芯片类检测：Luminex PLEXMAP BIOPLEX 液相芯片检测
Luminex液相芯片的发展及应用
Luminex液相芯片的发展及应用谢冲;王国民【摘要】液相芯片技术是20世纪90年代兴起的,集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术.它的最大特点是通量大、灵活性好.Luminex公司利用液相芯片技术先后推出了Luminex 100、Luminex 200和Flexmap 3D液相芯片检测平台.现对Luminex液相芯片的发展、原理及应用作一简介.【期刊名称】《复旦学报（医学版）》【年(卷),期】2010(037)002【总页数】4页(P241-244)【关键词】Luminex;液相芯片;Flexmap 3D【作者】谢冲;王国民【作者单位】复旦大学附属中山医院泌尿外科,上海,200032;复旦大学附属中山医院泌尿外科,上海,200032【正文语种】中文【中图分类】Q78人类基因组计划于20世纪90年代完成,随后开启了以功能基因组学和蛋白质组学为核心的后基因组时代。
液相芯片技术就是在这样的背景下发展起来的新一代生物芯片技术。
它具有通量大、灵活性好、灵敏度高、动力学范围广等优点[1-4],它的发明对分子生物检测领域具有里程碑意义。
近十年来,Luminex公司对液相芯片技术不断推陈出新,使其与传统检验方法相比优点更多,运用范围也更加广泛。
Luminex液相芯片的发展过程液相芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的,被誉为后基因组时代的芯片技术,也被称为xMAP技术。
它是集流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术。
基于xMAP技术,Luminex公司于1999年推出第1代Luminex100液相芯片检测系统。
Luminex100的最大特点为高通量和高效性,即它可以同时对1个样本中的100种不同目的分子进行检测,并能在30min内检测96个不同样本。
在Luminex100的基础上,Luminex公司又于2005年推出了Luminex200液相芯片检测系统。
液相芯片检测
液相芯片检测液相芯片检测（liquid-phase chip detection）是一种高通量生物分析技术，通过利用芯片上微米级的通道系统和表面功能化的分析区域，能够在极短的时间内完成多个生物分子的检测和分析。
液相芯片检测技术在生物医学研究、药物筛选、食品安全监测等领域具有广泛的应用前景。
液相芯片检测技术的核心是芯片上微通道系统的设计和制备。
微通道系统不仅具有高通量的特点，还能够实现物质的精确控制和分离，从而提高检测的准确性和灵敏度。
此外，芯片的表面还可以进行功能化修饰，使其能够特异地与目标分子发生相互作用，实现对目标分子的选择性检测。
液相芯片检测技术主要包括样品处理、样品注入、分析区域的选择性识别和信号检测四个基本步骤。
首先，样品需要经过一系列的前处理步骤，如提取、浓缩、纯化等，以消除样品中的干扰物质，并保持目标分子的完整性和活性。
然后，样品被注入到芯片的微通道系统中，通过外部控制使样品在通道中流动。
在流动过程中，如果芯片的表面经过功能化修饰，则目标分子能够与修饰后的表面发生特异的相互作用，从而被选择性地捕获或固定在芯片的分析区域上。
最后，通过适当的信号检测手段，如荧光检测、质谱检测等，可以获得与目标分子浓度相关的信号，实现对目标分子的高灵敏度检测和定量分析。
液相芯片检测技术具有多种优点。
首先，液相芯片可以实现高通量的检测，大大提高了检测效率和样品处理能力。
其次，芯片上的微通道系统可以提供精确的流动控制和分离能力，使得样品处理更为简便和高效。
此外，液相芯片还可以实现多种检测手段的集成，实现多参数联合分析，提高了检测的精确性和可靠性。
最后，液相芯片检测技术无需大量的标记物和试剂，减少了实验成本和对环境的污染，具有绿色环保的特点。
液相芯片检测技术在生物医学研究领域有着广泛的应用。
例如，可以用于基因组学的DNA测序和基因表达的定量分析；可以用于蛋白质组学的蛋白质鉴定和酶活性测定；可以用于细胞分析和细胞外囊泡的分离与检测等。
luminex液相芯片技术原理
luminex液相芯片技术原理
Luminex液相芯片技术是一种用于做多色原理，蛋白质分析及重组药品检测等的分析化学技术。
又称离心多色芯片技术，是液相平台技术的一种。
Luminex技术是基于荧光原理、紫外-可见放射非特定性抗体双重标记法，广泛应用于免疫、蛋白分析、重组药品质量检测、细胞相互关系等研究。
Luminex技术主要分为离心多色芯片及液相平台信号集成等两个方面。
离心多色芯片是指用于检测单个表面染色体上标记细胞做多色研究的技术。
其中，放射性荧光来源可以检测标记细胞的分布，并可以使用多个不同的放射性源来查看多个表型。
液相平台则是用一定体积的液体接收单个孢子上的多种抗原或特异性抗体的刺激。
液相平台的信号集成则是把上述信号聚合在一起，追踪每个抗原或者特异性抗体的响应传导和激素变化中心进行分析，从而确定他们之间的相互作用。
Luminex技术主要优势是可以从极低的细胞表型水平上检测，从而更加深入地探索细胞内特定原材料和活性物质之间的介绍作用以及它们在分子细胞程序中所扮演的角色。
Luminex技术在许多研究领域中表现出较好，比如利用它可以高度灵敏、特异性的分离定性的抗原和抗体信息；可以用于分析新的免疫和其他生物反应物质，甚至可以用于快速、高效的疾病屣病毒特异性诊断，以及对付生物武器等。
通过Luminex技术，可以同时进行大量低成本的分析，而且可以使培养细胞从一次性制剂转化为可循环利用的重复使用细胞，极大的提高了分析的效率。
因此Luminex技术可以为细胞分析及更精确的活性物质结构解析提供一个有效的替代解决方案。
Bio-Plex-液相悬浮式蛋白质芯片系统简明操作
一、芯片平台与试剂盒悬液微珠芯片平台为：Bio-Plex Magpix System ( Bio-Rad)；实验中使用试剂盒包括以下几种：1.仪器校准：Bio-Plex Validation Kit ( Bio-Rad)，Bio-Plex Calibration Kit ( Bio-Rad)；2.Mouse多因子检测试剂盒：以上试剂盒包括了实验中使用的所有试剂、样品稀释液、缓冲液等。
3.其他仪器磁力洗板器，Handheld magnetic washer，美国Bio-Rad，171020100；二、样品与标准品准备按照试剂盒操作手册推荐，样本处理方法如下：标准品稀释：向标准品瓶中，加入500ul Standard diluents，涡旋5秒，冰浴30分钟。
然后按照以下稀释。
样品准备：（冰上操作）样本解冻后，按照客户要求进行稀释。
三、检测操作1、取微珠在振荡器上1400rpm振荡30s，按说明书上提示比例，用Assay Buffer稀释微珠。
2、按照说明书要求，稀释液重悬标准品、轻轻混匀，放置于冰上30min以保证其充分溶解。
3、用标准品稀释液对标准品进行稀释，本次实验共计稀释8个梯度，S1-S8。
4、将稀释完的微珠用vortex1400rpm震荡30s，每孔50ul的量加入96孔板中。
5、使用磁力洗板器洗涤两次。
6、加入稀释好的标准品和样品，每孔50ul，贴上封口膜，放置在平板摇床上850rpm振荡避光室温孵育30-60min。
7、使用磁力洗板器洗涤三次。
8、采用Detection Antibody Dilute Buffer按说明书要求稀释度稀释DetectionAntibody。
9、加入稀释好的用biotin标记的抗体，每孔25ul，贴上封口膜，放置在平板摇床上850rpm振荡避光室温孵育30min。
10、使用磁力洗板器洗涤三次。
11、用Assay Buffer按说明书要求稀释Streptavidin-PE。
液相芯片检测技术
液相芯片检测技术如下：
1.高通量：液相芯片检测技术可以对同一样本中的多种不同目的
分子同时进行实时、定性、定量分析。
理论上，如果不存在交叉反应，检测的通量等于微球的种类数，目前最多可达到100种。
2.样本用量少：由于在同一个反应孔中可以同时完成100种不同
的生物学反应，所以大大节省了样本用量，少至1μl的样本即可检测，非常适合分析小体积稀有样品。
3.操作简单、快速：液相芯片检测技术基于液相反应动力学，因
此反应速度快，孵育时间比传统的固相检测短。
4.灵敏度高：微球表面积大，每个微球上可包被100 000个捕获
抗体，如此高密度的捕获抗体保证了能够最大程度地与样本中的抗原分子结合，提高检测灵敏度。
5.准确性高：微球上的报告分子荧光强度与结合的待测分子成正
比。
由于液相芯片技术的检测范围大，因此不需要象ELISA检测中那样需将样本多倍稀释，从而减小了误差。
6.检测范围广：液相芯片检测技术可用于检测多种类型的生物分
子，包括蛋白质、多肽、抗体、抗原、DNA、RNA等。
液相悬浮芯片(Bio_Plex)PPT 培训
校验参数
• 光学部分校正（光学部件 位置精度）
• 液流系统校正（液流精度 和消除交叉污染）
• 报告激光校正（线性、灵 敏度、动态范围、斜率、 精确度等）
• 分类检测校正（微球色标 编码的正确性）
protocol编制
Bio-Plex 总结
• Bio-Plex是一个定量检测系统，每孔可检测150 种不同的指标
药物筛选
➢疾病Marker发现 ➢疾病Model
蛋白表达谱
➢一般细胞因子研究 ➢疾病建模
后翻译修饰
➢信号传导因子
蛋白功能\相互作用
➢抗体交叉反应和特异性 ➢蛋白蛋白相互作用 ➢受体配体结合 ➢酶的活性 ➢抗原决定簇
试剂开发的公司
Research/Drug Discovery Clinical Diagnostics
– 自动清洗、校正、校验
• 校正所有检测器通道
– 重置DD, CL1, CL2, RP1标准信号输出 – RP1低电压、高电压校正以调整灵敏度和动态范围 – 校正Kit标有各项目标值，输入对话框自动完成校正
校正程序
校验工具和作用
• 保证仪器性能符合设定的参数 • 保证世界上任意两个地方的仪器的数据可
检测大分子受到限制 数据精度 重复性问题
成本问题
液相芯片克服了这些问题…开拓了生物芯片 新的应用领域
液相芯片技术
20世纪90年代兴起，集流式细胞、激光、数字信号 处理等技术为一体的多功能液相分析平台。
基本原理
捕获微球
探针分子 待测分子 标记的检测分子
微球特点
• 不同浓度的两种颜色
– 荧光分类染料 Fluorescent Classification Dyes
Luminex液态芯片在临床及科研中的应用
Luminex液态芯片在临床及科研中的应用张保强;张晓【摘要】Luminex 液态芯片是一个多功能、多指标并行分析系统,集编码微球、激光技术、流式细胞、数字信号处理等技术于一体,具有高通量、既能检测蛋白,又能检测核算等特点,可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究.本文就液态芯片技术的原理、特点及在临床和科研中的应用进行阐述.【期刊名称】《当代医学》【年(卷),期】2012(018)004【总页数】3页(P18-20)【关键词】液态芯片;悬浮阵列;肿瘤标志物;HPV基因分型;移植配型【作者】张保强;张晓【作者单位】261061,潍坊市疾病预防控制中心检验科;261061,潍坊市疾病预防控制中心检验科【正文语种】中文液态芯片是美国纳斯达克上市公司Luminex于本世纪初研制出的后基因组时代的技术平台，又称悬浮阵列、流式荧光技术，是基于多功能流式点阵仪（Luminex 100）开发的多功能生物芯片平台，是一个多功能、多指标并行分析系统（见图1）。
它有机地整和了编码微球（color-codedbeads）、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，造就了高度的检测特异性和灵敏度，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，也是目前唯一得到权威机构和医学界共同认可用于临床诊断的生物芯片平台。
2003年美国食品与药品管理局(FDA)批准该项技术用于临床检验诊断。
图1 Luminex 100 多功能流式点阵仪1 Luminex液态芯片技术的概况1.1 工作原理该技术的核心是采用聚苯乙烯(polystyrene)制作微球，把微小的聚苯乙烯小球（5.6 μm）包覆以不同比例的红光及红外光染色剂，制成100种不同颜色的微球[1]（见图2）。
将每种颜色的微球（或称为荧光编码微球）共价交联上针对特定检测物的探针、抗原或抗体。
不同的微球结合了针对不同待检测物的蛋白（抗体或抗原，用于免疫检测）或核酸（DNA或RNA用于基因检测），检测抗体中以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。
luminex液相芯片技术实验流程
Luminex液相芯片技术是一种高通量的生物分子检测平台，可以同时检测多种生物标志物。
实验流程大致如下：
1. 样本准备：根据实验需求，准备好待检测的样本。
样本可以是细胞培养上清液、血清、血浆等。
2. 微球准备：Luminex液相芯片使用的微球内部含有三种免疫荧光染料，通过不同的荧光比例来区分500种不同的微球。
微球上会偶联针对不同待测物的抗体或基因探针。
3. 实验设计：根据需要检测的标志物，选择相应的微球和试剂。
可以设计多重检测，一次实验可以检测多达100种不同的生物学反应。
4. 加样：将样本或PCR产物与微球混合，使所形成的复合物与标记荧光素发生反应。
5. 检测：将混合后的微球放入Luminex液相芯片检测系统。
该系统包括激光系统、光学系统、液流系统、液流控制系统以及先进的数字处理系统和高通量XY平台。
微球在流动鞘液的带动下快速单列通过检测通道，红色激光用于识别微球的荧光编码，绿色激光用于测定微球上结合的报告分子的荧光强度。
6. 数据分析：利用配套的分析软件对检测数据进行分析，得到定性和定量的结果。
7. 结果解读：根据实验设计和数据分析，解读检测结果。
需要注意的是，实验操作过程中应严格遵循实验室规范和操作指南，确保实验的准确性和可靠性。
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sCD30 可溶性CD30
sCD40L可溶性CD40L
sEGFR可溶性表皮生长因子受体
sgp130 可溶性糖蛋白130
sIL-2Rα可溶性白细胞介素-2受体α
sIL-4R可溶性白细胞介素-4受体
sTNF RI 可溶性肿瘤坏死因子受体I
sTNF RII可溶性肿瘤坏死因子受体II
p70 S6 Kinase (Thr412) 磷酸化核糖体S6蛋白激酶β2抗体
STAT1 (Tyr701)磷酸化信号转导与转录激活因子1
STAT1 (Tyr707)磷酸化信号转导与转录激活因子1
STAT3 (Tyr705)磷酸化信号转导与转录激活因子3
STAT5A/B (Tyr694/699) 磷酸化信号转导与转录激活因子
ZAP-70 (pan Tyr)磷酸化zeta相关蛋白70
Syk (pan Tyr)磷酸化非受体型酪氨酸蛋白激酶
Active Caspase 3 活化半胱胺酸蛋白酶 3
Active Cleaved PARP活化切割的多腺苷二磷酸多聚酶
ATF2 (Thr69/71)活化复制因子2
BAD (Ser112)磷酸化相关死亡促进因子
IFNγ干扰素γ
IL-10白介素-10
IL-12 (p70) 白介素-12
IL-13白介素-13
IL-17白介素-17
IL-1ra白介素-1ra
IL-2白介素-2
IL-20 白介素-20
IL-28a 白介素-28a
IL-29 白介素-29
IL-4 白介素-4
IL-5 白介素-5
IL-8 白介素-8
IL-9 白介素-9
sIL-1RII可溶性白细胞介素-1受体II
sIL-6R 可溶性白细胞介素-6受体
sRAGE 可溶性晚期糖基化中产物受体
sVEGF R2 可溶性血管内皮生长因子受体2
sVEGF R3 可溶性血管内皮生长因子受体3
TGFα转化生长因子α
TIMP-1组织金属蛋白酶抑制剂-1
TIMP-4组织金属蛋白酶抑制剂-4
IL-1β白介素-1β
IL-21 白介素-21
IL-23 白介素-23
IL-3白介素-3
IL-33/NF-HEV (mature) 白介素-33
IL-6 白介素-6
IL-7 白介素-7
IP-10 干扰素诱导蛋白-10
I-TAC/CXCL11干扰素诱导T细胞趋化因子
MCP-1(MCAF)单核细胞趋化蛋白1
PDGF Receptor α (pan Tyr)磷酸化血小板源性生长因子受体-α
Rsk1 (Ser380)磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白
STAT2 (Tyr690)磷酸化信号转导与转录激活因子2
STAT3 (Ser727)磷酸化信号转导与转录激活因子3
STAT6 (Tyr641)磷酸化信号转导与转录激活因子6
Substance P神经肽
α2-Macroglobulinα2巨球蛋白
4、骨代谢因子检测
IL-1β白细胞介素
ACTH促肾上腺皮质激素
Leptin瘦素
Osteopontin (OPN)骨桥蛋白
PTH甲状旁腺激素
TNFα 肿瘤坏死因子α
RANKL核因子κ B受体活化因子配体
Adiponectin脂联素
Complement Factor H补体因子H
C reactive protein (CRP) C-反应蛋白
MPO髓过氧化物酶
NCAM神经细胞黏附分子
Oxytocin催产素
PAI-1 (total)全部凝血酶元激活因子的抑制因子
PEDF色素上皮源性因子
Prealbumin前清蛋白
sICAM-1可溶性细胞间粘附分子1
TNFα 肿瘤坏死因子α
VEGF血管内皮生长因子
CEA 癌胚抗原
C reactive protein (CRP) C-反应蛋白
Eotaxin 嗜酸细胞活化趋化因子
ER-α 雌激素受体α
Fibrinogen纤维蛋白原
AFP 甲胎蛋白
Haptoglobin 结合珠蛋白
HER-2(erbB2) 表皮生长因子受体
IGF1R (pan Tyr)胰岛素样生长因子1受体
IRS1 (pan Tyr)胰岛素样生长因子1受体
LAT (pan Tyr)T细胞活化连接蛋白抗体
Lck (pan Tyr)磷酸化淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶
MSK1 (Ser212)炎性细胞因子依次激活
p21负调控因子
p53 (Ser46)磷酸化肿瘤抑制基因
CTACK/CCL27皮肤T细胞虏获趋化因子
EGF表皮生长因子
Eotaxin-2/CCL24/MPIF-2嗜酸细胞活化趋化因子-2
Eotaxin-3/CCL26嗜酸细胞活化趋化因子-3
Fractalkine 人神经趋化因子
GCP2/CXCL6 人中性粒细胞趋化蛋白2
GRO生长相关基因蛋白
HCC-1/3/CCL14α/β
3、神经因子检测
Apo CIII载脂蛋白
Apo E载脂蛋白
Complement C3补体C3
Complement C4补体C4
Melatonin褪黑激素
MIP-4巨嗜细胞趋化蛋白-4
Neurotensin神经降压素
Orexin A 食欲素A
PDGF-AA血小板衍生因子
PDGF-AB/BB血小板衍生因子
重复性好：类均相反应模式，每个指标有1000-5000个反应单元，分析100次取中位均值。
准确性高：检测范围达3.5-6个数量级，与ELISA和质谱分析具有很强的一致性。
成本低：流式荧光技术联检的试剂用量少，能有效降低临床应用的成本。
Luminex\PLEXMAP\BIOPLEX的检测项目
1、细胞因子/化学因子检测
RANTES趋化因子
SAP人血清淀粉样P物质/运兵车/ SAP蛋白
sVCAM-1可溶性血管细胞粘附分子 1
α1-Antitrypsinα 1-抗胰蛋白酶
β-Endorphinβ-内啡肽
α-MSH促黑激素
Cortisol皮质（甾）醇
Apo Al载脂蛋白
BDNF脑源性神经营养因子
Cathepsin D组织蛋白酶D
MMP -3 基质金属蛋白酶-3
MMP -7 基质金属蛋白酶-7
MMP -12 基质金属蛋白酶-12
MMP -13 基质金属蛋白酶-13
PDGF-AB/BB血小板衍生生长因子AB/BB
RANTES分泌趋化因子
SCF干细胞因子
SDF-1α+β/CXCL12基质细胞衍生因子-1α+β
sIL-1RI可溶性白细胞介素-1受体I
多功能性：xMAP技术可以运用到多种生物检测中，包括免疫分析、基因分型、基因表达、酶分析等。既能检测蛋白，又能检测核酸。除了用于临床外，也能用于科研、CDC、血站、农业、生物及制药专业实验室等。
灵活性高：微球上可连接特异性的探针、抗原或抗体等来满足不同客户的需要。
灵敏度高：检测低限可达0.01pg/ml。
c-Kit (pan Tyr)磷酸化原癌基因
Cleaved PARP 聚腺苷二磷酸-核糖聚合抑制酶
EGF Receptor (pan Tyr)表皮生长因子受体
Erb-B2/HER2 (pan Tyr)表皮生长因子受体
H2A.X (Ser139)泛素化组蛋白
HSP27 (Ser 78) 磷酸化热休克蛋白27抗体
IκBα (Ser 32)磷酸化蛋白激酶2
JNK (Thr183/Tyr185)双磷酸化应激活化蛋白激酶
MEK1 (Ser222)丝裂原活化蛋白激酶激酶1
MKK6 (Ser207/Thr211)炎性细胞因子依次激活
p38 (Thr180/Tyr182)丝裂原活化蛋白激酶
p53 (Ser15) 磷酸化肿瘤抑制基因
LIF白血病抑制因子
Lymphotactin淋巴细胞趋化蛋白
MCP-3/CCL7单核细胞趋化蛋白3
MCP-4单核细胞趋化蛋白4
MIG/CXCL9趋化因子9
MIP-1D (MIP-5/CCL15)巨噬细胞炎性蛋白-1D
MIP-3β/CCL19巨噬细胞炎性蛋白3β
MIP-3α/CCL20巨噬细胞炎性蛋白3α
【嘉美实验】嘉美生物可提供Luminex、Mllipore的FLEXMAP和Bio-Rad的BioPlex液相芯片检测实验外包服务。Luminex的代表产品 Luminex 100/200以及新推出的Mllipore的FLEXMAP 3DTM和Bio-Rad公司的BioPlex system都是基于xMAP技术原理，整合了荧光编码微球、激光检测、应用流体学、最新的高速数字信号和计算机运算法则等多项技术，真正实现了“高通量”检测，并荣获2005年度国际临床诊断技术革新奖。是唯一得到美国FDA批准的，也是唯一被纳入美国临床实验室质控网络的高通量诊断技术。被国际业界专家评价为临床诊断的趋势性技术之一。
MCP-2单核细胞趋化蛋白2
M-CSF巨噬细胞集落刺激因子
MDC/CCL22 巨噬细胞来源的趋化因子
MIP-1α巨噬细胞炎性蛋白-1α
MIP-1β巨噬细胞炎性蛋白-1β
MMP -1基质金属蛋白酶-1
MMP -2 基质金属蛋白酶-2
MMP -9 基质金属蛋白酶-9
MMP -10 基质金属蛋白酶-10
NAP-2/CXCL7中性粒细胞趋化蛋白2
TNFα 肿瘤坏死因子α
TRAIL/TNFSF10肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体
TSLP人胸腺基质淋巴细胞生产素
6Ckine/CCL2 次级淋巴组织趋化因子