生物实验技术：显微切割
激光捕获显微切割操作方法
激光捕获显微切割激光捕获显微切割（（laser capture microdissection LCM laser capture microdissection LCM））操作方法操作方法蛋白质组学是当今肿瘤学研究领域中的一个热点，而“差异”蛋白质组学又是蛋白质组学研究的一个突破口。
在有关“差异”的研究中，若原始样品不是分别来自同一类型，或样品存在着杂质蛋白的污染，那么所得实验数据的准确性和说服力必然会受到影响[1]。
众所周知，人体组织器官是多种细胞的复合，肿瘤组织的不均一性是肿瘤细胞的重要特征。
因此，如何从复杂、不均一的样品中获得理想的高同质性的组分成为实验中亟需解决的主要问题之一。
激光捕获显微切割（laser capture microdissection LCM）技术的出现为上述问题提供很好的解决方案。
该方法的突出特点是能在目视下从样品中特异挑选同类细胞乃至单一细胞；从而剔除间质细胞和坏死及其他可能影响结果分析的杂质成分[2]。
本研究应用LCM 针对不同类型组织标本，选择性获取同质肺癌细胞和配对正常细胞；以期探讨该方法在肺癌研究中的技术参数和操作流程。
1 材料与方法材料与方法 1.1标本的收集及制备标本的收集及制备 收集西安交通大学医学院第二附属医院胸外科、陕西省人民医院胸心外科、陕西省肿瘤医院胸外科2005-2006年经病理诊断证实的手术切除肿瘤标本12例，其中肺鳞癌6例，肺腺癌6例，正常对照组织为同一患者正常肺组织。
12例患者中男性8例，女性4例；有吸烟史者5人，平均吸烟指数1900支/年；肿瘤分期：I 期2例、II 期7例（IIA3例，IIB4例）、III 期3例。
所有病例标本均在手术室采集，具体操作如下：待组织标本离体后立即切取肿瘤组织，同时切取正常对照组织；用4℃冰盐水冲洗3—5次，将血液冲净，均匀分割成0.2cm×0.2cm×0.2cm大小；分装于标志清楚的0.5mL离心管中；先置液氮中速冻，后置于-80℃冰箱保存备用。
生物显微镜技术6-显微操作技
Leica转基因操作系统 LdcaASTP实现了把光学显微镜和显微操 作器的电控元件组合在同一控制部件内的第一台“转基因操作系 统”。用同一个控制器可以同步调控显微镜和显微操作器。
显微操作(NARISHIGE)系统 Nikon与NARISHIGE合作的结晶。 *采用油压传动的远程驱动*针对不同用途，可灵活选择不同 的配置方案
克隆羊“多莉”
克隆羊之父维尔莫特
克隆羊“多莉” 和它生下的小羊
细胞核移植技术流程
①供体体细胞经细胞培养后，提取细胞核；
②提取卵巢卵母细胞，在其减数分裂第二次 分裂中期除去细胞核，制成无核细胞质；
③将供体核与无核卵母细胞质融合，并培养 成早期胚胎；
④将早期胚胎移植到代孕母体子宫内，发育 成新个体。
显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、 嵌合体技术、胚胎移植、显微切割、细胞膜 打孔、外源基因显微注射导入等，是现代生 物学重要的实验技能之一。
第一节 显微操作仪
显微操作仪目前使用较为广泛的有两类： 一类为球面、齿轮机械传动操作式，如德
国Leica公司生产的MicromanipulatorM； 一类为液压传动操作式，如日本Narishige
细胞核移植技术，主要是用来研究胚胎发育过程中， 细胞核和细胞质的功能，以及二者间的相互关系； 探讨有关遗传，发育和细胞分化等方面的一些基本 理论问题。
细胞核移植技术已有几十年的历史。
迄今为止，已有下面9种供核类型的体细胞核移植 后代产生：胎儿成纤维细胞 、成体乳腺细胞 、卵 丘/颗粒细胞 、输卵管/子宫上皮细胞 、肌肉组织 的细胞 、成体耳部成纤维细胞、睾丸支持细胞 、 小鼠尾尖细胞 、初乳的乳腺上皮细胞
生物切片和显微标本制作技术
生物切片和显微标本制作技术生物切片和显微标本制作技术是组织学、胚胎学、生理学及细胞学等学科研究观察细胞、组织的生理、病理形态变化的一种主要方法。
大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显微观察的，也无法看到其内部结构。
因为材料较厚，光线不易透过，以致不易看清其结构，另外细胞内的各个结构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过，也难以辨明。
但在经过固定、脱水、透明、包埋等手续后就可把材料切成较薄的片，再用不同的染色方法就可以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成份含量的变化，就可以在显微镜下清楚地看到其中不同的区域组分状态，切片也便于保存，所以是教学和科研中常用的方法。
显微标本制作有许多不同的方法，一般可分为非切片法与切片法两大类：非切片法有涂片、铺片、压片、磨片、整装片等；切片法又包括石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法等。
显微标本制作技术虽是生物学中很基本的操作技术，但由于生物材料的个体差异、化学试剂的多样性，因此操作技术相当细致而复杂，方法也很多，每一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心细致，不断总结经验，才能得到较好的结果。
实验用品1、器械电热温箱：体积较小，温度调节一般在60-75℃显微镜：用于观察染色情况，及检查切片效果切片机：切片用，通常为了能够得到连续切片，多用转动切片机切片刀：为切片机必备配件磨刀机：磨刀用电热温台：为了展平蜡带或烤干制片天平：配溶液用玻璃器皿：染色缸、烧杯、量桶、试剂瓶、滴液管等其它：剪子、镊子、解剖针、毛笔、刀片、小木块等2、常用试剂2.1 常用固定剂包音氏固定液：由苦味酸饱和水溶液75毫升、甲醛（40%）25毫升、冰醋酸5毫升配制。
该固定液适用于无脊柱动物，其渗透力强，组织收缩小，不易变形。
海利氏液：由重铬酸钾2.5克、氯化汞6克、蒸馏水100毫升、40%甲醛液5毫升配制。
该液适用于骨髓，脾，肝等适血器官的固定。
卡诺固定液：由纯酒精15毫升、冰醋酸5毫升配制。
显微切割
第二代激光切割技术
• Laser Microbeam Microdissection LMM • Laser Pressure Catapulting LPC
- 德国Palm公司基于第一代的缺点，开创性地
采用紫外激光沿样品外缘切割的工作方式， 利用激光离焦面的冲击力，将分离后的样 品向上弹射收集
• 激光切割技术从切片中分选出泡状巨噬细胞
• 结合实时定量PCR检测技术分析CD68的表达并将其与整个切片样 品中CD68的表达量做对比 • 同时用巨噬细胞不表达的α-ACTIN 作为污染标记分子 。
案例2 －动脉样硬化组织中泡状巨噬细胞基因表达变化 结果，
• 所取的LMD样品中检测不到 α-actin的表达； • CD68的表达水平被LCM技 术富集了33.6倍，说明了激 光切割方法的优越性。
射分离技术（selective ultraviolet radiation fractionation，
SURF） – 先用墨水选择性在切片上的覆盖需要的细胞或组织，然后用高 能量的紫外激光束破坏周围无关组织中的DNA。用墨水覆盖区 的细胞的DNA得以保存，再用针采集
第一代商品化激光切割产品
• laser capture microdissection (LCM) – 1995年Liotta教授等进一步发展的非接触性激光显微切割技术 （non-contact laser microdissection of membrane-mounted
第二代激光切割技术示意图
• 开创性的一些意义
• 紫外激光的使用
• • • • - 更有效的分离能力； - 对RNA、蛋白质的保护； 首次提出样品的无接触收集 概念 对荧光观察方式的支持
显微切割技术章
第七章显微切割技术人体组织是由相互作用的不同的细胞群体组成的，这些细胞群体彼此组成复杂的三维结构，每种细胞均有自己的独特的mRNA与蛋白质表达（表现型）。
因此在复杂的组织中取得同质性的样本是相当困难的。
尤其在肿瘤的病理学研究中，样本的同质性是经常遇到的问题。
例如，霍奇金病的肿瘤细胞——Reed-Sternberg细胞和Hodgkin细胞（R-S/H细胞），通常单个分散在大量的反应性细胞（如淋巴细胞、组织细胞、嗜酸性粒细胞和浆细胞）组成的背景之中，给R-S/H细胞起源的研究带来很大的困难。
随着分子病理学研究的深入，需要分离的样本越来越小，从大块的组织精确到单个的细胞，甚至细胞器或者染色体。
常规的研究方法对此无能为力，而显微切割技术的出现解决了上述难题。
在显微切割技术（microdissection technique）发展之前，进行原位的细胞表型的研究方法是免疫组化和原位杂交。
但是免疫组化和原位杂交方法一般只能局限于一种或是几种基因表达的分析，而且难以进行DNA、mRNA和蛋白质的定量分析（如突变、缺失）。
显微切割技术能够对于组织病理学上确定的细胞群（甚至精确到一个特定的细胞，或特定的细胞器或特定的染色体）进行分子病理学研究，达到高度敏感性和高度特异性的统一。
尤其是在需研究的细胞只占样本中细胞的少数时，以及需研究的细胞呈散在分布时，显微切割的重要性尤为明显。
加之现在的免疫组织化学和原位杂交等技术可以在切片上特异性定位所需的细胞，因此显微切割技术在最近几年中得到了迅速地发展。
由于和高通量（high-throughput）基因分析（基因芯片）以及蛋白分析技术结合，显微切割技术显示出良好的发展前景（图7-1）。
图7-1一、显微切割技术发展的回顾组织显微切割的概念尤为简单，即直接在光学显微镜下从异质性的组织样本中选取某一特定的细胞群。
实际上，要达到这一目的在技术上经历了以下几个阶段：早期是从冰冻组织切片上在肉眼下用解剖刀刮去不需要的部分，剩下感兴趣的组织。
激光辅助显微切割技术分离植物细胞研究进展
激光辅助显微切割技术分离植物细胞研究进展摘要LAM是一种强大的工具，可用于从获取的生物标本中分离特定的组织、细胞型甚至器官，这有益于RNA、DNA、蛋白质的提取。
分析该技术的原理及在植物研究中的重要性和优越性，介绍了LAM的工作原理及发展概况，并对其发展前景进行了展望。
关键词LAM；激光辅助显微切割；分离植物细胞植物体是由彼此相互联系的多种类型细胞所构成，正是由于这种结构上的复杂性，目前多数的研究都是通过分析混合组织样品来获得数据。
虽然这些研究提供了一些有用的信息，但是有时对某些结果却不能做出很好的解释，尤其是某一种类型细胞占组织的主要部分，而研究对象只是暂时存在其中或细胞数量相对较少的时候，具有很大的局限性。
因此，为了获得特定类型细胞的准确信息，分离出同质的目标细胞就显得非常重要。
1激光辅助显微切割（LAM）的优越性已报道过的从植物中分离同质细胞样品的方法至少有3种。
一种是从其中分离原生质体，这种方法能够获得很多同一种类型的细胞，但可能导致基因或蛋白表达发生未知的变化。
另一种是用毛细管从植物活体中获得植物细胞组，所获得的细胞样品虽然能进行部分代谢、基因表达和蛋白表达的分析，但数量上的限制使得应用这种方法很难采集到足够数量的单纯种类细胞样品来进行全局分析（尤其对RNA和蛋白质）。
此外，为了保持细胞特定的生理状态，样品可以在固定、包埋、切片后，从冰冻或者石蜡包埋的组织中分离，分离技术包括直接手工分离和激光显微切割分离。
激光捕获显微切割技术与以上其他方法相比，能够精确、快捷地获得大量的特定种类细胞样品，显现出极大的优越性。
LAM是一种强大的工具，可用于从获取的生物标本中分离特定的组织、细胞型甚至器官，这有益于RNA、DNA、蛋白质的提取。
LAM在生物研究的许多领域已经是一个常规技术，现在也已经成功用于植物组织的研究。
2LAM的基础原理及发展自1996年激光捕获显微切割技术首次采用以来，已经有多种激光捕获显微切割系统得到开发，文献报道中经常使用的是Arcturus Engineering公司的PixCell II系统和P.A.L.M.Microlaser Technologies公司的PALM Microbeam系统。
生物显微技术实验指导
一、实验目的掌握制作石蜡切片中固定、包埋的基本操作技术。
二、实验用品1、实验材料：鱼2、实验试剂：10%甲醛溶液（40%甲醛10ml，蒸馏水90ml）、50%酒精、70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精、二甲苯、石蜡。
3、实验器具：解剖器，双面刀片，小瓶，牛皮纸、电热恒温箱、脱水机、包埋机。
三、实验步骤1、取材：用任何杀生的方法把鱼杀死，将腹腔打开，切取0.5cm3左右大小的肝脏、肠等组织。
2、固定：将切好的组织直接投入10%甲醛固定液中，固定24h。
3、脱水：50%酒精→70%酒精→80%酒精→90%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。
每级1-2h。
70%酒精处可长期保存。
4、透明：1/2二甲苯+1/2100%酒精(1-2h) →纯二甲苯(1h) →纯二甲苯(1h)5、浸蜡：石蜡先置于60℃的温箱中，倒入含二甲苯及材料的小瓶中置于37℃温箱中，放置2-4小时。
6、包埋：先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。
四、作业分析总结石蜡切片技术中固定和包埋的操作注意事项有哪些？附：折纸盒按下列顺序折叠：(1) 折AA'及BB'；(2) 折CC'及DD'；(3) 折CE'与AE'、向外夹出EE'。
同样折出FF'，GG'及HH'；(4) 使CE'E与E'IE两三角形相叠，并沿E'C和EI重叠的折痕向后转折。
同样折其余三只角；(5)折RIJF向外，同样折出GKLH，即折成所需的纸盒。
一、实验目的掌握制作石蜡切片中切片、贴片的基本操作技术。
二、实验用品：1．实验试剂：95%酒精、100%酒精、二甲苯、明胶液、蒸馏水。
激光显微切割技术切割棉花单条染色体的研究
进而表明所切割和收集的单条染色体的DNA来自亚洲棉基 因组DNA.DOP-PCR微量扩，经过琼脂糖电泳和Southern杂 交的验证，充
分表明了利用SLuCUT全自动激光显微切割系统能够简单 快速高效地完成植物染色体的微切割、微分离和微收集。 3讨论SLuCUT全自动激光
显微切割系统（以下简称切割系统）具有操作简单、快 速准确、轻污染等特点，主要表现在选择切割路径方便， 该切割系统可通过鼠标勾画各种不规则
的形状或者利用多种绘图图形来选择切割目标，因此可 实现任意勾画切割目标，而且所切割的样本（目标染色 体）不会被降解。该切割系统的激光直径
小于1激光能量、聚焦和切割速度由软件控制，采用的是 冷激光切割，激光不与分离样本直接接触，不会因热效 应而对DNA、RNA和蛋白等造成降
解并且通过有黏性的收集管盖黏附分离下来的膜和样本 提取过程不需要激光轰击，所以对样本没有损伤，且污 染较轻。整个操作过程，从切割系统载物
台的移动、切割路径的任意勾画、切割长度的测量、聚 焦、激光能量、切割速度，到拍照、保存、收集等都是 通过简便易用的UVCUT软件来完成，
所以操作简单易掌握；但镜检细胞不方便，因为该切割 系统是通过移动鼠标来控制载物台上下左右移动，移动 鼠标远不如普通显微镜的旋转螺钮控制载
物台移动方便。因此，为节省时间必须先在普通显微镜 下把镜检到的理想细胞做好标记，以便切割时查找。单 条染色体分离和扩使得部分遗传研究从全
一种演示非闭合导体中传导感应电流的实验，加深对感 应电流的理解。
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超声波焊接机 ty72htvv
二极管的发光程度来判断感应电流的强弱。通过这个实 验，学生可以直观地观察到感应电流的形成和传输放大 的过程，以及天线不同的放置状态对感应