酵母蔗糖酶的固定化
酵母蔗糖酶固定化及应用
酵母蔗糖酶固定化及应用酵母蔗糖酶是一种重要的酶类，在生物技术、制药和食品加工行业中有着广泛的应用。
对于酵母蔗糖酶的固定化技术，近年来研究逐渐深入。
基于此，本文将探讨酵母蔗糖酶固定化的相关技术及其应用。
一、酵母蔗糖酶的固定化技术1. 常用的固定化技术酵母蔗糖酶的固定化技术主要包括物理吸附、共价键结、包埋化、交联和细胞包埋等方法。
其中，物理吸附、共价键结和包埋化方法操作简单，但稳定性较差。
而交联和细胞包埋方法稳定性较高，但操作繁琐、耗时长。
2. 固定化载体的选择对于酵母蔗糖酶固定化，选择合适的载体是十分重要的。
固定化载体应具有良好的生物相容性、化学稳定性、机械强度和比表面积，以保证固定化酶的稳定性和活性。
目前，常用的载体有聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸钙凝胶、硅胶、磁性微粒子、生物纤维素、玻璃等。
3. 固定化条件的优化在固定化过程中，对于固定化条件的优化也是非常重要的。
其中，主要包括pH 值、温度、离子强度、连接剂种类和浓度等因素。
通过优化固定化条件，可以提高固定化酶的稳定性和活性，延长固定化酶的使用寿命。
二、酵母蔗糖酶固定化的应用1. 工业生产酵母蔗糖酶固定化技术在工业上的应用非常广泛，主要包括分离和纯化制药物、糖类及氨基酸、制备高级糖类、酯化反应和生物制剂中。
此外，酵母蔗糖酶固定化还可以用于生产检测试剂、医用葡萄糖监测仪、食品生产和货币伪造检测等。
2. 生物技术酵母蔗糖酶固定化在生物技术中的应用主要包括预测抗体、分子诊断、生物传感器和草药分析等方面。
在生物传感器中，酵母蔗糖酶固定化可以用于制备特定的实验室设备，如生物传感器的工作电极、荧光记忆基质、假人胶、化学传感器等。
三、总结酵母蔗糖酶固定化技术应用非常广泛，因此具有非常重要的意义。
本文简要介绍了酵母蔗糖酶固定化技术的相关内容和应用。
随着科技的不断进步，这种固定化技术在未来将有更广阔的发展前景。
固定化对酵母蔗糖酶活力的影响
ｏ ｔ ｍ Ｈ ａ ． ｅ ｅ ｐ ｒ ｎ ａ ｅ ｕ ｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ： ｍｍｏ ｉ ｚ ｔ ｎ ｈ ｄ ｌ ｗ ｅ ｅ ｔ ｏ ｖ ｒ ｓ ｃ ｉｉ ． ｐｉ ｍｕ ｐ ｗ ｓ７ Ｔ ｘ ｅ ｍｅ ｔ ｌ ｓ ｌ ｈ ｗｅ ｔ ｉ ｈ ｉ ｒ ｓ ｈ ｂ ｌ ａｉ ａ ｏ ｆ ｃｓ ｎ ｉ ｅｔ ｅ ａ ｔ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｖｙ
移 液 管 烧
试 管 ７ １ 光光 度计 。 ５分
酶 的 固定 化是将 水溶 性 酶用 物理 或化 学方 法处 理 ，使 之成 为不溶 于水但 仍 具有 酶 活力 的酶 的衍 生 物， 从而 防止 酶 的失活或 水解 ， 以此延 长 酶 的使用 时 间。 技术 的 出现 为上 述 问题 的解 决提 供 了可能 。 该 目 前 常用 的酶 的固定 化方 法有 ： 物理 吸 附法 、 载体 结合 法、 交联 法 、 埋法Ⅲ 本 文主 要研究 包埋 法 固定 啤酒 包 。 酵 母 蔗糖 酶 对 酶活 力 影 响 ，并 对 固定 化前 后 温 度 、 ｐ Ｈ值 对酵母 蔗糖 酶 的影 响进行一 些探讨 。
食 品 与 发 酵 ， 技 １ ６
Ｆ ｏｄａ ｅｒ ｅ ａｔ ｎ Ｔ ｃ ｎ ｏ ｙ ｏ ｎｄＦ ｍ ｎｔ ｉ ｅ ｈ ｏｌｇ ｏ
第４ ７卷 （ ６期 ） Ｖ １ ７Ｎ ． 第 ｏ４ ，ｏ ． ６
固定化对酵母蔗糖酶活力 的影响
李 勤
（四川 工 商 职 业 技术 学 院 ， 江堰 都 摘 ６ １３ １８ ０） 要 ： 文利 用海 藻酸 钠 包埋 法 固定 啤 酒 酵 母 泥 ， 过 固定 化 前 后 蔗 糖 酶 活 力的 变化 以及 固定 化 前 后 温度 、Ｈ 值 本 通 ｐ
ｓ ｃ ｏ ｅ ｅ ｚ ｍｅ ａ ｔ ｉ ｅ ｏ ｅ ａ ｄ ａｔ ｒｉ ｕ ｒ ｓ ｎ ｙ ｃ ｉ ｔ ｂ ｆ ｒ ｎ ｆ ｍｍｏ ｉ ｚ ｔ ｎ ． ｆ ｃ ｆｔｍｐ ｒ ｔ ｒ ｎ Ｈ ｅｏ ｅ ａ ｄ ａ ｔｒｉ ｖｙ ｅ ｂ ｌ ａｉ ｉ ｏ ｅ ｅｔ ｏ ｅ ｅ ａｕ ｅ ａ ｄ ｐ ｂ ｆｒ ｎ ｆ ｍｍｏ ｉ ｚ ｔ ｎ ｎ ｅ ｂｌ ａｉ ｏ ｉ ｏ
酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定的改进方法
一、背景介绍酵母蔗糖酶是一种重要的酶类，它在葡萄糖代谢途径中起着关键作用。
酵母蔗糖酶的提取纯化及酶活测定是生物化学与分子生物学研究中常见的实验操作。
在这个过程中，酵母蔗糖酶的纯化程度和酶活测定的准确性直接影响着后续的实验结果。
二、传统提取纯化及酶活测定方法存在的问题1. 低纯度：传统的提取纯化方法往往不能够完全去除其他蛋白质或杂质，导致提取的酵母蔗糖酶纯度较低。
2. 酶活测定不精准：常见的酶活测定方法对于活性较低的酶样本测定效果较差，难以得到准确的酶活性数据。
3. 操作繁琐：传统方法需要多次离心、沉淀和洗涤等步骤，耗时且操作繁琐。
三、改进方法鉴于传统方法存在的问题，我们提出了一种改进的酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定方法，主要包括以下几个关键步骤：1. 酵母蔗糖酶提取（1）酵母细胞破碎：采用超声波破碎或高压破碎技术，将酵母细胞有效破碎，释放出蔗糖酶。
（2）蛋白质沉淀：利用差速离心法或特定沉淀剂沉淀出目标蛋白质，提高酶的纯度。
2. 酶活测定（1）比色法测定：采用改良的Folin-Phenol比色法，提高对酶活性的测定准确性。
（2）酶活性计算：采用新的酶活性计算公式，更准确地反映酶的活性水平。
四、结果与讨论我们采用改进方法对酵母蔗糖酶进行提取纯化及酶活测定，得到的结果表明，与传统方法相比，改进方法在以下几个方面有了显著改善：1. 提取纯化效果显著：采用改进方法提取的酵母蔗糖酶纯度明显提高，杂质含量大幅降低。
2. 酶活测定更准确：采用改进方法测定的酶活性数据更为准确可靠，对活性较低的酶样本也能够进行精准测定。
3. 操作简便高效：改进方法简化了提取纯化的操作步骤，减少了操作时间，提高了实验效率。
五、结论我们的改进方法在酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定中取得了良好的效果，显著提高了酶的纯度和活性测定的准确性，为相关领域的研究提供了重要的实验技术支持。
该方法的推广应用将有助于推动相关研究领域的发展，促进酵母蔗糖酶的深入研究和应用。
酵母细胞的固定化ppt课件
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海藻酸钠
Ca2+
海藻酸钙
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图9 海藻酸钠中加入酵母菌液
图10 混合均匀的海藻酸钠和酵母菌液
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先匀速推，即将滴落时暂停
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固定化酵母细胞凝胶珠
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凝胶珠弹性测试
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几组凝胶珠对比
低浓度海藻酸钠凝胶珠
高浓度海藻酸钠凝胶珠
（左1g/100mL和右2g/100mL） （3.5g/100mL即教材浓度和2g/100mL）
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思考 20 、结合专题 2 的无菌操作技术，想一想如果要求制作反复使用的固定化 酵母细胞，应该在实验过程中注意哪些问题？
分析：如果希望反复使用固定化酵母细胞，就需要避免 其他微生物的污染 。 在工业生产中，细胞的固定化是在严格 无菌 的条件下进行的。例如，配置好的 CaCl2溶液、溶化后的海藻酸钠溶液、葡萄糖溶液都需要经过 高压蒸汽灭菌 处 理；制备好的凝胶珠用 无菌 水冲洗等。
专题3 酵母细胞的固定化
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一、为什么要固定化酶 思考1、细胞中的酶，有的是游离的，也有的附着在生物膜上。有序排列在生物
膜上的一系列酶可以催化连续的化学反应，这有什么好处？ 分析：使生命活动更为 有序 和 高效 。 思考2、应用酶的过程中，人们发现了一些实际问题，例如：酶通常对强酸、强
碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易 失活 ；溶液中的酶很难回收，不 能被 再次利用 ，提高了生产成本；反应后酶会混在 产物 中，可能影响产品 质量。
结构，使酵母菌更易固定。
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思考14、本实验中，海藻酸钠的浓度对凝胶珠的形态和颜色有哪此影响？
分析：如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏______低
蔗糖酶的提取分离
蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。
结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。
关键词：蔗糖酶、酶学性质1前言蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。
可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。
由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。
本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。
2材料与方法2.1 材料与设备2.1.1 实验材料酵母、活性干酵母、壳聚糖2.1.2 试剂及配制方法葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、NaOH、Na2CO3、盐酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。
95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3)葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。
准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。
1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。
冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。
10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液1%戊二醛溶液：将4 mL 25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至100mL 0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液：称取16.4g无水乙酸钠，溶解于800ml蒸馏水，用冰乙酸调节其ph至4.5，然后定溶至1000mL。
高二下册生物酵母细胞的固定化知识点总结
1.(酵母细胞的固定化)基础知识⑴.(有哪些?固定化酶应用的实例?①.用于高果糖浆的生产;小资料：高果糖浆是指果糖含量为42%左右的糖浆;可以作为蔗糖的替代品;对人类健康有益，不会引起肥胖、糖尿病心血管疾病。
②.怎样生产高果糖浆?A.原料：葡萄糖;B.酶：葡萄糖异构酶(稳定性好，能持续发挥作用。
);C.方法：使用固定化技术，将酶固定在颗粒状载体上;将酶颗粒装到反应柱内(如图4-5);将葡萄糖溶液从反应柱上端注入;与酶接触，发生反应，生成果糖;生成果糖从反应柱下端流出。
⑵.(什么是)固定化细胞技术?固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术;包括：包埋法;化学结合法(将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上);物理吸附法;①.一般来说，酶更适合哪种方法固定化?为什么?化学结合法和物理吸附法固定化;因为酶分子较小;②.一般来说，细胞更适合用哪种方法固定化?为什么?细胞多采用包埋法固定化;因为细胞体积较大。
③.化学结合法常用的载体有哪些?明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维、聚丙烯酰胺等等④.选择哪种载体包埋酵母菌细胞?选用海藻酸钠作载体包埋酵母细胞;2.(酵母细胞的固定化)实验操作(包括哪些内容?)⑴.(怎样进行)酵母菌细胞的活化?称取1g干酵母，放入50mL的小烧杯中，加入蒸馏水10mL，用玻璃棒搅拌，使酵母菌细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右，使其活化。
⑵.(怎样)配制物质量浓度为0.025mol/L的CaCl2溶液?称取无水CaCl20.83g，放入200mL的烧杯中，加入150mL的蒸馏水，使其充分溶解，待用。
⑶.(怎样)配制海藻酸钠溶液?称取0.7g海藻酸钠，放入50mL小烧杯中，加入10ml水，酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10mL。
注意：加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。
⑷.(怎样将)海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合?将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母菌细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射其中。
实验十五固定化酵母细胞发酵蜂蜜酒
实验十五固定化酵母细胞发酵蜂蜜酒一、实验目的1. 学习固定化酵母细胞的方法。
2. 掌握蔗糖酶活力的检测方法。
二、实验原理固相酶又称为固定化酶，是通过物理及化学的处理方法，使水溶性酶和固态的水不溶性支持物(或载体)相结合而制备的。
通过酶的固定化可以将酶转变成不溶物同时仍保留酶的活力，在催化反应中具有诸多水溶性酶所不具备的优点。
常用的酶的固定化方法主要有：1. 物理吸附法；2.载体偶联法(键结合法)；3.交联法；4.包埋法；就其应用技术而言，又分为固定化酶和固定化细胞二种。
相对于水溶性酶，固定化酶的优点主要是机械强度增加，稳定性提高，可回收反复使用。
三、仪器和试剂仪器试管、1毫升吸管4支、水浴锅、精密酒精计：分度值为0.1%vol、全玻璃蒸馏器：500mL、高精度恒温水浴：20.0±0.1℃。
试剂1. 海藻酸钠若干克；2. K号酵母液；3. 10％蔗糖液：称取10克蔗糖用水定容至100毫升；4. 斐林试剂。
四、操作步骤l、称取海藻酸钠1克加入100毫升水中，微火加热溶解后冷却到30℃左右，将预先准备好的3克卡氏酵母(或K号酵母的培养液30毫升)的悬液加入混匀。
然后倒入下边装有胶管与止血夹的漏斗中，让其慢慢滴入4％氯化钙溶液中，制成直径2－3毫米的球形固定化酵母。
将此固定化酵母装入柱中，从柱上端加入10％的蜂蜜溶液，控制一定的流速，且注意室温要在25~28℃。
2、24小时后测定流出液中的还原糖含量和酒精度。
（1）葡萄糖测定空白液测定：吸取斐林试剂甲、乙液各5ml，置入150ml三角瓶中，加空白液5ml，并用滴定管预先加入适量的0.1%标准葡萄糖溶液，使后滴定时消耗0.1%标准葡萄糖溶液在1ml以内，加热至沸，立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作在1min内完成。
糖化液测定：准确吸取5ml糖化液代替5ml空白液，其余操作同上。
（2）酒精度的测定A蒸馏在20℃±5℃的工作条件下，进行该试验。
酵母蔗糖酶的纯化及其化学修饰
２１ ０ ０年 １ １月
食 品 与 生 物 技 术 学 报
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｏ ｄ Ｓ ｉｎ ｅａ ｄ Ｂｉｔｃ ｎ ｌｇ ｏ ｒ ａ ｆＦ ｏ ｃｅ ｃ ｎ ｏｅ ｈ ｏｏ ｙ
Ｖｏ ． ９ Ｎｏ ６ １２ ．
ＮＯ ． Ｖ ２ ０ ０１
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酵母蔗糖酶的固定化实验三酵母蔗糖酶的固定化一、实验原理1.固定化酶通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。
与游离酶相比，固定化酶有以下优点:?提高酶的稳定性;?易与产物分离;?可反复利用。
酶的固定化方法有:吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。
本实验用壳聚糖固定化酵母蔗糖酶属共价偶联法。
由于载体带电性质的不同，会引起酶与底物亲和力的变化，从而引起米氏常数Km值的改变。
酶固定化后，对变性剂、抑制剂的抵抗能力增强，贮存稳定性和操作稳定性也得以提高。
2.酶活测定蔗糖酶催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性，能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。
本实验用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度，在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)共热，DNS被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖醛酸及其它产物。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅成比例关系。
酶活定义: 在540 nm 光吸收处，光密度每增加0.001个光吸收值定义为1个酶活力单位。
二、实验材料、仪器和试剂1.材料壳聚糖、实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液2.仪器移液管、注射器、分光光度计、水浴锅、铁架台等3.试剂(1)1% 3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。
冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。
(2)10%蔗糖溶液(3)0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液(4) 1%戊二醛溶液:将4 mL 25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至100mL (5)0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液三、实验步骤1.壳聚糖载体的制备及戊二醛的偶联(1)称取3 g壳聚糖溶于98 mL蒸馏水中，搅拌均匀，再滴加2 mL冰醋酸，搅拌至均匀的粘稠状。
(2)称取8 g NaOH置大烧杯中，加入180 mL蒸馏水及20 mL甲醇。
1(3)将拔出推塞的注射器架在铁架台上，倒入粘稠状的壳聚糖溶液，使壳聚糖溶液从20 cm高的注射器出口滴入大烧杯中，以制备壳聚糖微球载体。
注意:为保证适宜的流速，注射器中的壳聚糖溶液不宜超过10 mL，随着壳聚糖溶液逐滴滴入大烧杯，应随时补充壳聚糖溶液至刻度，并不断轻轻晃动大烧杯。
若液体表面壳聚糖微球过于密集，应静置片刻，待微球沉入烧杯底部后继续滴加。
(4)壳聚糖溶液滴加完毕后，静止片刻，待微球完全沉入烧杯底部时，反复水洗多次至pH值中性，沥干水分。
加入1%戊二醛溶液100 mL，静置2 h，使戊二醛偶联于壳聚糖载体上。
2.固定化酶的制备(1)将静置2 h后的壳聚糖微球载体中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸馏水洗涤5次，以除去多余的戊二醛。
(2)将实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液1 mL用蒸馏水稀释至100 mL,与偶联戊二醛的壳聚糖载体混合，静置偶联过夜。
3.固定化酶的评价分别测游离酶、固定化酶以及残留酶液的酶活力。
具体如下:比色管号 1 2 3 4蔗糖溶液 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL醋酸buffer 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL游离酶/固定化酶 0 1 mL游离酶液 1 g固定化酶 1 mL残留酶液37?准确反应10 min，1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应水杨酸试剂 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mLA 5404.固定化酶性质的测定(1)固定化酶和游离酶米氏常数(Km)的测定米氏方程: v,Vmax[S]/(Km+[S]),表示酶促反应的起始速度(v)与底物浓度([S])之间的关系。
利用双倒数作图法，以1/[S]为横坐标，1/v为纵坐标，根据1/v=(Km/Vmax)×(1/[S]) +1/Vmax作出一条直线，1/Vmax为直线与纵坐标的交点，1/Km为直线与横坐标的交点，由此得出Km值。
分别按下表的操作步骤测定固定化酶和游离酶的底物浓度与光吸收值的关系(注:20粒壳聚糖微球重约1 g)，速率v通过查吸光值与葡萄糖浓度之间的标准曲线得到(见附图):2附图:葡萄糖标准曲线固定化酶米氏常数(Km)的测定比色管号 1 2 3 4 5 6 7 蔗糖溶液 0 0.1 mL 0.2 mL 0.4 mL 0.8 mL 1.6 mL 2 mLddHO 2 mL 1.9 mL 1.8 mL 1.6 mL 1.2 mL 0.4 mL 0 2醋酸buffer 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 固定化酶 1 g 1 g 1 g 1 g 1 g 1 g 1 g37?准确反应10 min，1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应水杨酸试剂 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mLA 540游离酶米氏常数(Km)的测定比色管号 1 2 3 4 5 6 7 蔗糖溶液 0 0.1 mL 0.2 mL 0.4 mL 0.8 mL 1.6 mL 2 mLddHO 2 mL 1.9 mL 1.8 mL 1.6 mL 1.2 mL 0.4 mL 0 2醋酸buffer 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 游离酶 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL37?准确反应10 min，1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应水杨酸试剂 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mLA 5403(2)变性剂乙醇对固定化酶和游离酶活力的影响变性剂乙醇对固定化酶活力的影响比色管号 1 2 3 4 5 6 7 蔗糖溶液 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 醋酸buffer 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 无水乙醇 0 0.1 mL 0.2 mL 0.4 mL 0.8 mL 1.6 mL 2 mLddHO 2 mL 1.9 mL 1.8 mL 1.6 mL 1.2 mL 0.4 mL 0 2乙醇终浓度 0 2.5% 5% 10% 20% 40% 50% 固定化酶 0 1 g 1 g 1 g 1 g 1 g 1 g37?准确反应10 min，1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应水杨酸试剂 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mLA 540变性剂乙醇对游离酶活力的影响比色管号 1 2 3 4 5 6 7 蔗糖溶液 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 醋酸buffer 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 无水乙醇 0 0.1 mL 0.2 mL 0.4 mL 0.8 mL 1.6 mL 2 mLddHO 2 mL 1.9 mL 1.8 mL 1.6 mL 1.2 mL 0.4 mL 0 2乙醇终浓度 0 2.5% 5% 10% 20% 40% 50% 游离酶 0 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL37?准确反应10 min，1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应水杨酸试剂 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mLA 540四、实验结果固定化酶总活力数1.固定化酶的评价活力回收= ×100% 溶液酶总活力数固定化酶总活力数相对活力= ×100% 溶液酶总活力数-残留酶活力数2.固定化酶性质的测定采用双倒数作图法分别得出固定化酶与游离酶的Km值，测定固定化酶与游离酶对变性剂乙醇抵抗力的不同，并对实验结果进行分析。
4实验四酵母蔗糖酶活性功能基团的化学修饰一、实验原理1(化学修饰原理N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)能特异地修饰蛋白质分子中色氨酸残基的吲哚基团，使吲哚基氧化成羟吲哚衍生物，从而改变吲哚基的化学性质。
若色氨酸残基是酶活性中心的必需基团，那么经NBS修饰后，酶活性丧失的程度与修饰剂的浓度有化学计量关系，且在底物存在的情况下，修饰剂NBS不影响酶的活力。
2(酶活测定原理(DNS法)见实验三二、实验材料、仪器和试剂1(材料实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液2(仪器恒温水浴锅、分光光度计、移液枪3(试剂(1)1 mmol/L的N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)溶液(2)1% 3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂(3)10%蔗糖溶液(4)0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液三、操作步骤N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)对蔗糖酶的修饰与酶活测定取8只试管，编号，按下表操作:比色管号 1 2 3 4 5 6 7 8 酵母蔗糖酶酶液/μL \ 100 100 100 100 100 100 100醋酸buffer/μL 200 \ 20 40 60 80 100 \ 1 mmol/L的NBS/μL \ 100 80 60 40 20 \ 100 NBS终浓度/mmol/L 0 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 137?水浴中修饰20 min \蔗糖溶液/μL 100 100 100 100 100 100 100 10037?准确反应20 min，100 μL 1mol/L NaOH终止酶促反应水杨酸试剂/μL 100 100 100 100 100 100 100 100沸水浴精确反应5 min,冷却后加入4.5 mL ddHO 2A 540相对活力%(以7号管酶活力为100%)5四、实验结果以NBS浓度为横坐标，相对活力为纵坐标绘制折线图，并分析不同浓度的NBS 对酵母蔗糖酶活力的影响，得出结论。
五、注意事项(1)酶活力低时，可适当增加酶液体积，相应减少缓冲液体积。
(2)酶活性测定的反应时间及与DNS共沸的时间一定要精准。
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