酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告一、实验目的本实验旨在学习酵母蔗糖酶的提取方法，并掌握其酶活力的测定方法。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种重要的生物催化剂，广泛应用于食品工业、医药工业等领域。
其提取方法主要包括细胞破碎法和超声波法。
细胞破碎法是将酵母细胞经过离心、洗涤后，在低温下使用高压均质机或超声波仪器进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。
而超声波法则是将细胞悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。
三、实验步骤1. 酵母菌体培养：将活性酵母菌体接种到含有10%蔗糖和0.5%酵母粉的液体培养基中，在30℃下静置48小时。
2. 细胞破碎：将培养好的菌体通过离心后洗涤两次，然后在低温下使用高压均质机进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。
3. 超声波处理：将菌体悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。
4. 酶活力测定：取一定量的提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，在37℃下反应30分钟后用硫酸铜试剂测定还原糖的含量。
四、实验结果通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，测得其酶活力分别为10.5 U/g和12.8 U/g。
五、实验分析1. 细胞破碎法和超声波法都可以用于酵母蔗糖酶的提取，但是超声波法更加快速、高效。
2. 酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意培养基成分和温度等因素。
3. 酵母蔗糖酶的测定方法可以采用硫酸铜法，但是也可以采用其他方法，如比色法和光度法等。
六、实验结论本实验通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，并测定了其酶活力。
结果表明，超声波法更加高效。
同时，酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意调整培养条件。
最后，硫酸铜法可以用于测定酵母蔗糖酶的活力。
酵母蔗糖酶的提取分离纯化及其蛋白质浓和酶活力测定
蛋白总量 = 蛋白浓度×总体积 总酶活 = 酶活×校正体积 比活力（Unit/mg）＝总酶活力/总蛋白 纯化倍数 = 比活力之比 回收率 = 总酶活之比
分实验四：离子交换柱层析纯化蔗糖酶
一、实验目的 学习掌握离子交换柱层析的原理与操作
二 、实验原理
离子交换是指液相中的离子与固相交换 基团中的离子可逆反应。离子交换剂有阳离子 交换剂（如：羧甲基纤维素：CM-纤维素）和阴 离子交换剂（如：二乙氨基乙基纤维素： DEAE-纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经 离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电 荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改 变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来 。
➢在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成葡萄糖和果糖。 ➢葡萄糖、果糖和碱性铜试剂混合加热后被其氧化，二价铜
被还原成棕红色氧化亚铜沉淀。 ➢氧化亚铜与磷钼酸作用生成蓝色溶液，其蓝色深度与还原
糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。
三、试剂
碱性铜试剂 磷钼酸试剂 葡萄糖标准溶液 0.2mol/L蔗糖溶液 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9
将2-3mL醇级分2用移液管沿着管壁轻轻加到 层析柱中，注意不要扰动柱床，上样后，用大约 30ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，当A280nm 值降低稳定后，可用恒流泵及梯度混合器进行梯度 洗脱 [梯度混合器左侧放入50ml 0.02 mol/L pH值 为7.3的Tris-HCl缓冲液（含1 mol/L NaCl）， 右侧放入等量0.02 mol/LpH值为7.3的Tris-HCl 缓冲液]。
10 ──反应10min
B ──每管加入酶液mL数 原始酶液的酶活力 E = (E′/2)×稀释倍数
分实验三：蔗糖酶各级分的蛋白含量测定 （G-250法）
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告酵母蔗糖酶的提取实验报告1. 引言酵母蔗糖酶是一种重要的酶，在许多生物过程中起着关键作用。
通过提取酵母蔗糖酶，我们可以深入了解其结构和功能，以及其在实际应用中的潜力。
本实验旨在通过一系列步骤，从酵母细胞中提取酵母蔗糖酶，并评估其活性和效果。
2. 方法和材料2.1 材料- 新鲜酵母菌浆液- 蒸馏水- 磷酸缓冲液- 蔗糖溶液- 高速冷离心机- 低速冷离心机- 离心管- 离心管架- 塑料吸管- 双室温度计- 分光光度计- 试管2.2 实验步骤步骤1：制备酵母酶提取液a) 将10ml新鲜酵母菌浆液倒入离心管中，并以1500rpm的速度在低温下离心10分钟。
b) 将上清液转移至另一个离心管中，再次进行高速离心，以去除细胞碎片。
步骤2：沉淀酵母蔗糖酶a) 将上一步中得到的上清液倒入一个含有7ml蔗糖溶液的试管中。
b) 在室温下孵育搅拌2小时，让酵母蔗糖酶与蔗糖结合形成沉淀。
c) 用低速离心将沉淀分离。
收集上清液备用。
步骤3：测定酵母蔗糖酶活性a) 在分光光度计中设置波长为540nm。
b) 取1ml上清液和1ml磷酸缓冲液混合，作为空白对照。
c) 另取1ml上清液和1ml含20%蔗糖溶液的试管中，作为实验组。
d) 在不同时间点（例如0、1、2、3、4分钟）测定两个试管的吸光度，并记录数据。
e) 计算酵母蔗糖酶的活性。
3. 结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地提取了酵母蔗糖酶，并可以测定其活性。
根据测定结果，我们观察到酵母蔗糖酶在一定时间范围内对蔗糖的降解表现出线性增加的趋势。
这表明酵母蔗糖酶在一定程度上具有稳定的催化作用。
通过本实验，我们还可以根据酵母蔗糖酶的活性表征其在不同条件下的稳定性、催化效率和适应性。
我们可以改变温度和pH值，观察对酵母蔗糖酶活性的影响，从而了解其最适宜的操作条件。
通过进一步的研究，我们还可以探索酵母蔗糖酶在生物制药、食品加工和能源生产等领域的应用潜力。
总结回顾：通过酵母蔗糖酶的提取实验，我们深入了解了酵母蔗糖酶的结构、功能和应用前景。
酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取方法酵母蔗糖酶是重要的糖分解酶，它可以被用来制造蔗糖、糖精、酒精、淀粉、葡萄糖以及蔗糖衍生物。
因此，它在化工、食品、制药行业中有着重要的应用价值。
本文介绍了从发酵酵母或发酵液中提取酵母蔗糖酶的方法。
一、原料准备首先，准备发酵酵母或发酵液。
发酵酵母可以使用乳酸乳杆菌培养基发酵培养，得到的酵母菌可以悬浮在一定的温度和 pH 下曝气发酵，以获得最大的效果。
发酵液可以采用蔗糖和氨基酸等制备，并需要调节合适的 pH温度，可以提高酶的活性。
二、提取酵母蔗糖酶1.发酵酵母或发酵液放入滤器，用中压过滤来滤出悬浮体；2.过滤得到的酵母蔗糖酶悬浮液中加入NaCl，来降低活性；3.溶液中的毛细管类蛋白分离出来，加入45%的乙醇萃取分离；4.溶液冷冻至冰点，冻干抽滤以获得纯化的蔗糖酶；5. 从冻干抽滤物中继续利用膜精制器以及离子交换柱等方式，将蔗糖酶高纯度分离出来；6.高纯度蔗糖酶经过适当稀释处理，可获得最终产品。
三、性能测试为了判定提取的酵母蔗糖酶的性能，需要进行一系列的性能测试，这些测试可以用来检测酶的活性、热稳定性、抗菌性以及稳定性等。
通过这些测试，可以确定提取的酵母蔗糖酶的性能，从而确保它能够满足采用的要求。
四、应用实践酵母蔗糖酶的提取方法在实际应用中几乎是必不可少的，它可以用来生产糖浆、糖精、酒精、淀粉、葡萄糖以及蔗糖衍生物等，常用于食品加工、精细化工、制药行业等。
此外，这种提取方法还可以应用于糖类合成、氨基酸修饰等方面，发挥着重要的作用。
综上所述，酵母蔗糖酶是一种重要的糖分解酶，用于生产糖类衍生物，它的提取方法包括发酵酵母或发酵液的原料准备、提取、性能测试以及应用实践等，是一项重要的工作。
只有抓住机会，把提取的酵母蔗糖酶用好，才能实现糖分解酶的高效利用。
酵母蔗糖酶的分离纯化
低温保持酶活性
蔗糖酶提取步骤
1.破碎细胞 10g左右的干酵母+20ml甲苯，研磨5分钟，加水
10-15ml，研磨5-10分钟，重复加水研磨，共加3 次水，离心12000rpm,4℃，5-10分钟。共分3层， 上层白色为甲苯及其抽提物，中间为水层(含酶)， 下层为细胞碎片沉淀(甲苯和水体积不用准确） 2.抽提(第一组分) 取中间水层于干净离心管，12000rpm, 4℃，510分钟，上清取出量体积并记为V1，然后留2ml保 存于冰上后面做检测，其余的样品（V1-2ml）继续 进行纯化
酵母蔗糖酶的分离纯化
生化技术综合系列实验(一)
原理
生物大分子 蛋白质 酶
生物大分子提取基本步骤
材料 破细胞
提取
检测
பைடு நூலகம்
纯化
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质， 可据酶蛋白的结构和性质选择分离提纯条件 和含量测定方法。
酶分离提纯的总目标是提高纯度（或比 活力）及收率；依据在溶液中的性质（分子 大小、溶解度、电荷、吸附等）进行分离;
将留下的一、二、三组分样标记清楚后保存于-20 ℃ 冰箱中。
注意事项
1.低温 2.一、二、三组分的准确体积V1、V2、V3 3.标记 4.离心后弃、留 5.记录现象
3.热抽提(第二组分)
调pH约5.0(加5滴1M醋酸即可)，50℃，摇动或搅 拌20分钟，冰浴冷却3分钟， 12000rpm, 4℃，5-10 分钟，量取上清体积(V2)，留2ml保存于冰上检测。 其余样（V2-2ml)继续提纯。
4.乙醇沉淀(第三组分)
酵母蔗糖酶实验报告
一、实验目的1. 学习酵母蔗糖酶的提取方法。
2. 掌握酶活力测定的原理和方法。
3. 了解酶的专一性及其影响因素。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验通过提取酵母细胞中的蔗糖酶，并在一定条件下测定其活力，以了解其催化活性。
三、实验材料与仪器材料：1. 酵母粉2. 蔗糖3. 缓冲液4. 斐林试剂5. 旋光仪仪器：1. 电子天平2. 研钵3. 移液器4. 恒温水浴锅5. 烧杯6. 试管7. 离心机四、实验步骤1. 酵母蔗糖酶的提取- 称取适量酵母粉，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆。
- 将匀浆转移至离心管中，离心分离，收集上清液即为酵母蔗糖酶提取液。
2. 酶活力测定- 取适量提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，置于恒温水浴锅中保温。
- 定时取样，用斐林试剂检测反应液中的还原糖含量。
- 根据还原糖含量计算酶活力。
3. 酶的专一性实验- 将提取液分别与蔗糖、淀粉等底物反应，观察酶的催化活性。
- 对比实验结果，分析酶的专一性。
4. 影响酶活力的因素实验- 分别在酸性、中性、碱性条件下进行酶活力测定，观察pH对酶活力的影响。
- 分别在不同温度下进行酶活力测定，观察温度对酶活力的影响。
五、实验结果与分析1. 酶活力测定- 酵母蔗糖酶提取液在37℃、pH 6.8条件下，酶活力最高，约为0.5单位/毫升。
2. 酶的专一性实验- 酵母蔗糖酶对蔗糖具有特异性催化作用，而对淀粉无催化活性。
3. 影响酶活力的因素实验- 酶活力受pH和温度的影响较大。
在pH 6.8、37℃条件下，酶活力最高；在酸性或碱性条件下，酶活力明显降低；在低温条件下，酶活力较低。
六、实验结论1. 成功提取了酵母蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 酵母蔗糖酶具有特异性催化作用，对蔗糖具有高效催化活性。
3. 酶活力受pH和温度的影响较大，适宜的pH和温度有利于提高酶活力。
七、实验讨论1. 本实验中，酶活力的测定方法较为简单，但结果准确可靠。
生化综合实验-酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究一、蔗糖酶的制备1、提取称取14.997g干酵母粉于250ml小烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。
成糊状后加入1.499g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀。
再于35℃恒温水浴中搅拌30min，然后补加30ml蒸馏水，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜。
之后，1000r/min离心10min，抽取酯层后再次离心，得到无细胞提取液。
用1M HCl将其PH调至5.0，即可得到级分Ⅰ。
（取出3ml于冰箱中保存）2、热处理（1）盛有粗级分Ⅰ的离心管放入50℃水浴中保温30min，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，1000r/min离心10min。
（3）上清液即为热级分Ⅱ。
（取出3ml于冰箱中保存）3、乙醇沉淀将热级分Ⅱ转入小烧杯中，放入冰浴，逐滴加入等体积预冷的95%乙醇，同时轻轻搅拌（此过程共需30 min）。
然后在冰浴中静置10 min，以沉淀完全。
然后4℃，1000r/min离心10min。
倾去上清，并滴干。
将沉淀保存于离心管中，冷冻保存，此即级分Ⅲ。
二、蔗糖酶的纯化将3ml级分Ⅲ加入洗脱柱中进行梯度洗脱。
及洗脱峰图如下：三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定（一）还原糖含量测定1、各级分稀释倍数的确定级分Ⅰ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅱ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅲ：取50μl稀释至15ml（300倍）取20μl稀释至2ml（100倍）释100倍。
在上述表格中，Glu含量是由标准曲线求得的，E'=Glu含量*稀释倍数/（10 min*0.6 ml）Units=0.6 ml/Glu平均含量/2/10min/稀释倍数由洗脱峰可知，第二个和第三个峰最有可能是目标蛋白（第一个峰一般情况下是杂蛋备注：由测定数据可知，第二个峰不是目标蛋白，第三个峰为目标蛋白。
（二）蛋白质含量测定1、各级分稀释倍数的确定由以上数据可知，级分Ⅰ和级分Ⅱ不需稀释，级分Ⅲ需稀释5倍。
酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取方法摘要：采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶，经质量分数50%的乙醇分级沉淀、MonoQ阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。
比较了上述3种提取方法并对该酶的部分性质进行了研究。
纯化的酶经等电聚焦测定，等电点为5.6，SDS-PAGE鉴定其相对分子质量为60kD。
以蔗糖为底物测得酵母蔗糖酶的表观米氏常数Km为0.013mol／L。
结果显示3种提取方法各有优劣，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。
其中SDS抽提法的效率最高，加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。
关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化蔗糖酶(Sucrase，EC 3．2．1．26)又称转化酶(Invertase)。
可作用于B一1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。
由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍，在工业上具有较高的经济价值。
可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，以甲苯自溶法最为常见。
作者采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种不同的方法从酵母中提取蔗糖酶，将冻融法和SDS法提取的蔗糖酶进一步纯化，并对其基本性质进行了研究。
通过不同提取方法的比较，为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的下游技术开发，提供了实验依据。
1材料与方法1．1材料酵母，安琪酵母股份有限公司提供；MonoQ(10／10)阴离子交换层析柱、PhastGelIEF3-9胶，Amersham公司提供。
1．2主要化学试剂和仪器十二烷基硫酸钠(SDS)，Serva公司提供；等电点标准品，Amersham公司提供；其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。
UV一2201型紫外可见光分光光度计，Shimadzu公司制造；Waters650型高级蛋白纯化系统，Waters公司制造；PhastSystem全自动快速水平电泳仪，Amersham公司制造；高速冷冻离心机，Hitachi公司制造；冷冻干燥器，Labconco公司制造；电泳仪，Bio-Rad公司制造；精密酸度计，Orion公司制造。
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酵母蔗糖酶的提取方法摘要：采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶，经质量分数50%的乙醇分级沉淀、MonoQ阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。
比较了上述3种提取方法并对该酶的部分性质进行了研究。
纯化的酶经等电聚焦测定，等电点为5.6，SDS-PAGE鉴定其相对分子质量为60kD。
以蔗糖为底物测得酵母蔗糖酶的表观米氏常数Km为0.013mol／L。
结果显示3种提取方法各有优劣，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。
其中SDS抽提法的效率最高，加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。
关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化蔗糖酶(Sucrase，EC 3．2．1．26)又称转化酶(Invertase)。
可作用于B一1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。
由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍，在工业上具有较高的经济价值。
可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，以甲苯自溶法最为常见。
作者采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种不同的方法从酵母中提取蔗糖酶，将冻融法和SDS法提取的蔗糖酶进一步纯化，并对其基本性质进行了研究。
通过不同提取方法的比较，为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的下游技术开发，提供了实验依据。
1材料与方法1．1材料酵母，安琪酵母股份有限公司提供；MonoQ(10／10)阴离子交换层析柱、PhastGelIEF3-9胶，Amersham公司提供。
1．2主要化学试剂和仪器十二烷基硫酸钠(SDS)，Serva公司提供；等电点标准品，Amersham公司提供；其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。
UV一2201型紫外可见光分光光度计，Shimadzu公司制造；Waters650型高级蛋白纯化系统，Waters公司制造；PhastSystem全自动快速水平电泳仪，Amersham公司制造；高速冷冻离心机，Hitachi公司制造；冷冻干燥器，Labconco公司制造；电泳仪，Bio-Rad公司制造；精密酸度计，Orion公司制造。
1．3酶活性测定适当稀释的酶液0．5mL，加入0．3mL pH 4．6、0。
1mol／L的NaAc—HAc缓冲液，0．2mL0．1mol／L的蔗糖，37℃准确反应15min，后加0．125mL 1mol／L的NaOH中止反应。
用DNS法叩在540nm波长下测定形成的还原糖量。
在测定条件下以每分钟内能水解蔗糖成还原糖，经DNS测定光吸收读数为1mA所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
1．4蛋白质含量的测定按Lowry氏法_1叩测定蛋白质的浓度，以牛血清白蛋白为标准，绘制标准曲线。
l-5 SDS-PAGE分离胶质量分数为12，浓缩胶质量分数为5。
1．6等电聚焦用PhastSystem全自动快速水平电泳仪进行等电聚焦电泳。
电泳程序的设置参照Amersham 公司使用手册。
1．7粗酶制备1．7．1甲苯自溶法称取酵母10g，加入2OmL双蒸水使其溶解，加入2．4gNaAc和4．5mL 甲苯，摇床振荡10min，37℃恒温水浴69h。
再加入4．8mL4mol／L的HAc和15mL双蒸水，调pH至4．5，于4℃、3000r／min离心30min，离心后将中层清液移出即为粗制酶液，4℃保存。
1．7．2冻融法称取酵母10g，加入2OmL双蒸水，置于预先冷却的研钵中，研磨25min，冰箱中冷冻约15min(以研磨内液面上刚出现冻结为宜)，取出再研磨25min，重复以上步骤两次。
后置于冰箱中冷冻3h取出，温浴融化，用1mol／L的HAc调pH至5．0，40℃水浴30min，冷却后4℃、12000r／min离心15min，取上清液即为粗制酶液，4℃保存。
1.7.3 SDS抽提法称取酵母10g，加入60mL0．3mmol／L的SDS溶解，40℃水浴12h后取出，4℃、12000r ／min离心15min，取上清液即为粗制酶液，4℃保存。
1．8乙醇分级纯化在冻融法和SDS抽提法提取的粗制酶液中加入乙醇使其质量分数达30%，4℃放置过夜，4℃12000r／min离心15min，取上清液，再追加乙醇使其终质量分数达50%。
4℃放置1h，4℃、12000r／min离心15min，弃上清液，沉淀用双蒸水溶解，4℃保存。
经SDS抽提法提取，质量分数50%的乙醇沉淀所得的酶液对透析液(pH 7．3、0．05mol／LTris-HC1缓冲液)充分透析，所得透析液4℃保存。
1．9 MonoQ阴离子交换柱层析冻融法和SDS抽提法提取的酵母蔗糖酶经上步纯化后，上MonoQ(10／10)阴离子交换柱(用pH7．3、0．05mol／LTris—HC1缓冲液充分平衡过)，然后用0～1mol／L、60min线性梯度的NaC1溶液(内含pH 7．3、0．05mol／LTriS-Hcl缓冲液)洗脱。
体积流量为0．5mL／min，每管收集3mL，紫外检测波长为280nm。
测定各管洗脱液的蔗糖酶活性与蛋白质含量，合并蔗糖酶活力高的若干管洗脱液，经过对水透析脱盐，冷冻干燥后即为纯化的酵母蔗糖酶。
2结果2．1提取方法对酵母蔗糖酶活性的影响采用3种方法从酵母中提取蔗糖酶，其活性比较结果见表1。
从表中可看出，SDS抽提法的酶活0．2性最高，冻融法次之，常规的甲苯自溶法酶活性最低。
表1 3种提取方法所得酵母蔗糖酶活性比较2．2不同SDS浓度提取酵母蔗糖酶效果的比较从表2可以看出，分别用浓度为0．3mmol／L、0．9mmol／L、1．5erotol／L和30mmol ／L的SDS提取酵母中的蔗糖酶，当加入0．3mmol／LSDS时，该酶的总活力最大，蛋白量最少，抽提效率最高。
表2不同SDS浓度提取酵母蔗糖酶的比较2．3冻融法和SDS抽提法提取出的酵母蔗糖酶的进一步纯化将冻融法和SDS抽提法提取出的蔗糖酶活性高的粗制酶液经质量分数50%的乙醇沉淀，溶解透析后，过MonoQ阴离子交换柱，结果均出现两个峰(见图1、图2)。
依洗脱出现的先后顺序分别称为峰I和峰Ⅱ。
经酶活性检测和蛋白质含量测定，表明只有峰I具有蔗糖酶活性，而且蔗糖酶活性和酶液的蛋白质含量成正比，为蔗糖酶活性峰。
收集MonoQ阴离子交换柱层析后具有较高蔗糖酶活性的峰工的各管洗脱液，冷冻干燥浓缩，得到纯化的酵母蔗糖酶。
冻融法与SDS抽提法分别提取纯化出的酵母蔗糖酶的比较结果如表3所示。
SDS抽提法提取的蔗糖酶具有较高的酶活性，经质量分数50%的乙醇沉淀后回收率为86．5%。
经过MonoQ阴离子交换柱层析后，冻融法和SDS抽提法所得蔗糖酶的纯化倍数分别是相应粗酶液的273倍和150倍，具体结果见表4。
图1 MonoQ阴离子交换柱层析对冻融法提取的酵母图2 MonoQ阴离子交换柱层析对SDS抽提法提取的表3冻融法和SDS抽提法提取纯化的酵母蔗糖酶的比较纯化的酵母蔗糖酶经等电聚焦分析(见图3)，显示为单一条带，由此证明纯化的酵母蔗糖酶是均一的。
图3酵母蔗糖酶的等电点测定2．4米氏常数Km的测定用5～20mmol／L的蔗糖在pH4．6、37℃条件下与蔗糖酶作用15min。
用双倒数作图法测得酵母蔗糖酶的表观Km值为0．013mol／L(见图4)。
图4酵母蔗糖酶的Lineweaver-Burk2．5酵母蔗糖酶等电点和相对分子质量测定经等电聚焦测得酵母蔗糖酶的等电点为5．6(见图3)，SDS-PAGE测得其相对分子质量为60 kD(见图5)。
3讨论酵母蔗糖酶的提取较常使用甲苯自溶法的，冻融法和SDS抽提法报道较少。
本实验中比较了上述3种酵母蔗糖酶的提取方法(见表1)，可以看出图5酵母蔗糖酶的SDS-PAGE相对分子质量测定SDS抽提法和冻融法的酶活性远高于甲苯自溶法的，分别是甲苯自溶法的1120倍和534倍。
尽管甲苯自溶法所用试剂简单、价格低廉，但由于其耗时长、重复性差、酶活性低等缺陷，提取效率远不如其它两种方法。
通过对不同SDS浓度提取酵母蔗糖酶效果的比较，可以看出(见表2)，随着SDS浓度的增加，总蛋白量增大，但酶的总活力增幅较小，比活力也随着SDS浓度的增加逐渐下降。
故SDS浓度为0．3mmol／I最适合提取酵母蔗糖酶，可以在保持酶的总活力较高的情况下尽量减少引入杂蛋白，更有利于下一步的纯化。
从表3可以看出，SDS抽提法对酵母蔗糖酶的提取效率比较高，是冻融法的2倍，但其中总蛋白量提取也较高，是冻融法的3倍，因此在采用SDS抽提法后，对酵母蔗糖酶的纯化需要去除较多的杂蛋白。
分别测定冻融法和SDS抽提法纯化出的酵母蔗糖酶的米氏常数Km，结果基本相同，均为0．013mol／L(见图2)。
这一结果与柑叶片、甘薯叶片蔗糖酶相似。
测定上述两种方法提取纯化出的酵母蔗糖酶的等电点均为5．6，相比较文献[5]中的结果略高，这可能与酵母的来源和种属有关。
从SDS-PAGE实验结果可知，酵母蔗糖酶的相对分子质量为60kD，与文献中报道的相对分子质量相近。
4结语综上所述，研究中所用3种提取酵母蔗糖酶的方法都存在优缺点，但从提取效率来看，SDS 抽提法最高，还具有操作简便易行、生产成本低、回收率高等特点，更适合酵母蔗糖酶的工业化大规模生产。
鉴于酵母蔗糖酶在食品工业等方面的巨大应用潜力，目前的各种提取方法仍需进一步改进。
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