放线菌新种分类鉴定-文档资料
微生物,放线菌分类42页PPT
13、遵守纪律的风气的培养，只有领 导者本 身在这 方面以 身作则 才能收 到成效 。—— 马卡连 柯 14、劳动者的组织性、纪律性、坚毅 精神以 及同全 世界劳 动者的 团结一 致，是 取得最 后胜利 的保证 。—— 列宁 摘自名言网
15、机会是不守纪律的。——雨果
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
微生பைடு நூலகம்,放线菌分类
11、战争满足了，或曾经满足过人的 好斗的 本能， 但它同 时还满 足了人 对掠夺 ，破坏 以及残 酷的纪 律和专 制力的 欲望。 ——查·埃利奥 特 12、不应把纪律仅仅看成教育的手段 。纪律 是教育 过程的 结果， 首先是 学生集 体表现 在一切 生活领 域—— 生产、 日常生 活、学 校、文 化等领 域中努 力的结 果。— —马卡 连柯(名 言网)
新种表形特征鉴定
1.碳源利用采用无碳源培养基作为基础培养基，加入0.5%的不同糖醇类物质作为碳源，接种待测放线菌，观察放线菌生长情况，以无碳源培养基作为阴性对照判断放线菌利用碳源的能力。
糖醇类物质遇高温可能分解转化，用乙醚消毒灭菌碳源利用试验基础培养基：硫酸铵2.64 g，磷酸二氢钾2.38 g，磷酸氢二钾5.65 g，硫酸镁1 g，硫酸铜0.0064 g，硫酸亚铁0.0011 g，氯化锰0.0079 g，硫酸锌0.0015 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2-7.4。
2.氮源利用采用无氮源培养基作为基础培养基，加入0.1%的不同氮源，接种待测放线菌，以无氮源培养基作为阴性对照判断放线菌利用碳源的能力防止氮源遇高温分解转化，用乙醚消毒灭菌氮源利用试验基础培养基：葡萄糖1 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5 g，氯化钠0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。
3.温度耐受及最适生长温度将待测放线菌接种到最适的生长培养基上，分别放置4℃，8 ℃，12 ℃，16℃，20℃，25℃，28℃，32 ℃，37℃，40 ℃，45℃，50 ℃和55℃温度条件下培养，根据菌株的生长状态确定放线菌的温度生长范围和最适生长温度。
4.盐度耐受及最适生长盐浓度在待测放线菌的最适生长培养基中添加0，5%，10%，15%，20%，25%浓度的氯化钠。
接种待测放线菌，根据放线菌的生长情况确定放线菌的盐度耐受范围和最适生长盐浓度。
5.pH耐受及最适生长pH的确定配制待测放线菌最适生长的培养基，用缓冲液调节培养基pH至4，5，6，7，8，9，10，11。
接种待测放线菌，根据放线菌在不同pH培养基上的生长情况确定待测放线菌的pH耐受范围和最适生长pH。
注：配制低pH的培养基时应适当增加琼脂的用量6.黑色素产生采用黑色素产生培养基，接种待测放线菌，观察菌落周围琼脂是否有黑色素产生黑色素产生培养基培养基：蛋白胨20 g，酵母粉1 g，柠檬酸铁0.5 g，磷酸氢二钾1 g，硫代硫酸钠0.08 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.07.硫化氢产生将待测放线菌接种硫化氢产生验证培养基，如果菌株周围的培养基变成黑色，则说明有硫化氢产生硫化氢产生验证培养基：蛋白胨10 g，柠檬酸铁0.5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.08.明胶液化将待测放线菌接种于明胶培养基表面，28℃培养，观察明胶液化程度。
《放线菌分类》PPT课件
2020/11/15
三、放线菌生物技术的发展
• （一）分离培养和纯化技术 • 近年来，国内外科学家正在开展一种从自然生态环境中选择性分离放线
菌的分离技术。 • 非链霉菌或稀有放线菌作为新的生理活性物质的重要来源成为关注的热
点。 • Colwell 实验室在1982年提出活的但不可培养微生物的概念，他们发
用前景有： • 1、基因，尤其是编码功能蛋白的基因 • 2、代谢产物，如具有生物活性的次生代谢产物，尤其是各类先导化合物 • 3、特殊代谢途径，如合成和分解，利用某些特殊化合物的新代谢途径，
用于生物降解等 • 4、新的代谢调控机理，如用于筛选或者构建高产或高活性菌 • 5、具有不同生态功能的微生物活细胞等，如生物膜用于污水处理，污染
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• 三、几个值得重视的问题 • 1、在以rRNA为主的分子分类已经比较普及的今天，应按照系统学的要
求，吸取基因组学、蛋白质组学、生物信息学及其他学科最新成就， 建立完善细菌分类系统，使系统学更能反映生物进化的本来面目和生 物之间的真实关系。 • 2、从我国学者发表论文和内容来看，发现少创新少，大多沿用或改进 国外分类系统和方法进行的工作。 • 3、现行杂交方法有较大误差，应该探索新途径。 • 4、特定类群的快速鉴定 • 5、及时扩大研究范围 • 6、设计新的独特的分离方法分离未知菌，才能不断提供新的菌种资源。
第二节 放线菌系统分类学的过去和 现在
• 一、国外概况 • 1、历史及著名研究单位 • 最早描述放线菌的学者——Cohn，他自人泪腺感染病灶中分离到一株丝状病
原菌——链丝菌。而后Harz建立了放线菌属。 • 美国新泽西农业试验站，Rutgers大学微生物研究所 • 1942年发现链霉素。 • 《放线菌的属和种分类鉴定和描述》，放线菌分类学开始形成。 • 整个70年代是放线菌化学分类时代 • 构建放线菌系统发育树，进入分子分类时代
海洋放线菌的分类鉴定
海洋放线菌的分类鉴定一、放线菌㈠、放线菌的分布放线菌常以孢子或菌丝状态极其广泛地存在于自然界。
不论数量和种类，以土壤中最多。
河流和湖泊中，放线菌数量不多，大多为小单孢菌、游动放线菌和孢囊链霉菌，还有少数链霉菌。
海洋中的放线菌多半来自土壤或生存在漂浮海面的藻体上。
海水中还存在耐盐放线菌。
放线菌有一种土霉味，使水和食物变味，有的放线菌也能和霉菌一样使棉毛制品或纸张霉变。
放线菌主要能促使土壤中的动物和植物遗骸腐烂，最主要的致病放线菌是结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌，可导致人类的结核病和麻风病。
放线菌最重要的作用是可以产生、提炼抗生素，目前世界上已经发现的2000多中抗生素中，大约有56%是由放线菌（主要是放线菌属）产生的，如链霉素、土霉素、四环素、庆大霉素等都是由放线菌产生的。
此外有些植物用的农用抗生素和维生素等也是由放线菌中提炼的。
㈡、放线菌的形态与结构放线菌菌体为单细胞，大多由分枝发达的菌丝组成，最简单的为杆状或具原始菌丝。
放线菌是一种革兰氏阳性菌。
放线菌菌丝细胞的结构与细菌基本相同。
根据菌丝形态和功能可分为营养菌丝、气生丝和孢子丝三种。
⑴营养菌丝匍匐生长于培养基内，主要生理功能是吸收营养物，故亦称基内菌丝。
营养菌丝一般无隔膜；直径0.2-0.8微米，但长度差别很大，短的小于100微米，长的可达600微米以上；有的无色素，有的产生黄、橙、红、紫、蓝、绿、褐、黑等不同色素，若是水溶性的色素，还可透入培养基内，将培养基染上相应的颜色，如果是非水溶性色素，则使菌落吨呈现相应的颜色。
色素是鉴定菌种的重要依据。
⑵气生菌丝长出培养基外并伸向空间的菌丝为气生菌丝。
它叠生于营养菌丝上，以至可覆盖整个菌落表面。
在光学显微镜下，颜色较深，直径比营养菌丝粗，约1-1.4微米，其长度则更悬殊。
直形或弯曲而分枝，有的产生色素。
⑶孢子丝气生菌丝上分化出可形成孢子的菌丝即孢子丝。
孢子丝的形状和在气生菌丝上的排列方式，随菌种而异。
孢子丝的形状有直形、波曲和螺旋形。
放线菌新种分类鉴定
代表属
Sterptomyces Micromonospora
Actinomadura Nocardia
Actinomyces Oerskovia Agromyces
Bifidobacterium Mycoplana
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放线菌全细胞的主要糖类型（Lechevalier， 1976）
aMK-9(H2), MK-9(H4),MK-9(H6) bMK-9(H4), MK-9(H6),MK-9(H8)
cMK-10(H4),MK-9(H6)
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菌体的收集制备
待测菌株用液体培养基培养，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤两次，菌体于-80℃冷 冻3d，冷冻干燥机抽干菌体，冻干菌体4℃干燥器保存备用。
不加碳源的基础培养 基作为阴性对照。
氮源: KNO3，NaNO2，尿素， (NH4)2SO4，丝氨酸，烟酰胺，酪氨酸， DL-天冬氨酸，L-甲硫氨酸，DL-丙氨酸， L-精氨酸，L(+)-谷氨酸，甘氨酸，L-苯丙 氨酸，腺嘌呤。
不同氮源按0.5%的浓度加入，培15天后， 将各种氮源上的生长状况与不加氮源的基础 培养基上的生长状况作比较。
直链饱和与不饱和、分枝和复杂形式的脂肪酸。
○ 脂肪酸分析应在标准化的条件下进行，因为不同组分的相对含量因菌龄和培养条件的 不同而异。
○ 脂肪酸定性分析结果限于属和属以上的分类；脂肪酸定量分析可为种和亚种分类提供 有用的基本资料。
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基因型分类
A
G+C%含量分析
B DNA-DNA分子杂交
C 16srRNA基因序列分析及进化树的构建
表观特征
2.3 鉴定方
法
放线菌的分类方法
2012届本科毕业论文（设计）放线菌的分类方法姓名: __ __ __________系别:__ 生命科学学院_____专业：___ 生物工程_________学号：_ _ _指导教师：____ ____ ____2012年5 月9日目录摘要 (1)1 放线菌的分类研究意义与方法 (2)1.1放线菌 (2)2放线菌的分类方法的发展历程与意义 (3)2.1形态学与培养特征上的分类与鉴定 (3)2.2数值分类方法 (3)2.3化学分类 (3)3 放线菌的分子生物学分类的发展情况 (4)3.1.DNA碱基组成分析： (4)3.2.DNA-DNA同源性分析： (4)3.3.DNA-rRNA同源性分析： (4)3.4.核酸的一级结构的分析： (5)3.5.16S rRNA基因序列分析： (5)3.7.PCR-RFLP分析： (5)3.8.rep-PCR指纹分析技术： (5)3.9.RAPD分析： (6)3.10.AFLP指纹分析技术： (6)4放线菌的分类在未来发展的方向及意义 (6)参考文献 (6)致谢................................................................ 错误!未定义书签。
放线菌的分类方法摘要：放线菌是原核生物的一个类群，相关分类学经历了早期的形态学上的经典分类（主要从其形态结构来进行分类），数值分类（运用计算科学与技术对放线菌进行描述分类），化学分类（运用化学分析的方法对放线菌的细胞壁和组成成分进行分析归类），直至今天的分子分类。
通过对放线菌的分类进而建成系统进化树，更加方便了放线菌的研究与应用。
由于科学进步的发展放线菌在分子分类中又有了不同的研究方法，由（G+C）mol%的差别而分析的物种亲缘关系的远近形成的DNA碱基组成分析发展到在DNA杂交中的DNA序列互补程度来推断它们的的DNA-DNA同源性分析，从核酸的一级结构上的分析到RNA的二级结构上的分析等方法。
放线菌分类特征及常见种类
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2.4 放线菌
放线菌在分类上地位上属于原核生物界、细菌门、真细菌纲、 放线菌亚纲，放线菌目。
放线菌的形态比细菌较复杂，但它仍属单细胞，革兰氏染色 阳性，繁殖方式为无性，菌丝断裂或孢子繁殖。它以菌落呈放 射状而得名。
2.4 .1 放线菌的分类依据
一、培养特征： 1、孢子丝与孢子的颜色； 2、气生菌丝的颜色； 3、基内菌的颜色； 4、可溶性色素的颜色；菌丝产生水溶液性或脂溶性色素。 二、形态特征： 1、基内菌丝生长特征；真径，分裂方式 2、生长菌丝生长特征：直径，有无。 3、孢子丝的形状：直形成、波曲状、螺旋形、轮生 4、孢子的形态：表面结构、颜色、鞭毛 三、生理生化特性：明胶液化、牛奶凝固与胨化、淀粉酶的活性、纤维 素酶活性、产生硫化氢、对各种碳水合物的利用情况 四、噬菌体和血清反应： 五、细胞壁化学组分：二庚基庚二酸和其它氨基酸，以及特征性糖。
二、诺卡氏菌属（Norcardia ) 形态特征：基内菌丝较链霉菌纤细，0.2-0.6μm，有横隔裂断，一般 无气生菌丝，基丝培养十几个小时形成横隔，并断裂成杆状或球状 孢子。菌落很小，产生多种颜色。主要分布于土壤中。能同化多种 碳水化合物和脂肪，许多种能利用石蜡、烃和纤维素等，多数好氧 腐生，少数厌氧寄生。
已知诺卡氏菌产生30多种抗生素，如治疗结核病和麻疯病有显 效的利福霉素，对细菌白叶枯病有抑制作用的蚁霉素，此外，在石 油脱蜡、烃类发酵以及含睛污水处理中都有所应用。 该属代表种：地中海诺卡氏菌（利福霉素）
诺卡氏菌
三、小单孢菌属（Micromonospora ) 形态特征：基内菌丝无横隔不断裂，0.3-0.6μm，无气生菌丝， 孢子着生在短孢子梗上或直接从基丝上产生，孢子单生，球形 或椭圆形。
《放线菌分类》课件
优缺点
分子生物学分类是目前最常用的 分类方法，但需要一定的基因测 序技术和专业知识，成本较高。
数值分类
总结词
基于放线菌的全细胞蛋白质电泳 图谱进行分类。
详细描述
数值分类通过分析放线菌的全细胞 蛋白质电泳图谱进行分类，能够反 映放线菌的整体蛋白质表达水平。
优缺点
数值分类具有较高的分辨率和准确 性，但需要特定的仪器设备和复杂 的图谱分析技术。
《放线菌分类》ppt课件
CONTENTS
• 放线菌分类概述 • 放线菌的分类方法 • 放线菌的主要属与种 • 放线菌的应用与价值 • 展望与未来研究方向
01
放线菌分类概述
放线菌的定义与特点
放线菌是一类具有分支状 菌丝的革兰氏阳性细菌， 通常在固体培养基上形成 辐射状菌落。
放线菌具有高度多样性， 在土壤、水和空气中广泛 分布，是抗生素等生物活 性物质的重要来源。
详细描述
化学分类通过分析放线菌的脂肪酸、醌类化合物、氨基酸等化学成 分进行分类，能够反映放线菌的生化特征。
优缺点
化学分类可以弥补形态学分类的不足，但需要特定的仪器设备和化 学试剂，成本较高。
分子生物学分类
总结词
基于放线菌的基因组序列进行分 类。
详细描述
分子生物学分类通过比较放线菌 的16S rRNA基因或其他基因序列 进行分类，具有较高的分辨率和 准确性。
03
放线菌的主要属与种
链霉菌属
01
链霉菌属是放线菌中最大的一类 ，包括了超过1800种不同的种。
它们广泛分布于土壤、空气、水 体等环境中，具有丰富的生态多 样性。
03
链霉菌属的菌落形态多样，颜色 各异，有的呈白色、黄色、橙色 或黑色。
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实验目的
2
实验方法
3
实验结果
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总结
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1、实验目的
本实验通过对分离得到的放线菌新种从形态学、 生理生化反应特征、和分子遗传分类学方面进行鉴 定，证明其是以前从未发现的新种。
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2、实验方法
2.1 分离方法 2.2 16SrRNA基因序列测定
温度耐受实验
➢将菌株接种在高氏一号培养基上，分别在4℃、10 ℃ 、16 ℃ 、20 ℃ 、 28℃、37℃、45℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。
盐耐受实验
➢高氏一号培养基内加入不同浓度的NaCI(l%，3%，5%，7%，10%，15% ，20%)28℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。
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2.3.2 化学分类
A
细胞壁化学组分
B
磷酸类脂测定
C
甲基萘醌测定
D
脂肪酸测定
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A.细胞壁化学组分
➢放线菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，根据肽聚糖 分子中肽链第3位氨基酸的种类，种间肽桥和邻近的 四肽交联的位置来决定放线菌细胞壁型的划分。
➢Lechevalier等（1976）根据放线菌细胞壁的化学组 分和全细胞水解液糖型，将放线菌归为9个主要类群 和4个糖型。
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c. 淀粉水解
➢将菌株点种在淀粉琼脂平板上，待菌落生长良好时， 在菌落周围滴加碘液检测淀粉水解酶活性的强弱。 ➢滴加碘液后培养皿背景呈蓝黑色,菌落四周若不变色， 或移开菌落后滴加新碘液，菌落下得培养基仍不变色， 表示淀粉水解阴性；若变成透明无色则为阳性，说明 产生淀粉酶水解淀粉。
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2.3.1 表观特征
A
电镜观察
B
培养特征
C 生理生化特征
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A. 电镜
➢取菌体后,3%戊二醛固定4h, 0.1M磷酸缓冲液漂洗。 ➢酒精梯度脱水，在30%、50％、70％、80%、100％依次脱 水，其中100％酒精2次，每次10min。 ➢乙酸异戊脂置换，50%一次，100%两次。 ➢Eiko公司XD-1型二氧化碳临界点干燥器干燥，Eiko公司IB3型离子镀金仪喷金镀膜。 ➢JEOL公司JSM-840扫描电镜观察。
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B. 培养特征
➢参照国际链霉菌规划中有关放线菌的培养特征描述 所采用的标准培养基进行培养特征测定。 ➢所用培养基有:ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏琼脂、 马铃薯浸汁琼脂、营养琼脂，平板接种，28℃培养7， 14，21，28d后分别观察并记录基内菌丝、气生菌丝的 生长情况及可溶性色素。
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i. 碳源利用和氮源利用（本实验利用BIOLOG板）
➢碳源：D-葡萄糖，蔗糖，L-树胶醛糖，D-果糖，D-木糖，鼠李糖， I-肌醇，棉子糖，D-甘露醇，纤维素。 ➢不加碳源的基础培养基作为阴性对照。
➢氮源: KNO3，NaNO2，尿素， (NH4)2SO4，丝氨酸，烟酰胺，酪氨 酸， DL-天冬氨酸，L-甲硫氨酸，DL-丙氨酸，L-精氨酸，L(+)-谷氨 酸，甘氨酸，L-苯丙氨酸，腺嘌呤。 ➢不同氮源按0.5%的浓度加入，培15天后，将各种氮源上的生长状况 与不加氮源的基础培养基上的生长状况作比较。
e. 牛奶凝固与胨化
➢将待测菌种接种在脱脂牛奶管中，观察牛奶凝固与胨化现象。 ➢若牛奶有凝块则为凝固，继续培养，凝固后有液体出现，进一步水解 成液体，则为胨化，一般先凝固后胨化。
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f. 硝酸盐还原试验
➢将待测菌种接在硝酸盐液体培养基中，置室温下培养，1、 3、5d取样测定。每株菌作复本，另两管作对照。 ➢培养液中加入格里氏试剂A、B液各一滴，如呈现粉红色、 玫瑰红色，表明硝酸盐还原阳性，如无红色出现，则加1， 2滴二苯胺试剂，如呈蓝色，表示培养液中仍有硝酸盐存在， 硝酸盐还原属阴性，若不呈蓝色，表示硝酸盐和亚硝酸盐 都已还原成其他物质，仍
d. 脲酶的产生
➢有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变 为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存 在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。
➢挑取18~24h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部， 培养1～4d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为粉红 色为阳性。
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g. H2S的产生
➢某些细菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而产生硫化氢 气体，若于培养基中加入柠檬酸铁铵或醋酸铵，则与硫化氢作用 生成硫化亚铁或硫化铅（黑色）沉淀。
h. 黑色素的产生
➢将供试菌株接种在酪氨酸培养基斜面管上，培养 7 d 和 14 d 观 察结果，培养基被染成褐色或者黑色即说明该菌产生黑色素。
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b. 明胶液化
➢ 取明胶培养基试管作穿刺接种，另有两支不接种作空白 对照。于28°C培养箱中培养。 ➢ 培养2、7、10、14和30天的试管，放入4°C冰箱或置于 冷水中30min，然后进行观察。 ➢ 如明胶凝块部分或全部变为可流通的液体，则明胶水解 阳性。 ➢ 如明胶凝块呈固体，则明胶水解阴性。 ➢ 若菌体未生长，可能是不能在明胶培养基上生长。
2.3 鉴定方法
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2.1 分离方法
➢近年来出现了胞外多糖胶与动孢溶液相结合的分离方法、再水化离心 法、极高频辐射法、噬菌体定向分离法和蔗糖梯度离心法等用 于稀有放线菌选择性分离的方法。
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2.2 16SrRNA基因序列测定
➢放线菌基因组的提取 ➢16SrRNA基因扩增 ➢胶回收 ➢连接 ➢转化 ➢测序研究
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C. 生理生化实验
➢生理生化特性的测定主要包括: pH、盐浓度和温度耐受性，明胶液化，淀粉水解，脲酶 的产生，牛奶胨化和凝固，硝酸盐还原，H2S的产生，黑 色素的产生，唯一碳、氮源利用等试验。
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a. pH、盐浓度和温度耐受性
pH耐受实验
➢在高氏一号培养基中分别加入pH缓冲液，空白培养基作阴性对照，28℃ 培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。