Merck Millipore-液相芯片技术在肿瘤检测和研究中的应用

Milliplex/Luminex液相芯片技术在肿瘤检测和研究的应用 前言 目前，肿瘤标志物的研究与应用已成为肿瘤防治的重点和热点。但当前肿瘤标志物检测能否达到早期诊断的效果？有无在人群中进行普查或筛查的价值？其临床意义如何解释？怎样规范与合理应用？尚存在诸多争议。为此，中华医学会检验医学分会肿瘤标志物专家委员会，在2002年至2004年分别召开3次专家研讨会，起草制订了“肿瘤标志物临床检测的基本原则(建议稿) ”对以上问题进行了解释。本文主要从以下几个方面进行介绍：  肿瘤标志物临床检测的基本原则  肿瘤标志物的检测指标  肿瘤标志物的高危人群检测项目  肿瘤血管的形成  慢性炎症与肿瘤微环境  趋化因子与肿瘤微环境  液相芯片技术原理  Milliplex肿瘤微环境相关试剂盒介绍  肿瘤微环境与肿瘤标记应用的相关文献

一、 肿瘤标志物临床检测的基本原则 肿瘤标志物( TM) 是指在恶性肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的或是由机体对肿瘤反应而异常产生和/ 或升高的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶 (同工酶) 、多胺及癌基因产物等。TM 存在于病人的血液、体液、细胞或组织中 ,可用生物化学、免疫学及分子生物学等方法测定，且对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、观察疗效、监测复发以及预后评价具有一定的价值。 TM在肿瘤监测中的价值：TM的主要临床应用价值是判断治疗肿瘤治疗疗效和复发监测。临床可通过对肿瘤患者治疗前后及随访中 TM浓度变化的监测，了解肿瘤治疗是否有效，并判断其预后，为进一步治疗提供参考依据。为确定何种 TM适用于对肿瘤患者进行治疗监测，在患者治疗前应做相关 TM检测。 TM浓度变化对肿瘤的疗效判断价值：恶性肿瘤治疗后 TM浓度的变化与疗效之间有一定的相关性。治疗前 TM浓度变化 ,常有三种类型：① TM浓度下降到参考范围，提示肿瘤治疗有效。②TM浓度下降但仍持续在参考范围以上，提示有肿瘤残留和/ 或肿瘤转移。③TM浓度下降到参考范围一段时间后，又重新升高，提示肿瘤复发或转移。 TM的定期随访原则：恶性肿瘤治疗结束后，应根据病情对治疗前升高的 TM作定期随访监测。不同的 TM半衰期不同，所以监测的时间和周期也不同。大部分国内外专家建议，治疗后 6 W做首次测定，3年内每 3月测定一次；3～5 年每半年一次，5～7 年每年一次。随访中如发现有明显升高，应 1 月后复测一次，连续 2次升高，可预示复发或转移。此预示常早于临床症状和体征，而有助于临床及时处理。 TM 的联合检测原则：同一种肿瘤或不同类型的肿瘤可有一种或几种TM异常；同一种TM可在不同的肿瘤中出现。为提高 TM 的辅助诊断价值和确定何种TM可作为治疗后的随访监测指标，可进行联合检测，但联合检测的指标须经科学分析、严格筛选。在上述前提下，合理选择几项灵敏度、特异性能互补的 TM 构成最佳组合，进行联合检测。经过临床应用，以循证医学的观点来评价和修改联合检测的 TM 组合。

二、 肿瘤标志物的检测指标 每年全球癌症死亡人数约为700万人， 其中24%发生在中国。中国癌症患者的生存患者和治愈患者仅为13%， 肿瘤防治水平远低于世界平均水平。世界卫生组织作出最新权威性结论，癌症患者如能早期发现，治愈率可达80%。肿瘤标志物可以比影像学更早的发现肿瘤，因而对于治疗癌症意义深远。肿瘤标志物的分泌来源于肿瘤微环境的基质细胞以及肿瘤细胞，存在于细胞、组织或体液中，能用化学或免疫方法定量、能证实肿瘤存在，监测肿瘤治疗和预后的物质。目前没有灵敏度、特异性100%的肿瘤标志物，因而肿瘤标志物联合检测是提高肿瘤标志物应用的重要途径。

肿瘤类型 肿瘤标志物（按检测的顺序排） 肝 AFP＋CEA 胰 CEA＋CA199＋CA242＋CA50 胃 CEA＋CA724＋CA199 乳腺 CA153 ＋CEA ＋CA125 卵巢 CA125 ＋β-HCG ＋AFP＋CEA ＋CA724 子宫 CEA＋ SCC＋SF＋β-HCG 前列腺 FPSA/TPSA＋PAP

除肿瘤的早期发现外，对肿瘤生长、迁袭和转移的确定有助于有针对性的个体化治疗方案研究。Lambeck在2007年卵巢癌研究中发现细胞因子IL-6, IL-7以及肿瘤标志物CA125可有差异地区分卵巢癌的不同阶段，并区分良性肿瘤和恶性肿瘤。

三、 肿瘤标志物的高危人群检测项目 TM用于高危人群筛查的原则：应用TM对于高危人群进行筛查时应遵循下列原则：①该肿瘤标志物对早期肿瘤的发现有较高的灵敏度。②测定方法的灵敏度、特异性高和重复性好如甲胎蛋白 (A FP) 和前列腺特异抗原 ( PSA) 。③筛查费用经济、合理。④筛查时肿瘤标志物异常升高 ,但无症状和体征 ,必须复查和随访的。 高危人群的检测指标如下： 肿瘤标志物2项 AFP、CEA最常用指标，主要针对肝癌、消化系统肿瘤 肿瘤标志物2项 t-PSA、f-PSA最常用指标，主要针对前列腺癌 肿瘤标志物3项 AFP、CEA、CA19-9消化系统的精选指标，主要针对肝癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆道癌。 肿瘤标志物3项 CEA、Cyfra21-1、NSE肺癌精选指标。 肿瘤标志物4项 AFP、CEA、Cyfra21-1、NSE肝肺精选指标，主要针对肝癌、各种组织类型的肺癌（包括小细胞肺癌、大细胞肺癌、肺鳞癌、肺腺癌）。 肿瘤标志物5项 AFP、CEA、Cyfra21-1、NSE、CA19-9消化系统、肺癌和肝癌的精选指标，主要针对肝癌、各种组织类型的肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆道癌等。 肿瘤标志物女7项 AFP、CEA、Cyfra21-1、NSE、CA125、free-β-hCG、CA15-3女性全套，主要针对肝癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆道癌、肺癌、卵巢癌、绒毛膜癌、宫颈癌和乳腺癌等 肿瘤标志物男8项 AFP、CEA、Cyfra21-1、NSE、CA125、free-β-hCG、t-PSA、f-PSA男性全套，主要针对肝癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆道癌、肺癌、睾丸癌、前列腺癌等

四、 肿瘤血管的形成 恶性肿瘤增长迅速，一方面，肿瘤细胞凋亡的速度明显低于其所对应的正常组织，从而使得它对氧以及其他葡萄糖能量物质的需求增加；另一方面，肿瘤体积高度膨胀，一部分肿瘤组织逐渐远离具有丰富营养来源的血管而出现血供不足，导致这一部分肿瘤组织缺氧，而且这些区域常常出现坏死，也更容易发生肿瘤转移。肿瘤组织缺氧区域中的缺氧诱导因子（HIF-lα）处于高表达状态。研究发现HIF-lα表达与肿瘤的恶性程度及其相关，已成为重要的抗肿瘤转移的靶标。在有关乳腺癌的研究中发现HIF-lα处于高表达。HIF- lα上调会使血管内皮生长因子（VEGF）表达升高。在心肌缺血研究中发现，HIF- lα是调节血管生成的重要因子，控制着多种血管生成生长因子的表达，如PDGF。碱性成纤维生长因子（bFG F ) 的表达和种植瘤的部位有关，将人肾型细胞癌细胞接种于裸鼠的肾脏，表达的bFGF要比接种于正常皮下的高10～20倍，在肾脏更容易形成血管。

五、 慢性炎症与肿瘤微环境 某些肿瘤发生前或发生时常有慢性炎症。已有研究证实，炎症介质、炎症相关基因多态性与癌变之间存在病原学关系。潜在的炎症过程可通过不同的机理影响肿瘤间室与癌症分期。从目前的研究来看，慢性炎症似乎总是先刺激而后抑制肿瘤的发展。而大多数的肿瘤都可以从免疫细胞中获益并依赖免疫细胞。慢性炎症的持续存在在启动、维持、促进肿瘤生长中发挥重要作用。因此调节免疫反应仍将是治疗干预的理想目标。

1. 肿瘤启动与免疫炎症 起初有研究认为急性炎症能够抑制甚至消除隐匿性癌然而急性炎症反应是自限性的，在某些情况下会演变为与肿瘤启动相关的慢性炎症反应。尽管机体对病原的反应与对肿瘤的反应有些相似，但抗肿瘤反应通常较弱且不足以清除肿瘤细胞。其原因可能在于：初始信号未被识别为与外源性病原同样危险的信号；“宿主”进一步下调了其感知到的自身免疫反应；微环境阻止免疫系统到达肿瘤细胞。新近发现NFκB和STAT3信号通路是促炎细胞因子及与肿瘤增殖和慢性炎症持续相关的重要介质释放的主要调控器。这些通路的活化会形成恶性循环，由此促致瘤炎症会导致细胞因子的进一步释放。

2. 慢性炎症与肿瘤的免疫逃逸、转移 恶性肿瘤通常与有效的T淋巴细胞反应及增强的体液免疫反应的抑制有关。肿瘤细胞具有未分化的特质，连同逃避免疫细胞监视的能力以及对宿主免疫的直接抑制作用可能共同导致了机体抗肿瘤反应的不足。尽管有自体同源的效应T细胞的存在，而其却被聚集在肿瘤组织的大量调节性T淋巴细胞所抑制。最近的研究发现这些细胞具有促炎性，并能促进血管生成。因此，肿瘤相关炎症与促炎信号及抗炎信号皆有关，因而能允许肿瘤生长并逃过免疫监视。一系列的证据表明，炎症在肿瘤细胞的侵袭、转移中起重要作用。最引人注目的发现是上皮肿瘤细胞具有转移并表达特定趋化因子受体的能力。这一过程由旁分泌的促炎细胞因子（即IL1-β、IL-6、TNFα）及某些自分泌的细胞因子产物所维持。有研究发现，TNFα的敲除可导致细胞趋化因子受体CXCR4和趋化因子基质细胞衍生因子-1（CXCL12）的表达降低以及肿瘤转移至腹膜腔的能力下降。

3. 肿瘤免疫反应中的可溶性介质和其它介质 肿瘤细胞（上皮）与肿瘤微环境的相互作用、相互影响被认为是癌变的必要因素。特定细胞因子的作用如前所述，遗传学研究及动物实验均证实细胞因子在联系慢性炎症与肿瘤中发挥重要作用。细胞因子可被炎症细胞和肿瘤细胞激活，它们对于维持慢性炎症、促进肿瘤细胞进展与微环境增殖、抑制免疫介导的肿瘤监视具有非常重要的作用。总的来说，细胞因子可分为促炎型（即，IL-1、6、8、11、12、18、23，IFNγ、TNFα及MIF）和抗炎型（即，IL-4、10，IFNα、IFNβ、TGFβ）；然而，其中许多分子都具有双重作用，如TNFα和IL-1β在慢性炎症的启动中是必需的，其通过NFκB途径的活化与肿瘤密切相关。

六、 趋化因子与肿瘤微环境 肿瘤微环境中趋化因子及其受体影响着肿瘤的生长与转移，包括调控免疫细胞向肿瘤组织的迁移，影响机体对肿瘤细胞的清除能力，调节肿瘤组织的血管新生，刺激肿瘤以自分泌或旁分泌形式产生生长分子，影响肿瘤细胞的浸润和转移。 1. 趋化因子与肿瘤免疫耐受性反应 机体的免疫系统可以识别肿瘤抗原，进而对肿瘤细胞产生免疫效应。随着肿瘤演进，最初的免疫监视作用往往被诱导形成免疫耐受，趋化因子在这一过程中发挥重要作用。趋化因子是细胞因子家族中一个庞大的分768=8支，可以趋化免疫细胞，影响免疫系统发生作用。在肿瘤微环境中，多种肿瘤细胞和基质细胞可以分泌趋化因子。乳腺癌病灶中淋巴细胞的数量与表达CCL2和CCL5的肿瘤细胞数量呈正相关。在卵巢上皮癌中，淋巴细胞浸润的部位也可以发现 CCL3、CCL4、CCL5；卵巢上皮性癌易导致癌性腹水，腹水中可检测到CCL2、CCL3、CCL4、CCL 5、CCL 8、CCL22。 2. 趋化因子与肿瘤转移 趋化因子及其受体对于肿瘤细胞的走向发挥着关键作用。肿瘤细胞一般会大量表达一相对较少、为特异的趋化因子受体，其配体有着较为广泛、大的表达。受体与配体的结合可以引起肿瘤细胞的运动，使其向靶器官转移。如黑色素瘤细胞常表达CCR7乳腺癌细胞可表达CXCR4，其配体在乳腺癌细胞转移的目标器官中可高表达CXCL12。 3. 趋化因子与肿瘤血管新生 肿瘤微环境中趋化因子的表达可以调节肿瘤血管新生。包含ELR的CXC族趋化因子可以促进肿瘤的血管新生。体内实验发现，它们可以定向趋化血管内皮细胞，巨噬细胞产生VEGF，引起肿瘤血管新生。在小细胞肺癌中也已发现CXCL5水平增高与肿瘤组织中血管密度呈正相关。