离子交换层析
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离子交换层析的原理
离子交换层析的原理
离子交换层析是一种分离和富集离子的技术，基于离子的交换作用在固体和液相之间。
其原理主要基于离子的电荷和大小的差异，通过固体材料与溶液中的离子之间的相互作用，实现离子的分离和分析。
在离子交换层析过程中，采用具有离子交换基团的固体材料作为吸附剂。
这些固体材料通常是树脂或凝胶，具有高度交联的结构，能够提供大量的交换位点。
这些交换基团可以选择性地吸附相应离子，并释放其他离子。
离子交换层析的过程可以分为两个步骤：吸附和洗脱。
在吸附步骤中，固体材料中的交换基团与溶液中的目标离子发生相互作用，使目标离子被固定在固体表面上。
这种相互作用可以是电静力吸引力、静电作用力或配位作用等。
在洗脱步骤中，采用适当的洗脱剂，通过改变溶液条件，如pH值、离子浓度等，来解离吸附在固体表面上的离子，并将其溶解出来。
这样就实现了对离子的分离和富集。
离子交换层析的选择性主要取决于固体材料表面上的交换基团和目标离子之间的相互作用力。
不同的交换基团对离子的选择性也不同，可以选择适合分离目标离子的交换基团。
除了选择性外，离子交换层析的分离效果还与溶液条件、交换剂用量、洗脱剂的选择等因素有关。
因此，在进行离子交换层析实验时，需要根据具体情况进行优化条件，以达到较好的分
离效果。
总的来说，离子交换层析是一种常用的离子分离和富集技术，通过固体材料与溶液中离子之间的交换作用，实现离子的分离和富集。
其原理基于离子之间的相互作用力以及交换基团的选择性，通过调控条件和洗脱剂，达到对离子的有效分离。
离子交换层析
为准，其中pH值最重要
样品进柱
离子交换层析的基本操作
为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高
交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数
样品洗脱
恒定洗脱
离子交换层析的基本操作
分子浓度 离子强度
pH值
阶段洗脱
梯度洗脱
弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换树脂：
最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯 乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物
离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大， 因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化
离子交换层析
离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换介质的选择原则 离子交换层析的基本操作
离子交换层析的基本原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为 流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混 合物中不同离子进行分离的层析技术。
离子交换介质的基本性质
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换葡聚糖：
离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三 维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G） Sephadex的优点如下：
亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核 酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小
10 20 30 40 50 60 70 80 90
样品进柱
离子交换层析的基本操作
为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高
交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数
样品洗脱
恒定洗脱
离子交换层析的基本操作
分子浓度 离子强度
pH值
阶段洗脱
梯度洗脱
弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换树脂：
最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯 乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物
离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大， 因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化
离子交换层析
离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换介质的选择原则 离子交换层析的基本操作
离子交换层析的基本原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为 流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混 合物中不同离子进行分离的层析技术。
离子交换介质的基本性质
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换葡聚糖：
离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三 维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G） Sephadex的优点如下：
亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核 酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小
10 20 30 40 50 60 70 80 90
生化技术第六章 离子交换层析
常用的有以下： （1）纤维素（或交联纤维素）离子交换剂——纤维素或 交联纤维素为基质。类型见表5-4。 羧甲基纤维素（CM-C），为弱酸性阳离子交换剂，常用 于分离碱性和中性蛋白； 二乙基氨基乙基纤维素（DEAE–C或DEAE-Sephacel） 为弱碱性阴离子交换剂，广泛用于分离中性、酸性蛋白质。
3.不同离子型交换剂的选择 原则：选择结合力较小的反离子，有利于提高交 换容量。 强阳性——选H型；强阴性——选OH型； 弱酸性——选Na型；弱碱性——选Cl型。 4.不同基质离子交换剂的选择 疏水性的树脂交联度大，空隙小，大分子很难进 入，且骨架的疏水性不利于蛋白质的稳定。分离 大分子物质时一般用亲水性的基质。
疏水性离子交换剂
疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、与水结合
力较小的树脂。常用的树脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的
聚合物，其中二乙烯苯是交联剂，能把聚乙烯苯直链化合
物连接成类似海绵状的结构，在此结构中以共价键引入不
同的电荷基团。离子交换树脂以电荷基团的性质分则有：
阳离子交换树脂、阴离子交换树脂(分别包括强、中、弱
三、分离原理 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主
要以离子交换方式进行。
假设以R-A+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+
能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式
为：R-A++B+
R-B++A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力， 这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。
+
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3.不同离子型交换剂的选择 原则：选择结合力较小的反离子，有利于提高交 换容量。 强阳性——选H型；强阴性——选OH型； 弱酸性——选Na型；弱碱性——选Cl型。 4.不同基质离子交换剂的选择 疏水性的树脂交联度大，空隙小，大分子很难进 入，且骨架的疏水性不利于蛋白质的稳定。分离 大分子物质时一般用亲水性的基质。
疏水性离子交换剂
疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、与水结合
力较小的树脂。常用的树脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的
聚合物，其中二乙烯苯是交联剂，能把聚乙烯苯直链化合
物连接成类似海绵状的结构，在此结构中以共价键引入不
同的电荷基团。离子交换树脂以电荷基团的性质分则有：
阳离子交换树脂、阴离子交换树脂(分别包括强、中、弱
三、分离原理 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主
要以离子交换方式进行。
假设以R-A+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+
能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式
为：R-A++B+
R-B++A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力， 这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。
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生物分离工程-离子交换层析(色谱)-精选文档
羟基磷灰石层析
羟基磷灰石（hydroxyapatite, HAP): 是一种磷酸钙晶体，基本分子结构为
Ca ( PO ) ( OH ) 10 4 6 2
一般认为，HAP的吸附主要基于钙高子和磷酸根离子 的静电引力，即在HAP晶体表面存在两种不同的吸附晶面， 各存在吸附点c点和P点，前者起阴离于交换作用，后者 起阳离于交换作用．因此，在中性pH环境下酸性蛋白质 (pI<7)主要吸附于c点，碱性蛋白质(PI>7)主要吸附于P 点．利用磷酸盐缓冲液(K2HP04+KH2PO4）为流动相洗脱展 开时，磷酸根离子在c点竞争性吸附，交换出酸性蛋白质 ，而K+在P点竞争性吸附，交换出碱性蛋白质。所以HAP层 析通常以磷酸盐缓冲液为流动相，采用提高盐浓度的线 性梯度洗脱法。
多缓冲离子交换剂:
可利用普通的凝胶过滤介质偶联特殊的离子交换基制 备．如Pharmacia公司生产的PBEll8和94即为以Sepharose 6B 为载体的阴离子交换剂，前者与Pharmalyte 匹配使用，后 者与Polybuffer96和Polybuffer 74匹配使用。
Pharmacia生产的另一种多缓冲离子交换剂为Mono P，其离于交换基为具有不同pKa值的弱碱性胺基．Mono P可与上述三种多缓冲剂匹配使用，粒径仅10m，用作 高效层析聚焦柱的固定相。
poros层析介质包括离子交换疏水作用亲和吸附和反相介质等其中前三种介质的孔表面覆面有葡聚糖等亲水性多糖保证介质表面的亲水性和键合相应的配灌注层析的最大特点是分离速度快一般可在数分钟内完成而利用hplc则需数十分钟到一小时
离子交换层析（色谱）
一、原理
离子交换层析(Ion exchange chromatography, IEC)是 利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂 之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的层析法。 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式表示：
离子交换层析讲解
三、离子交换剂的种类和性质 1.离子交换剂的基质
• 其中：聚苯乙烯离子交换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以
苯乙烯和二乙烯苯合成的具大、流速快。但它与 水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变 性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、 核苷酸等。 以纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚 糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）为基质的离子交 换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子 物质，葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G－25和G－50 为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL－6B为基 质。关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。
离子交换层析
原理及应用
一、简介
• 1、定义：
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换 剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交 换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力 大小的差别而进行分离的一种层析方法
2、发展历程
• 1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交
二、基本原理 阴离子交换
• 通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子
强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加， 洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上 的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置 换出来，随洗脱液流出。 与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来， 而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度 才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与 离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下 来，从而达到分离目的。
X+ Y-↔ A-
二、基本原理
• 从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交 •
离子交换层析的原理和应用
离子交换层析的原理和应用1. 原理概述离子交换层析是一种常用的分离和纯化技术，基于离子交换剂与目标物质之间的相互作用。
其原理是利用交换剂固定在固定相上的活性基团与待分离物质之间的化学吸附和解析度差异来实现目标物质的纯化和富集。
2. 交换剂的选择在离子交换层析中，选择合适的交换剂对分离效果至关重要。
- 强酸型离子交换剂：适用于分离酸性物质。
- 强碱型离子交换剂：适用于分离碱性物质。
- 强酸型离子交换剂与强碱型离子交换剂的混合：适用于分离中性物质。
3. 实验步骤离子交换层析的实验步骤如下： 1. 样品预处理：将待分离物质从样品中提取出来并纯化。
2. 选择合适的离子交换剂：根据目标物质的特性选择合适的离子交换剂。
3. 准备固定相：将离子交换剂固定在合适的固定相上。
4. 填充层析柱：将固定相装填到层析柱中。
5. 样品加载：将样品溶液加载到层析柱上，目标物质与离子交换剂发生相互作用。
6. 洗脱：通过改变溶液条件，如浓度、pH值等，使目标物质与离子交换剂解离，从而洗脱出来。
4. 应用领域离子交换层析广泛应用于以下领域： - 生物制药：用于分离和纯化蛋白质、抗体、核酸等生物大分子。
- 环境监测：用于分离和富集水样中的有机和无机污染物。
- 食品工业：用于食品添加剂、色素、香料等的分离和纯化。
- 化学分析：用于分析样品中的离子和有机物质。
- 生命科学研究：用于研究生物大分子的性质和相互作用。
5. 优点和局限性离子交换层析具有以下优点： - 分离效果好：可以实现高纯度的目标物质。
-操作简单：实验步骤相对简单，易于操作。
- 高选择性：可以通过调整离子交换剂和溶液条件来实现目标物质的选择性分离。
然而，离子交换层析也存在一些局限性： - 样品负荷量有限：由于固定相的固定容量限制，样品负荷量较小。
- 洗脱效果难以调控：洗脱条件的调控比较复杂，对操作者要求较高。
- 耗时较长：由于样品加载和洗脱等步骤的需要，离子交换层析需要较长的时间。
离子交换层析
C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当 A1=A2时为线性梯度，当A1>A2时为凹形梯度，A1>A2时为凸形梯度。
洗脱时应满足以下要求：
①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不至于太拥挤。
已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离 子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分 次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体 积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6. 两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容 器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一 容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进 行计算：
具体操作
加样与洗脱
预处理和装柱
洗脱
对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品 则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂 常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转 为-H-型交换剂。
离子交换层析
生物大分子提纯方法
01 发展
03 具体操作
式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当 A1=A2时为线性梯度，当A1>A2时为凹形梯度，A1>A2时为凸形梯度。
洗脱时应满足以下要求：
①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不至于太拥挤。
已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离 子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分 次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体 积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6. 两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容 器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一 容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进 行计算：
具体操作
加样与洗脱
预处理和装柱
洗脱
对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品 则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂 常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转 为-H-型交换剂。
离子交换层析
生物大分子提纯方法
01 发展
03 具体操作
离子交换层析法
五、缓冲液的选择
缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定 性、溶解度和交换剂离子的pK值。使用阴离子交换纤维时要选 用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的 pH值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于 pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物 等电点的pH值。 缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解 度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么 pyridine或barbital这类会吸收UV的物质就不适用。
三、树脂的选择
最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene）， 它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯 （divinylbenzene）聚合产生的三维网状结 构，举例来说，Dow化学公司所生产的树脂 Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。 具体的，根据交换树脂的性能，树脂可分 为阳离子与阴离子交换树脂：
1. 阳离子交换树脂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有－R－ SO3H，中强酸型树脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2， 弱酸型树脂含有－COOH或－OH。 阳离子交换树脂进行的反应 如下：
2. 阴离子交换树脂 分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐 [ － N+(CH3)3] 为强碱型树脂，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ － NHCH3]、[ －NH2] 都属弱碱型树脂；同时具有强碱和弱碱型基 团的，为中强碱型的树脂。阴离子交换树脂进行的反应如下：
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可 逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适 宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目 的物的位置，并回收目的物。
离子交换层析法
离
子
+ OH-
交 换 R-N+（CH3）2 OH- + H2O == R-N+（CH3）2
剂
H·OH-
2．亲水性离子交换剂
磷酸纤维素 CM-纤维素 DEAE-纤维素 CM-交联葡聚糖 DEAE-交联葡聚糖 CM-Sepharose CL-6B
二、离子交换剂性质
颜色与形状 交联度 吸水量或膨胀度 交换容量 稳定性 比重
CA 、CB ＝梯度混合器A瓶、 B瓶的浓度； A1 、B1 ＝A瓶、B瓶的横切面积； V2＝流经层析柱的体积，V1＝梯度洗脱液的总体积。
线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清 白蛋白的图谱
第五节 离子交换拄层析应用
一、去离子水的制备 二、制备、纯化生命物质 二、测定蛋白质的等电点
一价离子：Li+＜Na+＜K+＜Rb+＜Cs+ 二价离子：Mg2+＜Ca2+＜Sr2+＜Ba2+ 一价阴离子：F-＜Cl-＜Br-＜I不同价阳离子：Na+＜Ca2+＜Al3+＜Ti4+
磺酸基树脂和季胺基树脂 对各种离子的相对选择系数
阳离子树脂
反离子 相对选择系数
H+
1.0
Na+
1.5
NH4+
1.95
2、缓冲液离子组成的选择
①缓冲液离子的pK值要接近所用的pH， ②采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，
如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐 ③采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，
如：Tris ④缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、
溶解度。
3、缓冲液离子强度的选择
①起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换 剂结合，一般小于0.1mol/L。
离子交换层析
液。平衡缓冲液的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分 离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子 交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交 换剂的结合有较大的差别。
一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。尽量使
杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在一些情况下可以 使杂质与离子交换剂牢固地结合，而样品与离子交换剂结合 不稳定，也可以达到分离的目的。
离子交换层析的基本操作
（1） 层析柱
离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，
离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和 柱长比一般为1:10到1:50之间，层析柱安装要垂直。装 柱时要均匀平整，不能有气泡。
装柱用于平衡离子交换柱的缓冲
■ 胶体的组成与外型：
Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.24
Cellulose Sephcel Monobead
Pharmacia (1980) Separation News: 5
离子交换剂的选择、处理和保存
Buffer: 0.01 M Tris-HCl, pH 8.0
mg / mL gel
Adapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.64
影响交换容量的因素很多，主要可分为两个方面。
换剂上的样品组份洗脱下来。
柱效
通过柱子分离得到窄而对称的洗脱峰的能力（分辨率）
装柱的质量
树脂颗粒的大小
正确的洗脱条件
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它们带负电荷能与阴离子交换剂结合 。pH与pI的差值越
大，带电量越大，与交换剂的结合力越强。 离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机 离子或生物大分子物质分开，其主要依据是离子交换剂对 各种离子或离子化合物有不同的结合力。
氨基酸的离子交换分离原理
What happens in ion exchange?
离子交换色谱中所进行的离子交换过程（以阳离子交换树脂为例）
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种 结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。强酸性(阳性) 离子交换剂对H+的结合力比对Na+的小；强碱性(阴性)离子交 换剂对OH-的结合力比对Cl-的小得多；弱酸性离子交换剂对H+ 的结合力远比对Na+的大；弱碱性离子交换剂对OH-的结合力比 对Cl-的大。因此，在应用离子交换剂时，采用何种反离子进 行电荷平衡是决定吸附容量的重要因子之一。离子交换剂与 各种水合离子(离子在水溶液中发生水化作用形成的)的结合
此外，还可用于分离某些不易变性的蛋白质。
阳离子交换树脂对氨基酸的分离
疏水性的离子交换剂对带 电荷多和疏水性强的被分 离物有较强的截留能力。
2.亲水性离子交换剂
这类交换剂与水的亲和力较大，载体孔径大，适合于分离 生物大分子，有多种类型：
(1) 纤维素离子交换型
以纤维素为基质，常用的功能基因有磷酸基(P.中强酸型)、 磺酸乙基(SE，强酸型)、羧甲基(CM、弱酸型)、三乙基氨基乙 基(TEAE，强碱型)、二乙氨基乙基(DEAE，弱碱型)、氨基乙基 (AE，中等碱型)、三乙醇基氨基(ECTE，中等碱型)等，可制成 纤维状、微粒、短纤维、球形四种类型，Pharmacia (GE)公司 生产的DEAE-Sephacel为球形颗粒，机械性能和理化稳定性好， 对蛋白质、核酸、激素等均有良好的分辨率、回收率和交换容 量，使用简单方便，在生物化学与分子生物学中使用普遍。此 外，Watman公司的DE-、CM-、P- 、AE-、SE-及QA-纤维素， Bio-Rad公司的CellexD、CellexE、CellexP和CellexCM，及一 些国产的DEAE-纤维素和CM-纤维素也可选择使用。
㈢ 电荷密度
电荷密度是指基质颗粒上单位表面积的取代 基（功能集团）的数量，它决定着离子交 换剂的交换容量、膨胀度等性质。对小分 子进行离子交换时，交换剂上功能基团密 度越大，工作能力越强，高电荷密度的离 子交换剂具有优势。
㈣ 膨胀度 又称吸水值，是指当干态的离子交换剂在 水溶液中吸水后造成体积膨胀的程度，通 常用每克干胶吸水膨胀后的体积（毫升） 来表示。
树脂、阴离子交换树脂(分别包括强、中、弱三种电荷基团)
和螯合离子交换树脂(对金属离子有较强的选择性)。
(1) 阳离子交换剂
阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电。因
此，可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。
根据电荷基团的强弱，又可将阳离子交换剂分为强酸型( 带 磺酸基团)、中强酸型(带磷酸基团或亚磷酸基团)和弱酸型
(2) 葡聚糖系离子交换剂
以SephadexG25和G50为基质，分别引入DEAE、QAE(二乙基 (二羧 丙基)氨基乙基，弱碱型)、CM、SP(磺丙基、强酸型)等 功能基因，构成8种交换剂，交换容量较离子交换纤维素大，除 离子交换作用外，还有分子筛作用，但层析时床体积随洗脱剂 离子强度的增加而缩小，以SephadexG50为基质的交换剂尤其明 显，为使用带来不便。
Elution
-
- -- -- -
- - -- - - - - ++ ++ + + -+ +- + + + - -+ -10
What happens in ion exchange?
Regeneration
- - ----- - -- - - + -+ + -+ - -+ -+ 11
What happens in ion exchange?
(二) 离子交换剂的选择
任何一种离子交换剂都不可能适用于分离所有的样品。因 此，选择理想的离子交换剂是提高有效成分的得率和分辨率的 一个重要环节。 1.阴、阳离子交换剂的选择 如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如果被 分离物质带负电荷，则应选择阴离子交换剂；如果被分离物质 为两性离子，要按照其稳定状态的净电荷来选择交换剂。假设 一蛋白质的等电点为5，若该物质在pH5-8稳定时，应选择阴离 子交换剂； 若该物质在pH5以下稳定时，则可选择阳离子交换 剂。 2.强、弱离子交换剂的选择 一般来说，强离子交换剂适用的pH范围很广。所以常用它 来制备无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物 质。而弱性离子交换剂适用的pH范围较窄，在pH为中性的溶液 中交换容量也高，用于分离生物大分子物质时，其活性不易丧 失。所以，分离生物样品多采用弱离子交换剂。
力与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。
所以，离子价数越高，结合力越大。在离子间电荷相同时， 则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力亦越大。
两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离 子交换剂的结合力，主要取决于它们的物理化学性质和在 特定pH条件下呈现的离子状态。当pH低于等电点(pI)时， 它们带正电荷能与阳离子交换剂结合；反之，pH高于pI时，
(3) 琼脂糖系列离子交换剂：
以琼脂糖为基质，主要有Pharmacia (GE)公司的Sepharose和Bio-Rad
公司的Bio-gel两个系列。 ① Sepharose系列离子交换剂：早期产品为DEAE-Sepharose CL-6B和 CM-Sepharose CL-6B ，对生物大分子分辨力好，交换容量大，床体积随洗 脱液的离子强度和pH的改变小，使用较 Sephadex系列方便。后续产品 Sepharose Fast Flow(Sepharose FF)理化稳定性和机械性能更好。交换容 量大，可以在床清洗，床体积随pH的离子强度变化很小，由于流速和载量 高，适合于进行大量粗产品的纯化工作。引入的功能机团有Q(强碱性)、SP、 DEAE、CM四种。此外，Sepharose High Performnce (Sepharose HP)有QSepharose HP和SP-Sepharose HP两种，颗粒细、分辨率高，理化稳定性好， 流速和载量均适合于实验室或大量制备使用。 ② Bio-GelA系离子交换剂：有DEAE-Bio-GelA和CM-Bio-GelA两种， 回收率极高，床体积随pH和离子强度变化小，pH和化学稳定性好。
氨基酸的分离过程
二、离子交换剂的部分性质 ㈠ 粒度 基质颗粒大小直接关系到分离效果，颗粒越小，层 析柱的理论塔板数就越大，分离效果越好，但同时 交换容量变小，层析时背景压力增大，限制了流速 的提高，因此细颗粒的介质常适用于分析型分离； 相反，基质颗粒越大，柱效率会下降，但离子交换 剂的交换容量提高，背景压力减小，因此大颗粒介 质适合于实验室小规模分离及大规模工业化分离。
有效交换容量指每克干介质或每毫升湿胶在一定 的实验条件下吸附某种分子的实际容量。由于 有效容量是一个变值，在说明其数值时应当同 时指出实验条件. 一般情况下，同一种交换剂对于分子量小的蛋白 质有效交换容量较大，而对于分子量大的蛋白 质有效容量较小；对于同一种蛋白质，离子交 换剂的交联度越小有效容量越大，而交联度越 大有效容量越小。
㈡ 交联度和网结构
交联度的大小影响着离子交换剂的很多特 性，包括机械强度、膨胀度、网孔大小、 交换容量等。 一般交联度越高，网孔的孔径越小；交联 度越低，网孔孔径越大。仅琼脂糖交换 剂是例外.
㈡ 交联度和网孔结构
分离介质的孔有3种结构。第一种通过交联使 大分子链间形成孔，这叫凝胶孔。 第二种在有溶剂存在条件下进行聚合，称为大 孔树脂。 第三种为琼脂糖介质的孔，孔径大小仅与琼脂 糖浓度有关，交联对孔结构影响不大。
Equilibration Sample application and wash Elution Regeneration
- anion exchanger bead
- - ++ + - ++ -+ -
++ +++ -+ -
-
- -- -- -
-
- - - ----- -- - -- - - - - - -+ - ++ ++ + + -+ + -+-+ +- + +- - - +- + - -+ -+
(4) Source系列离子交换剂
有Q(强碱型的)和S(强酸型)两种，是低压层析系统中分 辨率最高，流速最快的离子交换剂，理化稳定性极好，可用 1mol/L HCl和1mol/L NaOH在床清洗，使用寿命长 ，样品回 收率高，重复性好，工艺放大容易。
(5) Mono Beads系列离子交换剂
是Pharmacia (GE)公司推出的新型交换剂，以亲水性聚 醚为基质 ，能快速分离蛋白质，肽和低聚核苷酸，动态载样 量大，可分离从mg到g的单克隆抗体。
(带羧基的或酚基)三种。
(2) 阴离子交换剂
阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺〔-N(CH3)3〕、 叔胺〔-N(CH3)2〕、仲胺〔 -NHCH3〕和伯胺〔-NH2〕基团构 成的。当引入季胺和叔胺基团时，分别为强阴性和中强阴性
离子交换剂。当引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换
剂。
树脂型离子交换剂一般都呈网络结构的珠状体，其大小
㈤ 交换容量 交换容量是指离子交换剂能够结合溶液中可交换离 子的能力，通常分为总交换容量和有效交换容量。 总交换容量用每克干介质或每毫升湿胶包含的带电 功能基团的数量来表示.可以通过酸碱滴定的方法 来测定，也可使得离子交换剂和某种小的离子之 间发生完全交换，然后通过测定该离子的含量算 出总交换容量，总交换容量并不反映交换剂对可 交换分子的结合情况.