基因打靶技术
传统ES打靶基因敲除敲入小鼠技能
传统ES打靶基因敲除敲入小鼠技能传统ES 打靶基因敲除/敲入小鼠技术技术原理传统的基因打靶技术制备基因敲除（KO ）/敲入（KI ）基因打靶技术是建立在DNA同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术。
同源重组是指当外源DNA 片段与宿主基因组片段同源性高时，同源DNA 区部分可与宿主DNA 的相应片段发生交换（即同源重组）。
基因打靶就是通过同源重组技术将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。
基因打靶技术目前已被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法。
尤其是条件性和诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠，该技术的发展已经为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究和治疗手段，并已显示出巨大的应用前景及商业价值。
服务流程和周期、管路敷设技术通过管线不仅可以解决吊顶层配置不规范高中资料试卷问题，而且可保障各类管路习题到位。
在管路敷设过程中，要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标高等，要求技术交底。
管线敷设技术中包含线槽、管架等多项方式，为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题，合理利用管线敷设技术。
线缆敷设原则：在分线盒处，当不同电压回路交叉时，应采用金属隔板进行隔开处理；同一线槽内，强电回路须同时切断习题电源，线缆敷设完毕，要进行检查和检测处理。
、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系，根据生产工艺高中资料试卷要求，对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验；对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作；对于继电保护进行整核对定值，审核与校对图纸，编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案，编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案；对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。
基因打靶名词解释
基因打靶名词解释
基因打靶技术 (Gene Targeting) 是一种分子生物学技术，建立在基因同源重组技术和胚胎干细胞技术的基础上。
它通过将目的基因和与细胞内靶基因同源的 DNA 片段重组到载体 (或质粒) 上，构建打靶载体 (基因表达载体),然后利用限制酶将打靶载体线性化，以提高重组率。
通过显微注射技术将打靶载体导入胚胎干细胞，这样打靶载体和与细胞内靶基因同源的区段就有机会发生同源重组。
为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入新霉素和丙氧鸟苷。
最后，通过 DNA 分子杂交技术鉴定同源重组的细胞，获得大量打靶成功的细胞。
这些细胞可以注射入小鼠囊胚，移植到同种、生理状态相同的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行妊娠检查，确保其生下嵌合体小鼠。
这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被修饰过的基因和未被修饰的基因。
如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被修饰过了，则它们的杂交后代中，就可能出现基因完全被修饰过的小鼠。
基因打靶技术及其应用前景
基因打靶技术及其应用前景摘要：基因打靶是近年来发展起来的对细胞基因组中的某一基因进行定点操作的生物技术。
综述了基因打靶的筛选系统，影响基因打靶效率的几个主要因素及其解决方法，总结了基因打靶在各个学科领域中的应用。
基因打靶是指外源DNA与受体细胞染色体 DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，改变细胞遗传特性的方法。
它产生于70年代末和80年代初，最初应用于酵母细胞，80年代中期应用于培养的哺乳动物细胞。
此后，科学家将此技术与胚胎干细胞操作技术相结合，使其得到迅猛的发展，并在生物学、医学和畜牧学等学科领域的研究和应用中展现出广阔的前景。
基因打靶的原理和技术路线虽不复杂，但是，由于高等真核生物细胞内外源DNA与靶细胞DNA 序列发生同源重组的机率非常低，所以要把发生定点整合的细胞从大量随机整合的细胞中筛选出来将是一种非常困难的工作，所以，筛选和富集中靶细胞就成为基因打靶技术中的关键一环。
基因打靶筛选系统选择标记基因定点突变的筛选以犹它大学Capecchi教授的实验为例，介绍选择标记基因定点突变的筛选方法。
首先，在HPrt 序列的第8外显子处插入一个新霉素抗性基因（neo r）作为选择标记，然后用电击转移法将打靶载体导人ES细胞中，通过G418和6-TG（6- thioguanine，6-巯基鸟嘌呤）两种药物的双筛选，得到了既抗G418又抗6-TG的细胞克隆。
从理论上推测，这些细胞克隆都应是对靶细胞Hprt基因进行了定点突变的克隆，因为如果外源基因没整合入靶细胞基因组，靶细胞（Neo--/Hprt+）在G418和6- TG的任何一种选择培养基中都将全部死亡；如果打靶载体只是随机整合入靶细胞基因组，则该 Neo+/Hprt+细胞在6-TG选择液中将全部死亡。
所以，只有通过同源重组，使Hprt位点发生了定点突变的克隆（Neo+/Hprt-）才能在两种选择培养基都存在的情况下存活。
正向选择法（positive lection）正向选择法只适用于在靶细胞中能正常表达的基因。
基因打靶
基因打靶基因打靶研究背景显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的。
可能导致下面几种情况出现：1导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺失；2导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性；3外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因；4导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。
解决办法：将外源基因导入预先确定的位点。
即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶。
什么是基因打靶基因打靶(gene targeting)技术也称为基因定点同源重组，是利用基因转移方法, 将外源DNA序列导入靶细胞后, 通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上的同源DNA序列间的重组, 将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点, 或对某一预先确定的靶位点进行定点突变, 从而改变细胞遗传特性的方法。
它是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
尤其是条件性、可诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确。
基因打靶原理生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。
同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。
ES细胞是一类具有在体外培养件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。
首先获得ES 细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES 细胞。
通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES 细胞引入受体胚胎内。
经过遗传修饰的ES 细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。
基因打靶技术
4.基因打靶的策略
• 大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping)
可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，neo基因插入到 ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的 ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来。
中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组 序列分析来获得。
基因打靶技术
叶亚新
基因打靶研究背景
基因转移技术
显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等 导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的
可能导致下面几种情况出现： ①导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺失； ②导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性； ③外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因； ④导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。
因此，如用G418筛选，则抗性细胞中将只包含后两种可能情况，根据这两种情况下基因组 DNA酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交即可检测出同源重组的克隆。
4.基因打靶的策略
• 完全基因剔除(complete knotk-out)的策略 • 大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping) • 精细突变的引入
（2）正相选择法（positive selection method）
主要程序：将标记基因neor的启动子和起始密码剪切掉，再嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列 内 ①打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失； ②外源打靶序列随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始密码，整合位点周围亦无启 动子，使neor基因的表达受阻； ③虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子能启动neor基因的表达； ④外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶基因自然存在的启动子和起始密码 的作用而呈现表达活性。
基因打靶技术.
四、外源DNA导人的方式
•
外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔 法、精子载体法和逆转录病毒法等。目前应用最 广的是显微注射法。Capecchi报道，用显微注射 法导入可得到很高的转染效率，占接受外源DNA 细胞的10％~20％，但显微注射每次只能注射一个 细胞，而电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。 Mansour等研究发现电穿孔可使1％的ES细胞稳定 转染。逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细 胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶， 在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。
常用的选择标记基因
•
•
正选择标记基因有新霉素磷酸转移酶 （neo）、潮霉素B磷酸转移酶（hph）、黄 嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶（gpt）、次黄嘌呤 磷酸转移酶（Hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk） 及嘌呤霉素乙酰转移酶（puro）。 负选择标记基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶 激酶（HSV-tk）、SacB、 rpsl（strA）、 tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、 ccdB 等。
•
胚胎干细胞注入体内与完整胚胎形成嵌合 体后，可以发育形成包括生殖细胞在内的 一系列成体组织；正是由于胚胎干细胞的 特殊功能，ES细胞基因打靶技术已被广泛 地应用于建立转基因动物之中。从80年代 到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已 发展到成熟阶段。
•
1984年， Bradly等成功地用显微注射法将 ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠， 获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获 得了源于ES细胞系的纯系小鼠。此实验首 次证实体外培养的ES细胞能在体内分化发 育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子 代。1987年，人们利用ES细胞技术建立了 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除 (Gene knockout)的动物模型。此后，这项技 术得到了普遍应用和长足发展。
基因打靶技术ppt课件
•
早在20世纪初，Morgan等人通过对果蝇眼 色遗传的分析揭示了同源染色体之间的 DNA重组是产生交换的基础。1985年在哺 乳动物细胞中实现了同源重组。基因打靶 通常是指用含已知序列的DNA片段与受体 细胞基因组中序列相同或相近的基因发生 同源重组，整合至受体细胞基因组中并得 以表达的一种外源DNA导入技术。
三、打靶载体的构建
•
基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和 突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中 同源序列是同源重组效率的关键因素。基因打靶 载体有基因插入型载体(Gene-insertion vector)和基 因置换型载体(Gene—replacement vector)。插入型 载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位 点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复， 从而干扰了目标基因的功能。置换型载体进行线 性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线 性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体 序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换型载 体进行基因打靶。
•
ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持 未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞 类型的细胞。自从1981年美国的Gail和英国 的Evans等 分别成功地从发育中的小鼠囊胚 的内细胞团（inner cell mass）分离出胚胎 干细胞, 随后, 又从原始生殖细胞——一种 最终分化为精或卵细胞的早期胚胎细胞中 得到具有胚胎干细胞相似特性的细胞群， 称为胚胎种系(embryonic germ，EG)细胞。
•
基 因 打 靶 流 程 图
一、基因打靶研究的背景
•
目前的基因转移技术，如显微注射、电 穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感 染等方法，已能有效地将外源基因导入 靶细胞内。但这些导入的外源基因在靶 细胞基因组中整合的位点一般是随机的， 可能导致下面几种情况出现：
基因打靶实验报告
一、实验背景基因打靶技术是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内研究基因及基因组的功能。
近年来，基因打靶技术在生物学和医学研究领域取得了显著成果。
本实验旨在通过基因打靶技术，研究特定基因在细胞增殖、凋亡和信号传导等方面的功能。
二、实验目的1. 利用基因打靶技术构建基因敲除细胞系。
2. 研究敲除特定基因后，细胞在增殖、凋亡和信号传导等方面的变化。
3. 分析敲除特定基因后，细胞生物学特性的变化。
三、实验材料1. 细胞：人乳腺癌细胞系MCF-7。
2. 基因打靶载体：pT7-TET-OFF载体。
3. 试剂：质粒提取试剂盒、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR试剂、转染试剂等。
四、实验方法1. 构建基因打靶载体：将目的基因插入pT7-TET-OFF载体中，并使用限制性内切酶进行酶切，连接成重组质粒。
2. 细胞转染：将重组质粒转染MCF-7细胞，采用脂质体介导的转染方法。
3. 基因敲除细胞筛选：通过G418筛选阳性克隆，并进行PCR检测。
4. 细胞增殖实验：采用CCK-8法检测细胞增殖情况。
5. 细胞凋亡实验：采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。
6. 信号传导实验：采用Western blot法检测信号传导相关蛋白的表达。
五、实验结果1. 成功构建基因敲除细胞系：通过PCR检测，确认目的基因在细胞中成功敲除。
2. 基因敲除细胞增殖能力下降：CCK-8实验结果显示，基因敲除细胞增殖能力明显低于野生型细胞。
3. 基因敲除细胞凋亡率升高：Annexin V-FITC/PI双染法检测结果显示，基因敲除细胞凋亡率显著高于野生型细胞。
4. 信号传导实验结果显示，基因敲除细胞中信号传导相关蛋白表达降低。
六、实验讨论1. 本实验成功构建了基因敲除细胞系，为研究特定基因的功能提供了实验基础。
2. 基因敲除细胞增殖能力下降、凋亡率升高，提示该基因可能参与细胞增殖和凋亡调控。
基因转移技术和基因打靶技术
第一节 概 述
转基因动物(transgenic animal)是指用重组DNA技术将外源基因导入 基因组内，使之能在动物体内表达并稳定传代的一类动物。 整合到动物染色体基因组上的外源基因称转基因。 只有部分组织细胞整合有外源基因的动物称嵌合体动物。
基因剔除动物是指运用基因剔除技术将特定
另外将包装蛋白基因导入专门的细胞并使之整合到染色体上，形成包装细胞。 如果重组病毒DNA导入这种包装细胞中，病毒包装蛋白能将DNA包装成具有感染力的重组
蛋白颗粒，能浸染动物细胞而将重组DNA引入宿主细胞。
步骤：
1.反转录病毒载体的构建 2.选择和培养包装细胞系 3.重组病毒DNA导入包装细 胞 4.收集重组病毒颗粒 5.感染胚细胞，使细胞转化
磷酸钙沉淀法：
目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA 微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受 体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。
（八）脂质体载体法
•
应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构——脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细
胞，使其表达。
DNA
细胞融合 转化细胞
原理：
○ 将外源目的基因导入能传代培养的动物体细胞，从 阳性转基因细胞中分离细胞核，通过显微注射或电 穿孔将这种导入细胞核去核的成熟卵母细胞中。将 重组胚移植到代孕受体，进而获得带有外源目的基 因的转基因动物。
（六）受体介导法
是将外源DNA与受体分子连接后 与胚胎细胞共培养，受体可以介 导外源DNA进入受体细胞，从而 实现基因转移。 1999年，Ivanava用受体介导法 制作了转基因鼠。
（二）转基因载 体的构建
载体通常由结构基因及其调控序列组成。 常常在载体中附加半乳糖苷酶或绿色荧 光蛋白等报告基因。
第一章：基因打靶概述
在科学界，转基因动物被定义为“由于外源DNA导入动物基因组而产 生了可遗传的改变，这样的动物叫转基因动物”（陈永福，《转基因动 物》）。科学界对转基因动物的狭义定义主要指外源DNA被整合到生殖系 中（即可遗传），而不包括非生殖系整合的体组织基因导入。 具体含义： －转基因动物体内含有导入的外源DNA片段 －外源DNA必须整合到动物的基因组中 －动物的所有细胞基因组中都应含有导入的DNA －外源DNA可通过猪、鱼基因工程育种 “ 863”七五、八五计划, 转羊MT/猪GH基因:
转大马哈鱼和草鱼GH基因： 2. 乳腺生物反应器 “863”九五、十五计划重大专项,
3. 异种器官移植 “ 863”九五计划, 转hDAF基因：
猪(1989), 兔(1990) ， 绵羊(1991), 鱼(1986) （1995-2005）
二，什么是转基因动物（transgenic animal)
美国FDA：A transgenic animal is defined as an animal which is altered by the introduction of recombinant DNA through human intervention. This includes two classes of animals; those with heritable germline DNA alterations, and those with somatic nonheritable alterations. （转基因动物就是一种GE animal！）
第一章
基因打靶概述
第一节 基因打靶的概念
一，什么是基因修饰（或遗传修饰）（ Genetic Modification，GM)
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1
意 义：
基因打靶技术作为最有效的定向修饰小鼠基 因的技术手段在揭示基因的生理功能、研究 人类疾病的遗传机制以及寻找新的药物靶标 的过程中发挥着重要的作用。
定
义
理论基础 操Байду номын сангаас流程 应 用
基因打靶技术和RNAi
2
基因打靶技术是一种定向改变细胞或者生物个 体遗传信息的实验手段，是利用基因转移方法， 将外源DNA序列导入靶细胞后，通过同源重组， 将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定 的位点，从而改变细胞遗传特性的方法。
2008年中科院： 比较基因打靶技术与RNAi这2种方法的异同点 2008年南大： 若有一哺乳动物新基因的开放阅读框序列已测出，但对其功能 一无所知。请设计3种以上研究途径和方法，研究此基因有何 功能。
何为RNA干扰？说明其基本原理及它与反义RNA技术的主要差别
8
ES 细胞技术与同源重组技术的结合使得在生物整体水平上定向 改变和修饰哺乳类动物的遗传物质成为可能。
定
义
理论基础 操作流程 应 用
基因打靶技术和RNAi
4
打靶载体的构建
同源重组指导序列、外源DNA序列
转化受体细胞
显微注射、电穿孔DNA - 磷酸钙共沉淀、脂质体包装和PEG介导
筛选
正筛选标记：同源序列内；负筛选标记：同源序列外侧
定
义
理论基础 操作流程 应 用
基因打靶技术和RNAi
3
基因打靶技术是在胚胎干细胞(ES)技术和同源重 组技术成就的基础之上产生和发展的。
Joshua Lederberg 由于50 多年前在细菌中首先证实同源基 因间重组的原理而获得了1958 年的诺贝尔奖。 Capecchi 和Smithies都首先预见并证实到新的遗传物质可 以通过同源重组引入哺乳动物细胞的基因组, 从而对基因进行特 异性修饰和改造。 Evans贡献了制造小鼠生殖细胞系的工具——胚胎干细胞 。
6
定
义
理论基础 操作流程 应 用
基因打靶技术和RNAi
基因打靶技术
在DNA水平抑制 基因敲入（knockin） 效率低、周期长 定位性强、可稳定遗传
RNAi
转录与转录后水平抑制 效率高、周期短
7
若有一哺乳动物新基因的开放阅读框序列已测出，但对 其功能一无所知，请设计三种以上研究途径和方法，研 究此基因有何功能。
鉴定
PCR、 Southern杂交
基因打靶策略
5
定
义
理论基础 操作流程 应 用
基因打靶技术和RNAi
目前的应用现状
1、基因打靶技术与小鼠胚胎干细胞技术结合,产生了 近千种转基因小鼠品系,每个品系都包含着精确的基因 修饰,包括基因敲除、基因敲进和精巧的突变。通过对 这些突变小鼠的表型分析, 可以阐明许多与人类疾病相 关的基因的功能。 2、基因打靶技术在微生物领域有广泛的应用。 3、基因打靶在植物上的应用研究才刚起步。