免疫组化ICH
病理报告免疫组化

病理报告免疫组化引言病理报告是医疗领域中一份非常重要的文档,它对于疾病的确诊和治疗方案的制定起着至关重要的作用。
另外,免疫组化在病理学中也有着重要的地位,它通过检测组织和细胞中的特定蛋白质的表达情况,帮助医生进一步了解病变的类型和性质。
本文将对病理报告免疫组化进行介绍和解读。
免疫组化的定义免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)是一种常规病理学技术,它利用特异性抗体与病理组织中的抗原发生特异性反应,通过光学显微镜观察和分析,从而确定该病理组织中特定蛋白质的表达情况。
免疫组化广泛应用于临床病理诊断中,可以帮助诊断肿瘤、炎症和自身免疫等疾病,对于临床诊断和预后评估有重要意义。
免疫组化的步骤及原理免疫组化的主要步骤包括取材、固定、包埋和切片等传统病理学处理步骤,以及抗体处理、染色和显微镜观察等免疫组化特有的步骤。
本节将介绍免疫组化的主要步骤及其原理。
抗原修复抗原修复也称为“脱脂获得(unmasking)”步骤,其目的是使因固定而产生的蛋白质交联、脱水和去脂化的病理组织再次恢复其原有的形态和表达情况,以方便抗体对抗原的特异性结合。
一般常用的抗原修复方法包括热诱导抗原修复、酶诱导抗原修复和化学诱导抗原修复等。
抗体处理抗体处理是免疫组化中最重要的一步,其目的是将特异性抗体加入到病理组织切片中,与目标抗原特异性结合。
抗体处理通常分为一抗处理和二抗处理两个步骤。
一抗处理是指将特异性一抗与病理组织切片进行孵育反应,以实现一抗与目标抗原结合;二抗处理是指将与一抗来源介源的二抗标记物(一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等)与处于抗原抗体复合物上的抗原结合,从而实现一抗与二抗间二次反应的串联。
染色与显微镜观察在经过一抗处理和二抗处理之后,需要进行染色以可视化抗原-抗体复合物,进而观察和分析蛋白质的表达情况。
常用的染色方法包括免疫组化酶标法(Immunohistochemistry-Enzyme Labeling Method, IHC-EL)和免疫组化荧光法(Immunohistochemistry-Fluorescence Method, IHC-FL)等。
微卫星稳定免疫组化诊断标准

微卫星稳定免疫组化诊断标准人类错配修复(MMR)基因除了检验和校正复制期间发生在微卫星样重复DNA序列上小的插入和丢失之外,还防止解旋的DNA序列重新结合。
MMR基因突变破坏了MMR蛋白的功能,引起重复DNA序列的产生及DNA修复错误,从而导致患者DNA出现微卫星不稳定(MSI)。
Lynch综合征是一种由错配修复(MMR)基因种系突变引起的常染色体显性遗传病。
MSI检测具有重要临床意义:1、诊断Lynch综合征:MSI是Lynch综合征的重要生物学标记,当MSI-H被证实,该诊断即可成立;2、判断预后及治疗效果:MSI-H的结直肠癌患者对化疗药物5-氟尿嘧啶的疗效不佳;3、鉴别遗传性胚系来源与散发性来源的MSI结直肠癌:散发性MSI-H结直肠癌的病因通常是hMLH1基因启动子甲基化,只有小部分为BRAF基因突变致MMR基因沉默而免疫组化阴性,并出现MSI。
若肿瘤MMR基因启动子甲基化或BRAF基因突变阳性,说明为散发性癌;4、筛查:Bethesda修订指南建议对小于50岁的患者常规进行MSI检测。
根据Bethesda修订指南,有下列指征的患者需做MSI检测:1、患者年龄小于50岁;2、肿瘤位于右半结肠;3、易发生肠内或肠外其他器官的多发性肿瘤;4、术后易再发其他原发性恶性肿瘤;5、肿瘤有淋巴细胞浸润;6、多分泌黏蛋白或有印戒细胞;7、浸润性生长模式。
MSI检测目前有以下两种检测方法:1、PCR技术检测方法对石蜡切片进行人工显微切割提取DNA,以一些微卫星点为标记指导合成引物进行PCR,通过凝胶电泳分析得出MSI谱,进行比较分析。
最常用的2个Promega分析系统由5个单核苷酸标记点(BAT-25、-26,MONO-27,NR-21、-24)构成;而美国国家癌症研究所(NCI)参考系统由3个双核苷酸(D2S123、D5S346和D17S250)和2个单核苷酸(BAT-25和-26)构成。
当胚系谱中微卫星的长度改变,MSI的诊断即可成立。
免疫组化 分子病理学检查

免疫组化分子病理学检查免疫组化(Immunohistochemistry,简称IHC)是一种利用抗体与组织切片中的特定抗原相互作用的技术,用于检测和定位组织中特定蛋白质的存在和表达水平。
免疫组化技术在分子病理学领域有着重要的应用,可以为疾病的诊断和治疗提供有力的依据。
免疫组化技术的原理是利用抗体与组织切片中的目标抗原发生特异性反应,形成抗原-抗体复合物,然后通过染色反应使抗原-抗体复合物显色,以实现对目标抗原的检测和定位。
在免疫组化过程中,首先需要选择与目标抗原特异性结合的一对抗体,其中一种抗体与标记物结合,如酶标记的二抗或荧光标记的二抗,以便使目标抗原的位置可见。
常用的标记物有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)等。
然后,通过特定的染色反应,使标记物显色或发射荧光,从而可视化目标抗原的位置。
免疫组化技术在肿瘤病理学中有着广泛的应用。
通过检测肿瘤细胞中特定蛋白质的表达水平,可以帮助确定肿瘤的类型、分级和预后,指导临床治疗的选择。
例如,通过检测乳腺癌组织中雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的表达情况,可以判断患者是否适合内分泌治疗。
另外,通过检测HER2蛋白的表达水平,可以指导HER2阳性乳腺癌患者是否适合接受靶向治疗。
免疫组化技术还可以检测肿瘤标志物如CEA、CA125、PSA等,用于辅助肿瘤的早期诊断和疾病监测。
除了肿瘤病理学外,免疫组化技术在其他疾病的诊断和研究中也有重要应用。
例如,在感染病的诊断中,可以通过检测病原微生物的抗原在组织中的表达情况,快速准确地确定感染的类型和范围,从而指导临床治疗。
在免疫性疾病的研究中,可以通过检测自身抗体在组织中的沉积情况,了解疾病的发病机制和病情进展。
免疫组化技术的优势在于其高度特异性和灵敏性。
通过选择特异性的抗体,可以准确地检测目标抗原的存在和表达水平。
与传统的组织学染色相比,免疫组化技术可以提供更为细致的信息,如亚细胞定位、蛋白质的活性状态等。
免疫组化的原理及应用

免疫组化的原理及应用原理免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)是一种通过特异性抗体与相应抗原的特异性结合,利用染色反应显示出有关蛋白质在组织或细胞中的位置与数量的技术。
简单来说,免疫组化是通过酶标法或荧光法等方法,利用特异性抗体标记目标蛋白质,从而在组织或细胞中检测和定位目标蛋白质的方法。
免疫组化的原理主要包括以下几个步骤:1.抗原修复:免疫组化一般需要在标本切片前对组织进行抗原修复处理,以恢复和增强抗原的免疫活性。
2.阻断非特异性结合:在免疫组化过程中,为了防止非特异性结合的出现,需要使用非特异性抗体或蛋白质进行阻断。
3.抗体结合:将特异性抗体与标本中的目标抗原进行结合,可采用直接法或间接法。
4.信号显示:对于直接法,特异性抗体上已标记有荧光染料或酶标标记,可直接显示信号;对于间接法,再添加与特异性抗体免疫结合的二抗,二抗上标记有荧光染料或酶标标记,用于显示信号。
5.结果观察与分析:利用显微镜观察标本中信号的形态、分布和强度,进行结果判读和分析。
应用免疫组化在生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域都有广泛的应用。
以下列举一些主要的应用:1.细胞定位:通过使用特异性抗体和荧光染料标记目标蛋白质,可以在细胞水平上观察和定位目标蛋白质的分布和表达情况。
2.组织检测:通过在组织切片上应用免疫组化技术,可以检测和定位特定蛋白质在组织中的表达情况,并用于研究组织的结构和功能。
3.癌症诊断:免疫组化在肿瘤诊断中有重要的应用价值。
通过检测肿瘤标志物的表达情况,可以帮助医生判断肿瘤类型、分级和预后,并指导相应的治疗方案。
4.药物研发:免疫组化可以用于评估新药对蛋白质表达的影响,了解新药的作用机制,以及筛选适合的治疗靶点。
5.神经科学研究:免疫组化在神经科学领域的研究中也有广泛的应用。
通过免疫组化技术,可以观察和定位神经元、神经递质和突触相关蛋白质,帮助研究神经系统的结构和功能。
总的来说,免疫组化技术广泛应用于生命科学研究和临床实践中,为我们研究细胞和组织的结构与功能、研究疾病机制、辅助临床诊断等提供了有力的工具和方法。
免疫组化相关步骤

免疫组化相关步骤免疫组化(immunohistochemistry,IHC)是一种基于抗原抗体反应的方法,用于检测组织或细胞中其中一种特定蛋白质的表达。
下面将详细介绍免疫组化的相关步骤。
免疫组化的步骤包括样品制备、抗原修复、阻断、一抗反应、二抗反应和染色,具体如下:1.样品制备:首先,需要获取组织标本。
通过活体组织切片、细胞涂片或冷冻切片等方法制备标本。
制备好的标本需要保持完整和有代表性,通常要求切片不超过5μm厚。
2.抗原修复:组织切片在固定过程中会损害抗原的完整性,因此需要进行抗原修复,以恢复抗原的表达。
常用的抗原修复方法包括热解修复(如加热、压力煮等)和酶解修复(如胰蛋白酶消化等)。
3.阻断:组织切片会与非特异抗体结合,影响免疫反应的特异性,因此需要进行阻断。
常用的阻断方法包括用牛血清白蛋白(BSA)或奶粉进行阻断,以防止非特异性背景信号的产生。
4.一抗反应:将含有特异性抗体的试剂加到组织切片上,使其与目标抗原结合。
特异性抗体可针对不同的抗原进行选择,如研究一些蛋白质的表达,可以选择该蛋白的特异性抗体。
5.二抗反应:一抗与抗原结合后,需要加入与该一抗来自不同物种的二抗。
二抗通常是免疫出来的,其与一抗结合后,可形成复合物,具有荧光或酶标记。
6.染色:最后,通过染色方法来显示抗原的表达。
染色可以是荧光染色或酶标染色。
荧光染色利用特定颜料对特异性标记的抗体进行荧光标记,并在荧光显微镜下观察。
酶标染色则使用酶标记的二抗,再加入相应的底物进行染色。
除了以上的基本步骤1.控制组:为了验证实验是否准确,通常需要设置阴性和阳性对照组。
阴性对照组通常是替代一抗的种属、浓度和机制抗体;阳性对照组是已知具有目标蛋白表达的组织切片。
2.负载密度和反应时间:一抗的负载密度和反应时间需要优化,以确保对目标蛋白的增强标识,同时最大限度地减少背景信号。
3.显微镜观察和图像分析:观察染色结果时,要选择合适的显微镜,以获得清晰的图像。
免疫组化的基本步骤

免疫组化的基本步骤免疫组化(immunohistochemistry, IHC)是一种常用的实验技术,用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。
它是一种特异且可靠的方法,通过结合抗体与抗原的特异性相互作用,利用显色或荧光信号来检测特定抗原的存在和定位。
以下是免疫组化的基本步骤。
1.组织样本处理:首先,需要准备适当的组织样本。
组织可以是固定的、冰冻的或者石蜡包埋的。
固定的样本通常使用福尔马林进行固定,并应在切片前进行脱水、透明和石蜡浸渍等处理。
2.抗原恢复:组织样本中的一些抗原可能因为固定和处理过程而被破坏或掩埋。
为了恢复抗原的免疫原性,需要进行抗原恢复步骤。
这一步骤的目的是去除或解开横断的蛋白质交联,以使抗体能够更容易进入细胞或组织内部。
抗原恢复可以使用高温、酶解或化学溶解等方法进行。
3.抗体处理:接下来,需要选择适当的一抗(primary antibody)对特定的抗原进行标记。
一抗通常是由动物免疫系统产生的,可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
抗体的选择是非常重要的,需要确定其与特定抗原的特异性和亲和性。
一次性需要把一抗稀释到合适的浓度,并与特定的缓冲液混合。
4.反应:抗体与抗原的结合需要一定的时间来达到最佳的结果。
实验者需要将一抗混合物加到组织样本上,并进行足够的反应时间。
反应时间可以根据实验条件或需求进行调整,通常为30分钟至几小时。
5.洗涤:反应完毕后,需要对样本进行洗涤以去除未结合的一抗、杂质和非特异性结合物。
洗涤步骤通常使用缓冲液,可重复进行多次,以确保清除掉所有不必要的物质。
6.二抗处理:一抗与目标抗原结合后,需要加入相应的二抗(secondary antibody)对一抗进行检测。
二抗可以与一抗特异性结合,并携带染色剂或荧光标记。
常见的二抗有抗小鼠IgG的免疫球蛋白和抗兔IgG的免疫球蛋白。
二抗也需要适当的稀释并与缓冲液混合。
7.反应:类似于一抗反应,二抗也需要一定时间来与一抗结合和形成复合物。
免疫组化实验方案

鼠脑组织ICH实验操作步骤1. 所用试剂及耗材1)一抗:Anti-Tyrosine Hydroxylase, clone LNC1. Millipore. Cat. # MAB318.Lot # NG1899912.2)二抗:Envision TM Detection Kit. Gene Tech (Shanghai) Company Limited.Code No: GK500705/10.3)一抗稀释液:免疫染色一抗稀释液。
碧云天生物技术研究所。
Code No:P0103。
4)PBS:PBS缓冲液(PH 7.2-7.6)。
武汉博士德生物工程有限公司。
Code No:AR00305)枸橼酸盐缓冲液:PH 6.0。
武汉博士德生物工程有限公司。
Code No:AR00246)H2O2:3%(PBS配置)7)病理载玻片、病理盖玻片、免疫组化湿盒、免疫组化笔、切片盒、晾片板。
2. 免疫组化1)二甲苯脱蜡透明:每次10 min,连续2次。
2)梯度乙醇洗脱:100%浓度洗脱5 min,100%、95%、95%浓度洗脱2 min,然后用去离子水冲洗。
3)抗原修复:用去离子水冲洗切片,然后将组织放入枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)中,使用微波炉加热,先高火5 min,然后中低火10 min。
修复后自然冷却到室温。
4)PBS洗片:修复后的切片使用PBS冲洗,每次3 min,连续3次。
5)3% H2O2(PBS配置)封闭:避光孵育10 min,去离子水冲洗。
6)PBS洗片:每次3 min,连续3次。
7)封闭:用滤纸擦干切片组织周围的水,用免疫组化笔画圈。
然后滴加10 %血清(PBS配置)封闭非特异性作用位点,每张载玻片加200 μl到300 μl封闭液,室温孵育1 h。
8)一抗(1:1000)孵育:封闭后的切片,用移液器吸掉封闭液,然后每张切片滴加200 μl的一抗(抗体使用一抗稀释液稀释到所需浓度),湿盒中室温孵育1 h。
免疫组化原理和步骤

免疫组化原理和步骤免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)是一种广泛应用于组织学和细胞学研究中的实验方法,主要用于检测和定位蛋白质在组织或细胞中的分布和表达水平。
它结合了免疫学原理和组织学技术,通过使用特异性的抗体和染色剂来实现对目标蛋白质的检测和可视化。
免疫组化的原理主要是利用抗体的高度特异性与抗原相结合,然后使用染色技术来显示抗原的位置。
该技术的基本原理可分为抗原-抗体反应、信号放大和信号显示三个步骤。
第一步:抗原-抗体反应免疫组化的第一步是选择合适的抗体,通过与目标蛋白质的特异性结合来形成抗原-抗体复合物。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
单克隆抗体具有高度特异性,只能结合到特定的抗原上。
多克隆抗体具有高度敏感性,可以结合多个位点,从而实现信号放大。
通常,为了提高抗原的可检测性,需要对组织样本进行抗原修复处理。
这可以通过热处理(如蒸汽加热、微波加热)或酶切处理来实现。
修复可以解除组织样本中抗原与蛋白质结构之间的交联,增加抗体的渗透性和可结合性。
当抗原-抗体反应发生时,可通过一系列化学反应来形成抗原-抗体复合物。
例如,可以使用二抗来与抗原-抗体复合物结合,然后使用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记的二抗来与二抗结合。
该反应可形成稳定的抗体-酶复合物。
第二步:信号放大由于抗原-抗体复合物的信号很弱,通常需要进行信号放大以便更好地检测到目标蛋白质。
放大信号的方法有很多种,其中最常用的是酶免疫标记联合酶放大技术。
酶免疫标记是通过将抗体与酶结合,使其能够催化特定的化学反应来产生荧光、色素或光学信号。
常用的酶免疫标记包括辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。
这些酶能够催化荧光素、二苯基胺、硝基蓝等底物的氧化还原反应,从而产生可视化的信号。
酶放大技术常用的方法包括:免疫酶化学法(如DAB法)、免疫荧光法和免疫酶学荧光混合法等。
这些方法可通过将底物转化为可见的色素或荧光信号来标记抗原-抗体复合物,从而实现目标蛋白质的检测和定位。
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② 免疫动物或细胞融合(单克隆抗体)
③ 抗体效价检测和抗体纯化
④ 标记抗体
⑤ 细胞和组织切片标本的制备 ⑥ 免疫组织/细胞化学反应和显色 ⑦ 观察和记录结果
抗体(antibody)
多克隆抗体(polyclonal antibody)
纯化的抗原直接免疫动物(大多数为兔) 多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 特异性不如单克隆抗体好,有时会造成一定的交叉反应,但灵敏度高于后 者。 能广泛用于石蜡包埋组织切片。
2.免疫组织化学的相关理论和技术
2.1
免疫组织化学的工作原理
抗体与其抗原特异性结合
通过化学反应使特异性抗体标记上显示剂,如酶,金属 离子、同位素等,显示一定的信号(如:颜色) 借助光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色 或电子密度等变化,从而确定抗原在组织、细胞内的定 位和含量。
2.2 免疫组织化学的全过程包括:
亲和免疫组化
葡萄球菌蛋白A(SPA法):用SPA代替桥抗体 卵白素-生物素过氧化物酶复合物法 (Avidin
ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一
Biotin-peroxidase Complex, ABC) 生物学性质,先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合, 形成生物素化HRP,然后与卵白素按一定比例混合,形成
常用的免疫酶(染色)方法
免疫酶标法
非酶标法:PAP法
PAP法主要染色原理 : 用第二抗体作“桥梁”, 既与第一抗体结合,再与PAP 复合物联接,最后用底物显色 剂显色。
抗原与抗体分子的结合,不受两者数量比例的限制, 但如需要出现肉眼可见的反应,则抗原与抗体的量需保持 一定比例。 在抗原或抗体过量的条件下,不能聚合成大颗粒,因 此不能出现肉眼可见的反应。 (BIG BEE现象)
单克隆抗体(monoclonal antibody)
单克隆抗体是由一个B淋巴细胞克隆分泌的针对一种抗原决定簇的抗体。 大多数为小鼠Ig。其优点为特异性强、抗体产量高。但灵敏度逊于多抗。 单克隆抗体只针对抗原分子的某一个抗原决定簇(这一抗原决定簇可以是 抗原分子上的无关抗原决定簇)。 在免疫组织化学中广泛用于冰冻切片和石蜡切片。
ABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体结合,再与ABC
复合物联结形成抗原—抗体—生物素化二抗—ABC。最后 用底物显色剂显色。
1. 用链霉菌亲和素代替ABC复合物中的卵白素,则为: SABC法:(StreptAvidin Biotin-peroxidase Complex) 2.将链霉亲和素和生物素先连结起来,则称: LSAB法:labelled StreptAvidin-Biotin 3.用链霉亲和素连结辣根过氧化物酶,则为: SP法:(StreptAvidin Peroxidase conjugataed method) 若用碱性磷酸酶标记链霉亲和素则称SAP法。 若分别用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素,则称DS法 特点: ⑴ 敏感性高,(比PAP高8~40倍); ⑵ 背景淡,链霉亲和素更好; ⑶ 方法较简便,时间较短; ⑷ 应用范围广,也可用于原位杂交和免疫电镜。
2.3
免疫组织化学组织细胞处理
切片前的准备工作
(1)载玻片的清洁:
市售载玻片需经清洁液泡24h,流水冲洗,系列乙醇浸泡,
凉干涂胶,如需开展原位杂交,还需将玻片240℃烤2 h。 (2)切片粘合剂的种类
多聚赖氨酸(分子量300KD):0.5%浓度。
APES试剂(3-氨基、丙基三氧基硅烷): 干净载玻片→丙酮5min →APES(1ml+ 50ml丙酮):用镊子 夹住浸入APES试剂1~3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包 好,室温或4℃保存备用。
常用标记物
1.酶 为最常用的标记物。作为标记的酶应具有以下条件:① 底物是特异性的,且易于显示;②酶反应产物稳定,不易 扩散;③容易获得纯酶分子且较稳定;④酶标记抗体后, 不影响两者的活性;⑤被检组织中不应存在内源性相同的 酶或其底物。常用的标记酶有辣根过氧化物酶(HRP)、 碱性磷酸酶(AKP)、葡萄糖氧化酶(GOD)等。 2.荧光素 指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用 的有异硫氰酸荧光素( FITC )、四甲基异硫氰酸罗达明 (TRITC)、PE等。 3.生物素 与卵白素的亲和力明显高于抗原抗体的结合力。 4.金属标记物 如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。
收波长为490nm,最大发射波长为520nm。
免疫荧光法分为直接法和间接法(二步法)。
二、免疫酶法
用酶标记抗体,在组织切片上进行特异的抗原
抗体反应后,用组织化学方法使标记的酶催化相应
的底物,生成有色产物,在显微镜下观察,可间接
地对抗原物质进行定位。标记抗体常用的酶有辣根
过氧化物酶、碱性磷酸酶等,以辣根过氧化物酶作 为标记物更常用。
石蜡组织切片中抗原性的修复:
A、化学方法: 胰蛋白酶(0.05~0.1% ,含0.1%CaCl2) 蛋白酶K B、物理方法 单纯加热法: 高压加热法: 微波方法: 柠檬酸盐缓冲液
2.4三步法 D、多步法
一、免疫荧光法
用荧光染料作为标记物,最常用的荧光素是异硫氰酸 荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)。将 FITC标记的特异性抗体和组织切片上的相应抗原结合, 在荧光显微镜下观察,FITC呈现黄绿色荧光,代表所 鉴定抗原的定位。FITC为黄褐色粉末或结晶,最大吸
免疫组织化学及其应用
概
述
1.免疫组织化学概念
免疫组织化学(Immunohistochemistry) 又称免疫细胞 化学,其主要原理是用荧光素、酶、胶体金等标记的抗体检 测细胞或组织内的相应抗原,经过组织化学的呈色反应之后, 用光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察,进行定性、 定位或定量分析。 通过免疫组织化学手段,凡是能作抗原、半抗原的物质, 如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病 原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内将其检出和 对其进行研究。