液相色谱基础
制备液相条件
制备液相条件一、液相色谱基础液相色谱是一种超级重要的分离分析技术呢。
它就像一个超级分拣员，能把混合物里的各种成分分得清清楚楚。
在制备液相中，这个技术就更厉害了，因为它的目的是得到足够量的纯物质，而不只是分析混合物里有啥。
二、制备液相的仪器组成与条件设置1. 泵泵可是制备液相的心脏呀。
它要能提供稳定的流速才行。
流速的选择很关键，如果流速太快，可能会导致分离效果不好，柱子压力也会过大；如果流速太慢呢，那制备的时间就会超级长，等得人都心急。
一般来说，根据柱子的类型和要分离的样品，流速可能在几毫升每分钟到几十毫升每分钟之间。
比如说，如果是比较小的柱子，可能流速5 - 10毫升每分钟就比较合适啦。
2. 柱子柱子是实现分离的关键部件。
有各种不同类型的柱子，像硅胶柱、C18柱之类的。
柱子的长度、内径、填料粒径这些都会影响分离效果。
柱子长一点，分离效果可能会更好，但柱压也会更高。
内径大的柱子，能处理的样品量就多，适合制备大量的纯物质。
填料粒径小的柱子，分离效果好，但是柱压也容易高。
比如制备一些小分子的药物纯品，可能C18柱就很合适，要是分离一些大分子的蛋白质，可能就需要特殊的柱子啦。
3. 检测器检测器就像液相的眼睛，它能告诉我们有哪些物质从柱子里流出来了。
常见的有紫外检测器、蒸发光散射检测器等。
紫外检测器很常用，因为很多有机化合物在紫外区有吸收。
不过有些没有紫外吸收的化合物，就需要用蒸发光散射检测器啦。
比如说，如果要制备一个没有紫外吸收的糖类纯品，蒸发光散射检测器就能派上大用场了。
4. 流动相流动相是带着样品在柱子里跑的东西。
它的组成很重要。
可以是不同比例的有机溶剂和水的混合物，比如甲醇 - 水、乙腈 - 水等。
有机溶剂的比例会影响样品的保留时间。
如果有机溶剂比例高，样品在柱子里跑得就快，保留时间短；反之，保留时间就长。
而且，流动相的纯度也要高，要是有杂质，可能会干扰分离，甚至损坏柱子呢。
三、样品的准备与进样1. 样品的准备样品要尽可能纯净，不能有太多杂质。
液相色谱基础知识
原理： ☼ 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电 导变化来测定电离物质含量。 导变化来测定电离物质含量。广泛应用于 离子色谱法。 离子色谱法。
☼ 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
梯度洗脱。 梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感，每升高1℃, ℃,电导率增加 ☼ 缺点：对温度变化敏感，每升高 ℃,电导率增加 2%-2.5%。
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
☼鬼峰的出现
洗脱曲线
☺水/MeOH梯度 ODS ODS柱 1ml/min在 0~10Mins内 MeOH 0~100% 线性变化后 保持15Min
鬼峰
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
在微量分析和梯度洗脱时建议使用HPLC级溶剂和纯化水 级溶剂和纯化水 在微量分析和梯度洗脱时建议使用
0.001~9.999
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
柱塞和密封圈的关系
水 出口单 向阀 密封圈 吸液移动 柱塞杆 送液移动 入口单 向阀 泵头清洗流路 流动相
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
手动进样阀7725i原理
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
☺无在线脱气机应注意：
1 每天脱气 2 如使用氦脱气，对混合好的溶剂脱气时间不能过长。
液相色谱基础知识
梯度形式的选择
洗脱模式：高压梯度
低压梯度 用两台输液泵将两种流动相混合并进入系统 常压下用比例阀将流动相混合，单泵进入系统
☺线性梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成线性变化（增或减） ☺指数梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成指数关系（增或减） ☺折线梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间无规则变化
液相色谱基础知识
液相色谱—视差折光检测器
检测器组成：光源——透镜——两 束平行光——样品池和参比池—— 光电二极管——比较两者信号差 值——输出信号 。
液相色谱—凝胶色谱
பைடு நூலகம்
凝胶渗透色谱仪（GPC仪）、体积 排阻色谱(Size Exclusion Chrom.) 。 分离原理：利用多孔物质做固定相， 按照待测组分分子尺寸大小进行分 离。测定相对分子量大小、分子量 分布。
环己烷
正丁醇 乙醇 水 异丙醇
乙酸正丙酯
丙酸甲酯 四氯化碳 N,N-二甲基 甲酰胺 苯
260
260 265 270 280
碘甲烷
二硫化碳 硝基甲烷 硝基乙烷 2-硝基丙烷
350
380 380 380 380
甲醇
甲苯
285
液相色谱—荧光检测器
荧光检测器：样品中物质分子能在 特定波长的光激发后跃迁到高能级 状态，在返回到基态的过程中，会 发出波长较长的光，称做荧光。 荧光强度F=I0Φabc I0——激发光强度 Φ——荧光量子产率
Refractive Index Detector
A valve is opened and pure solvent passes into one half of a cell. The eluate flows through the other half of the cell. The two halves are separated by a glass plate mounted at an angle such that bending of the incident beam occurs if the two solutions differ in refractive index.
液相色谱基础理论知识
一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（T swett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压—压力可达150~300Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速—流速为0.1~10.0 ml/min。
高效—可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度—紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快—通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高—可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高—紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
Shimadzu液相色谱基础
3
性能指标
检测限、线性范围、稳定性等，影响检测结果的 准确性。
数据处理系统
作用
01
数据处理系统用于采集、处理、分析色谱数据，提供实验结果
和图谱。
功能
02
包括基线校正、峰识别、定量分析等。
软件应用
03
常用的软件有ChemStation、Empowe
液相色谱操作流程
详细描述
当色谱峰的形状异常，出现拖尾或前延现象时，可能是由于固定相的流失或污染、流动相的配比不当、柱温波动、 样品溶剂选择不当等原因造成的。为了解决这个问题，可以更换固定相、调整流动相的配比、保持柱温恒定、选 择合适的样品溶剂等方法。
峰分离不完全
总结词
峰分离不完全会导致相邻峰的干扰，影响分析结果的准确性。
流动相
作用
流动相用于携带样品通过色谱柱，与固定相相互作用，实现组分 分离。
组成
通常由溶剂和水等组成，根据分离需求选择合适的流动相。
流速控制
流速直接影响分离时间和效果，需精确控制。
检测器
1 2
作用
检测器用于检测色谱柱流出的组分，并将其转化 为电信号。
类型
常见类型有紫外可见吸收检测器、荧光检测器、 电化学检测器等。
数据处理
对采集到的数据进行基线校 正、峰识别、定量计算等处 理。
结果分析
根据处理后的数据，对样品 中的组分进行分析和比较， 得出实验结论。
04
液相色谱条件优化
流动相的选择与优化
总结词
流动相的选择与优化是液相色谱分离 效果的关键因素之一。
详细描述
根据样品的性质和分离要求，选择合 适的流动相种类、溶剂和比例。优化 流动相的pH值、离子强度和粘度，以 提高分离效果和降低背景干扰。
液相色谱基础
检测器
二极管阵列检测器（SPD－M10AVP）
二十一世纪标准紫外检测器
色谱定性依据：
保留时间 常规紫外检测器
峰纯度
二极管阵列检测器
检测器
二极管阵列检测器的优点：
1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未测到的峰
气泡 气泡对测定的影响：
1）柱流量不准 2）检测器基线波动 脱气注意点： 1）每天脱气(无在线脱气器时） 2）混合溶剂脱气时间不能过长
返回
输液泵
送液方式： 恒流控制 恒压控制
VP系列输液泵：LC-10ADvp泵和LC-10ATvp泵 D泵：并联微体积往复式泵 T泵：串联式往复泵
岛津VP系列输液泵
反相液相色谱 流动相极性大于固定相极性 样品的保留顺序是非极性组分保留值大，极性组分先流出。 正相液相色谱 流动相极性小于固定相极性
溶剂前处理
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。
溶剂前处理
脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的
返回
目的
单元
流速范围 特性和应用
分析
LC-10ADVP
0.001-9.999 超低脉动，适于 半微量LC 和 LC-MS
LC-10ATVP 0.001-9.999 非凡的耐用性， 适于常量分析
*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度
进样器
自动进样器 手动进样器 原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入
返回
手动进样器的原理图
液相色谱基础理论.ppt
并非由试样所产生的峰；亦称假峰
17
基础理论：术语介绍
基线－Baseline
在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线
基线飘移 － Baseline Drift
基线随时间定向的缓慢变化
基线噪声；N － Baseline Noise
由各种因素所引起的基线波动
16
基础理论：术语介绍
峰面积 － Peak Area
峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差；σ － Standard Error
0.607倍峰高处所对应峰宽的一半
拖尾峰 － Tailing Peak
后沿较前沿平缓的不对称峰
前伸峰 － Leading Peak
前沿较后沿平缓的不对称峰
调整保留体积，V’R － Adjust retention volume
戴安中国HPLC用户培训 2011年
戴安中国有限公司
液相色谱基础知识部分
液相色谱简介 液相色谱理论基础
2
高效液相色谱简介
3
色谱的发明人
俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献
4
经典液相色谱
石油醚 淋洗剂
叶绿素
碳酸钙 颗粒
Review Stop
叶绿素 中的有 色物质
峰底 － Peak Base
峰的起点与终点之间连接的直线
峰高 － Peak Height
峰最大值到峰底的距离
峰宽 － Peak Width
在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离
半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height
液相色谱流动相基础知识-扫盲篇
液相色谱流动相基础知识-扫盲篇一、液相色谱流动相的性质要求一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
选好填料（固定相）后，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量因子k降低；而较弱的溶剂使溶质在SPME填料表面吸附增加，相应的容量因子k升高。
因此，k值是流动相组成的函数。
塔板数N一般与流动相的粘度成反比。
所以选择流动相时应考虑以下几个方面：①流动相应不改变填料的任何性质。
低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料会计考试有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。
碱性流动相不能用于硅胶柱系统。
酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
②纯度。
色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。
使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。
当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相溶剂瓶，以提高灵敏度。
④粘度要低（应<2cp）。
高粘度溶剂溶剂瓶会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。
最好选择沸点在100℃以下的流动相。
二、液相色谱流动相的pH值采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。
对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸会计考试的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。
分析弱酸经济师样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的相互网上培训作用，减轻或消除峰拖尾现象。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
特性和应用
分析
LC-10ADVP LC-10ATVP
0.001-9.999 超低脉动，适于 半微量LC 和 LC-MS
0.001-9.999 非凡的耐用性， 适于常量分析
*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度
进样器
自动进样器 手动进样器 原理：（六通阀） 注入方式：
1）全量注入 2）部分注入
返回
反相液相色谱 流动相极性大于固定相极性
样品的保留顺序是非极性组分保留值大，极性 组分先流出。 正相液相色谱
流动相极性小于固定相极性
溶剂前处理
过滤：0.45um或更小孔径滤膜
目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其 是使用无机盐配制的缓冲液。
溶剂前处理
脱气
目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的
检测器
示差折光检测器
原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样 各组分浓度。
优点：通用型检测器 缺点：1）对温度变化敏感
2）不能用于梯度检测
检测器
电导检测器
原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的 电导变化来测定电离物质含量。
*离子色谱法中广泛使用的检测器 *对温度变化敏感
返回
数据处理
岛津液相色谱数据处理单元：
LC-Solution色谱工作站 CLASS－VP色谱工作站 C－R6A色谱数据处理机 C－R7A色谱数据处理机 C－R8A色谱数据处理机
返回
谢谢！
返回
检测器
LC常用检测器：
紫外检测器（包括二极管阵列检测器） 示差折光检测器 电导检测器
检测器
紫外检测器
原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：比耳定律，A＝KCL 优点：1）对温度和流速不敏感
2）可用于梯度洗提 缺点：测器功能：
手动进样器的原理图
No Image
装填状态
样品注入
返回
柱温箱
柱温控制的优点：
分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性
色谱柱
ODS柱的使用注意点：
1）柱压低于150kgf/cm2 2）柱温在40℃左右，最高使用温度为60℃ 3）缓冲液pH使用范围为2～7
*硅胶在pH为3～4时稳定性最好 *碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。
气泡
气泡对测定的影响：
1）柱流量不准
2）检测器基线波动
脱气注意点：
1）每天脱气(无在线脱气器时）
2）混合溶剂脱气时间不能过长
返回
输液泵
送液方式：
恒流控制 恒压控制
VP系列输液泵：LC-10ADvp泵和LC10ATvp泵
D泵：并联微体积往复式泵 T泵：串联式往复泵
岛津VP系列输液泵
目的
单元
流速范围
一、色谱起源
色素 玻璃柱
石油醚 碳酸钙颗粒
二、定义 色谱法：利用组分在两相间分配系数不同 而进行分离的技术 移动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相，色谱柱固定液
液相色谱流程图
进样器 溶剂 输液泵 柱温箱 检测器 数据处理
流动相
流动相选择注意事项： 纯度：采用“ HPLC ”级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶 剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配
1）设定时间程序（切换检测波长等） 2）双波长检测 3）比例色谱，初步判断峰的纯度 4）停泵扫描，确定组分最大吸收波长
检测器
二极管阵列检测器（SPD－M10AVP）
二十一世纪标准紫外检测器
色谱定性依据：
保留时间 常规紫外检测器
峰纯度
二极管阵列检测器
检测器
二极管阵列检测器的优点：
1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未测到的峰