第十八章 基因诊断与基因治疗 %28gene

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（4）菌落杂交（colony hybridization）
该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。
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（5）夹心杂交法（sanwich hybridization）
RE
RE
A
B
固相支持物
A
B
片段B捕捉探针
A
B
片断A 检测探针
本法优点： 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确16 。
核酸探针
是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与 待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同 源序列。
探针标记物
有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、
荧光素等）两大类。
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• 1.核酸分子杂交的分类
• 液相杂交： 待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中
进行杂交反应；
• 固相杂交： 待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶
（其基本过程类似于上述Southern法）
提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→ 转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影 或显色→检测信号。
Northern法可用于检测法：
基本过程： 将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→ 用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂 交信号→分析结果。 优点： 简便、快速、灵敏、样本用量少； 缺点： 特异性不高，有一定比例的假阳性。
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（1）DNA模板的变性
将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成 为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 ）， 并游离于反应体系中作为模板；
（2）模板与引物的结合（退火或复性）
将体系温度降至合适温度（550C左右），使加入 的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。
第十八章 基因诊断与基因治疗
(gene diagnosis and therapy)
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本章讨论二大方面内容
基因诊断 基因治疗
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第一节 基 因 诊 断
一. 基因诊断概念 ： 利用现代分子生物学和分子遗传学
的技术方法，直接检测基因结构及其表 达水平是否异常，从而对疾病作出诊断 的方法。
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二. 基因诊断特点：
（二）聚合酶链反应(PCR，polymerase chain reaction)技术
PCR是体外基因扩增技术。它利用体内DNA复制的 原理和DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA的大量 扩增。
1. PCR基本原理：
PCR技术在模板、dNTP、Mg2+等条件下，用耐热 的Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引 物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3 个步骤的循环过程（2530个循环），目的DNA可扩增 100万倍以上。
按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。 模板DNA 扩增倍数T=2n (n: 循环次数)。
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PCR技术原理示意图
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2. PCR各要素及其作用
（1） 模板
PCR模板可以是DNA或RNA。
以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝；
碱基互补
DNA与DNA杂交： A=T、 G≡C ; DNA与RNA杂交: A=U、 G≡C ;
变性：
在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；
复性：
随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补6双链
• DNA:DNA
hybridization 5’ A T G C C G A T 3’ T A C G G C
（由于加入的引物量远多于模板量，所以引物与模板的结合比 例远大于模板自身的复性）；
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（3）引物延伸
将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP 按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端，使引物延伸， 形成两条与模板互补的新链。
以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸） （新合成的链可作为下一轮循环的模板）
Southern 印迹杂交法（Southern blotting ）
Northern 印迹杂交法（Northern blotting ）
斑点杂交或狭缝杂交法 （Spot/ Slot blot hybridization）
菌落杂交（colony hybridization）
夹心杂交法（sanwich hybridization）
（6）原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）
将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交， 进而检测特异的DNA或RNA序列。
细胞原位杂交 有 组织切片原位杂交
DNA-DNA RNA-DNA 三类杂交 RNA-RNA 该法优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的 形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态1。7
液中的特异性探针进行杂交反应。
常用固相杂交支持物： 硝酸纤维素膜、尼龙膜等－－－
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• 2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序
制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化DNA片段
预杂交
制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
杂交
漂洗去除未参与杂交的标记探针
检测杂交信号
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3. 常用固相核酸杂交方法
DNA:RNA
5’ A T G C G T A 3’ U A C G C A U
RNA:RNA
5’ A U G C U A C G 3’ U A C G A U G C
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利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理， 可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待 测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同 源核酸序列的存在。
针对性强，特异性高 检测灵敏度和精确性高 实用性强，诊断范围广
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三. 基因诊断常用技术方法
核酸分子杂交技术 聚合酶链反应（PCR）技术 生物芯片 基因测序
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（一）核酸分子杂交技术
核酸分子杂交
是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下， 与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。
主要依据： 碱基互补、变性和复性
原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）
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(1) Southern 印迹杂交法 （Southern blotting ）
限制性内切酶酶切 提取DNA
检测杂交信号
Southern 法可用于检测特异的DNA序列片断、
基因定位、分子量测定等。
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（2）Northern 印迹杂交法 （Northern blotting ）