借助特定的软件来进行分析，例如Imaris。
首先需要将图像进行分割，也就是对细胞成像区域和细胞核成像区域进行区分，并对每个区域进行单独的分析，
以获得单个细胞的骨架和荧光密度值。
根据骨架长度和荧光密度值就可以计算出细胞内蛋
白的数量。
将分析后的数据导入统计学软件中进行相应的统计分析，例如ANOVA、t检验等，以验证实验的重复性。
如果需要，还可以进一步进行单细胞蛋白质的相关性分析，例如是否存
在相互作用、调控通路等。
综上所述，label free蛋白组织学定量流程主要包括样品制备、成像、图像分析和数据分析四个步骤，由于其操作简单且数据准确性高，一直以来都备受青睐，未来将能够在
药物筛选、肿瘤诊断和生物标记物探测等领域得到更广泛的应用。