测定核酸含量的几种方法
核酸定量方法及原理
核酸定量方法及原理广泛用于测定制备物中核酸含量的方法有两类。
如果样品较纯（即蛋白质、酚、琼脂糖以及其他核酸等杂质含量较低时），可通过分光光度法测定其吸收紫外线的量，既简便又准确。
若样品中DNA或RNA含量较低或含有较多杂质，则可以通过溴化乙锭或Hoechst 33258等荧光染料所发出的荧光估测核酸的含量。
DNA或RNA的分光光度法测定核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。
可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。
核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。
每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。
定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。
如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / mL的dsDNA，37μg / mL的ssDNA， 40μg/mL的RNA，30μg/ mL的寡核苷酸。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，而后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，对应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
另外，还需考虑核酸本身理化性质和溶解核酸缓冲液的pH 值、离子浓度等。
在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。
这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。
在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。
从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
核酸的定量分析方法
主要有紫外-可见光谱法、荧光光谱法、红外光谱法、拉曼光谱法等。
基于光谱学的定量分析方法的优缺点
优点
操作简单，适用范围广，无需使用放射性同位素标记，可用于多种类型核酸的定量。
缺点
易受样品中杂质的影响，准确性较低，重现性较差。
光谱学定量分析的实例和应用领域
实例
紫外-可见光谱法定量分析DNA和RNA样品中的浓度和纯度。
VS
应用领域
基因组学、蛋白质组学、生物医药、环境 科学、法医学和化学计量学等领域。
05
基于生物芯片的定量分析方 法
生物芯片的原理及定量分析方法
生物芯片原理
生物芯片是一种高通量的生物分析技术，通过将生物分子固定在固相基质上 形成微阵列，然后利用特异性探针进行检测和定量分析。
定量分析方法
通常采用荧光标记或化学发光标记的核酸探针与生物芯片上的核酸序列进行 杂交，然后通过荧光信号或化学发光信号的强度来检测和定量分析目标核酸 序列的浓度。
VS
同位素标记法
通过在标准品和未知品中加入不同量的同 位素标记物，利用凝胶电泳将核酸分子分 离，再通过同位素检测器检测标准品和未 知品中同位素标记物的含量，从而计算未 知核酸浓度。该方法操作简便，但同位素 标记物具有放射性，对环境和人体健康可 能产生影响。
凝胶电泳定量分析的优缺点
优点
凝胶电泳具有高分辨率、可重复性好、操作简便、成本低廉 等优点，是核酸分子定量分析的常用方法之一。
缺点
需要使用较多的试剂和操作步骤，可能会受到非特异性杂交和酶抑制物的影响， 同时也存在一定的误差率。
循环酶放大技术定量分析的实例和应用领域
实例
采用循环酶放大技术对细菌、病毒、基因组、mRNA等多种 类型的核酸进行了定量分析，取得了较好的结果。
核酸含量测定
定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL
04
标准磷溶液：含磷量为10 μg/mL，每组用干试管取15用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；
02
制定定磷标准曲线；
03
测定回收率和样品总磷量。
实验步骤
1. 样品消化（每两组或三组做一份）
回收率的意义；
实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的酸度对测定结果的影响。
01
02
思考题
将试管洗净，斜插在试管架上，放在台面上。
将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。
将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿中。
将实验台面擦干净。
实验结束
消化管
1
2
3
RNA/mL
0
1
0
标准磷原液/mL
0
0
1
dH2O/mL
1
0
0
5mol/L H2SO4/mL
2
2
2
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
dH2O/mL
1
1
1
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
用dH2O定容/mL
50
50
50
混匀
2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份） 每人取18支试管，按照下表平行操作：
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画标准曲线，直线应过原点。
在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量(μg)。
数据处理
计算样品总磷量：
01
计算RNA量：
02
样品RNA含量：
03
计算回收率：
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定，不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
核酸定量方法及原理
核酸定量方法及原理广泛用于测定制备物中核酸含量的方法有两类。
如果样品较纯（即蛋白质、酚、琼脂糖以及其他核酸等杂质含量较低时），可通过分光光度法测定其吸收紫外线的量，既简便又准确。
若样品中DNA或RNA含量较低或含有较多杂质，则可以通过溴化乙锭或Hoechst 33258等荧光染料所发出的荧光估测核酸的含量。
DNA或RNA的分光光度法测定核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。
可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。
核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。
每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。
定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。
如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / mL的dsDNA，37μg / mL的ssDNA， 40μg/mL的RNA，30μg/ mL的寡核苷酸。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，而后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，对应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
另外，还需考虑核酸本身理化性质和溶解核酸缓冲液的pH 值、离子浓度等。
在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。
这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。
在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。
从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
实验九紫外分光光度法测定核酸的含量
学会使用紫外分光光度计进行核酸含量测定
操作步骤
准备标准品、未知样品和空白对照；按照仪器操作说明调整波长、设置测量模 式；将标准品和未知样品分别放入样品池；记录吸光度值；根据标准品的标准 曲线计算未知样品的核酸含量。
02
核酸在260nm波长处有最大吸收 峰，这是核酸特有的吸收峰，可 用于核酸的定量分析。
核酸的紫外吸光度与浓度的关系
随着核酸浓度的增加，吸光度也相应 增加。
在一定浓度范围内，吸光度与核酸浓 度呈线性关系，可以用于定量分析。
核酸含量计算公式及注意事项
核酸含量计算公式：核酸浓度（μg/mL） = (A / V) / (1000 × L) × (100 / S)
其中，A为吸光度值，V为样品体积（mL），L 为光程（cm），S为核酸分子截面积 （cm²/μg）。
注意事项
实验过程中要保持光程一致，以减小 误差。
实验过程中要避免样品污染，以免影 响实验结果。
对于不同来源和性质的核酸样品，可能需要采 用不同的实验条件和标准曲线进行定量分析。
03
实验步骤
样品制备
实验结论
根据实验结果和分析，得出实验结论，总结实验的成功与不足之处， 并提出改进意见和建议。
05
实验总结
实验收获与体会
学会了使用分光光度计进行实验 操作。
认识到实验操作对结果准确性的 影响。
01
02
掌握了紫外分光光度法测定核酸 含量的原理和方法。
03
04
了解了核酸在紫外光下的吸收特 性。
核酸的定量分析方法
光
分
析
DNA
法
AO-ST体系能 量发生荧光猝 灭
DNA浓度与荧光 猝灭强度呈线性 关系
检出限 2.6× 10-7mol/L
线性范围为 0～ 1.1× 10-6mol/L
1.DNA促进AO-ST间的荧光能量转移
下图表明ST的电子吸收光谱与AO的荧光发射光谱重叠。AO的荧
光在ST存在时明显地被淬灭，说明两者在水溶液中存在能量的转
准确、分析适应性广等特点。
DNA电化学生物传感器：基本原理
电
电压
ssDNA
化
（单链DNA）
学 法
杂交反应
电流
待测溶液
（样品中与之互补 的另一条DNA）
电导
样品中DNA的结构 和含量的测定
差分脉冲和方波伏安法研究亲和素-生物素固载ssDNA的生物传感器
Pt电极预 处理（抛光）
ssDNA在铂 电极表面的 固定化
核酸(DNA或RNA)在中性至碱性介质中由于核苷酸上磷酸基的离 解而能以有机 离子形式存在，因此能用某些碱性染料对其加以 测定。
定
以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化
磷
法
直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷
量。
定磷法简单、快速、灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响。
核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基
紫
都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm处有强烈
紫 外
RNA的质量浓度(mg/L)＝ A260nm 稀释倍数
吸
0.024 L
收
DNA的质量浓度（mg / L) A260nm 稀释倍数
实验四、定磷法测定核酸含量(精)
实验步骤
1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转 化成无机磷； 2. 制定定磷标准曲线；
3. 测定回收率和样品总磷量。
9
1. 样品消化（每两组或三组做一份）
吸取核酸样品液1ml于凯氏烧瓶中，另吸取蒸馏水 1ml做空白试验。各加入2 ml 5M硫酸。置于140160℃烘箱内消化2-4h，待溶液呈黄褐色后，取出 冷却，加入1-2滴30%过氧化氢，继续消化，到溶液 透明为止。取出冷却后加入1ml 蒸馏水，于沸水浴 中加热10min，以分解消化过程中形成的焦磷酸。 然后将消化液用蒸馏水转移至100ml容量瓶中定容 到刻度。
10
消化管 RNA/mL 标准磷原液/mL dH2O/mL
1 0 0 1
2 1 0 0
3 0 1 0
5mol/L H2SO4/mL
dH2O/mL 用dH2O定容/mL
2
1 50 混匀
2
1 50
2
1 50
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
11
2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份）
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 100% 2000( g / mL )
15
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
核酸的定量分析方法
优
点
紫
紫外吸收法测定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达
外
3ng/L的检测水平。蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高
吸
峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，
收
因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
法
缺
点 若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质（显著蛋
ssDNA电极杂交 （含一定浓度目 的基因杂交液 SSC）
电
化
DNA传感器 （ssDNA通
学
过生物素-亲 和素的方法
法
固载在Pt电 极）
指示剂： Co(phen)33+
工作电极
DNA序列 检测系统
示差脉冲伏 安法(DPV)
电 流 变 化
方波 伏安法(AWV)
线性范围： 8.0×10-9～ 2.8× 10-8
光在ST存在时明显地被淬灭，说明两者在水溶液中存在能量的转
荧
移，在体系中AO作为荧光能量的给予体，而ST则是能量的接受体。
光
当有DNA存在时，AO-DNA体系的荧光强度被ST淬灭的程度大大 增加。
分
析
法
1.AO荧光发射光谱 2.ST 电子吸收光谱
DNA的存在前后，ST对AO荧光淬灭的变化主要是由于DNA分子对AO 分子、ST分子的极化作用引起。ST对AO-DNA荧光淬灭的效率大于AO荧 光淬灭效率，是由于DNA对AO与ST间的荧光能量转移过程促进的影响。
B：钼酸铵-过 氯酸沉淀剂
紫
RNA（或DNA）的质量浓度（mg/L)
A 260nm
稀释倍数
0.024(0.020) L
外
吸 收
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为什么要测核酸含量
有助于接下来核酸相关实验中所用酶和其他试剂含量的确定 为了排除核酸在实验中的干扰
核酸含量测定的几种方法
定磷法 定糖法 紫外吸收法 荧光光度法
定磷法
在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应 生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物—— 钼蓝
优缺点：只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液
荧光光度法
即琼脂糖凝胶电泳法。 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它插入到DNA分子中形成荧光
结合物，使发射的荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于DNA的含量 ，将已知浓度的标准样品作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓 度。用量只需要5-10ng DNA即可，肉眼观察可检测0.05g-0.1g的 DNA。 该方法只是估计水平，另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标 准对照中核酸分子的长度。
测定核酸含量的几种方法
命基111 10111104 朱家民
核酸
由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一 。
核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋 白质结合形成核蛋白。
同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不 同，核酸可分为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA） 。
小节
根据不同情况以及实验条件选择合适的检测方法。 无论何种方法，均需保证待测样品的核酸（DNA或RNA)纯度。 根据需要设定一定的平行以及对照。
再见
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注意事项
1）清洗实验用容器不要用含磷清洗剂 2）消化过程注意防止爆沸和溅出内容物
定糖法
核酸中的戊糖可在浓盐酸或浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物，醛类 化合物可与某些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法或分光光度法 测定其溶液中的吸收值，在一定浓度范围内，溶液的吸收值与核酸的 含量成正比。
1、核糖的测定 生成的绿色化合物在λ=670nm处有最大的吸收值。
钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。当使用抗坏血酸为还原 剂时，测定的最适范围为1—10微克无机磷。测定样品核酸总磷量， 需先将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化 样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可以计算出核酸含量 。
优缺点：简单，快速，灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响
组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在 波长为250~270nm之间。核酸的最大吸收波长是260nm，这个物 理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。
在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为 50μg/ml；单链DNA或RNA为20μg/ml。可以次来计算核酸样品的 浓度。
2、脱氧核糖的测定 DNA中的脱氧核糖可在浓硫酸作用下脱水生成ω-羟基-γ-酮戊酸
，该化合物可与二苯胺生成兰色化合物，在λ=595nm处有最大吸收 值。
优缺点：较灵敏，但特异性较差，凡戊糖均有此反应。
注意事项
其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等都对实验有干扰，测定前应尽 量可能除去。
紫外吸收法