人卵巢颗粒细胞分离培养的优化及生物学特性
人卵巢颗粒细胞原代培养方法的比较
人卵巢颗粒细胞原代培养方法的比较李佳琪;何远桥;汪璇;胡佳;何林生【期刊名称】《广东医学》【年(卷),期】2017(0)z1【摘要】目的对比5种不同方法分离人卵巢颗粒细胞的效果,并选择出高效、稳定的分离纯化、体外培养的有效方法.方法收集不孕症患者行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)穿卵时的卵泡液,采用裂解法、裂解+胰酶法、密度梯度离心法(包括Precoll+胰酶、Precoll+Ⅰ型胶原酶、Precoll+透明质酸酶)分离颗粒细胞后进行活细胞计数,卵泡生成素免疫组化染色鉴定,MTT法检测细胞增殖能力,检测颗粒细胞体外分泌雌激素含量.结果在使用不同方法分离颗粒细胞时,Precoll+胰酶、Precoll+Ⅰ型胶原酶、Precoll+透明质酸酶3种方法得到细胞数量多于裂解法及裂解+胰酶法(P<0.05).各种分离方法的细胞生长趋势并无明显差异.裂解法、裂解+胰酶法雌激素含量高于Precoll+胰酶、Precoll+Ⅰ型胶原酶、Precoll+透明质酸酶(P<0.05).结论 5种方法均成功分离得到颗粒细胞,但每种方法各有优缺点,根据实验目的不同需选择不同的方法.【总页数】5页(P14-18)【作者】李佳琪;何远桥;汪璇;胡佳;何林生【作者单位】南昌大学第一附属医院妇产科江西南昌 330006;南昌大学医学院江西南昌 330031;南昌大学第一附属医院妇产科江西南昌 330006;南昌大学第一附属医院妇产科江西南昌 330006;南昌大学第一附属医院妇产科江西南昌 330006【正文语种】中文【相关文献】1.人黄韧带细胞体外原代培养方法的比较 [J], 张宇;吴少鹏;夏雄智;许学猛;钟招明;陈建庭2.人牙龈成纤维细胞原代培养方法的比较研究 [J], 冷斌;刘洪臣;鄂玲玲;刘宇;吴霞3.两种人鼻咽癌活检组织上皮细胞原代培养方法比较 [J], 王瑢;何英;梁莉;曾芳芳;李仑4.人肾癌细胞原代培养方法比较及其生长特性观察 [J], 吴迪;李妍;姜申易;孟凡东;隋承光;姜又红5.人牙龈成纤维细胞原代培养方法比较 [J], 刘鹏;徐全臣;许晓燕;杨建军;徐敏华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人卵巢颗粒细胞的体外培养方法探讨
人卵巢颗粒细胞的体外培养方法探讨刘玉霞;董静霞;金玉洁;申春艳;徐健【摘要】目的建立人卵巢颗粒细胞分离纯化、体外培养的有效方法.方法收集体外受精-胚胎移植( IVF-ET) 穿卵时的卵泡液,用胰蛋白酶消化法及密度梯度离心法分离纯化颗粒细胞并用不同培养基进行培养.结果用体积分数为50 %的 Percoll细胞分离液分离,DMEM/F12或McCoy'5a液体培养基进行培养,细胞纯度高,存活率高,后续生长良好.结论建立了人卵巢颗粒细胞体外培养的稳定模型,为颗粒细胞的体外研究奠定良好的基础.%Objective To establish effective methods of purification and culture in vitro of human o-varian granulosa cells. Methods Human ovarian granulosa cells were obtained in conjunction with oocyte aspiration from women undergoing hormone treatment for in vitro fertilization. Cells were treated with trypsin and density gradient centrifugation, and then cultured with different media. Results Centrifuged by 50% (v/v) Percoll PLUS, and cultured with DMEM/F12 or McCoy'5a liquid medium, cells were of great purity, high survival rate, and good subsequent growth. Conclusion We have established a stable model of culturing human ovarian granulosa cells in vitro , and laid a good foundation for research of granulosa cells in vitro.【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》【年(卷),期】2011(020)005【总页数】4页(P436-439)【关键词】人;卵巢颗粒细胞;细胞培养【作者】刘玉霞;董静霞;金玉洁;申春艳;徐健【作者单位】北京大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系,北京,100191;北京大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系,北京,100191;北京大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系,北京,100191;北京大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系,北京,100191;北京大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系,北京,100191【正文语种】中文【中图分类】R329卵泡是女性卵巢的基本功能单位，而颗粒细胞是卵泡中最大的细胞群。
人卵丘颗粒细胞和壁层颗粒细胞体外培养方法比较
人卵丘颗粒细胞和壁层颗粒细胞体外培养方法比较何文;吕杰;李涛;文艳飞;韩婵林;蔡柳洪【摘要】AIM:To establish an effective method for purification and culture of human cumulus cells(CCs) in vitro,and to compare the characteristics between CCs and mural granulosa cells(MGCs).METHODS:Follicular fluid and cumulus complex from the patients undergoing intracytoplasmic sperm injection were s were mechanically cut from cumulus complex and then directly inoculated on a Petri dish, and MGCs were obtained from follicular fluid through density gradient centrifugation.The expression of follicle stimulating hormone receptor(FSHR)was determined by immunofluorescence.The cell growth curves were measured by CCK-8 assay.The secretion of estrogen was detected by ELISA.RESULTS:After incubated for 24 h, the adherence of CCs was s and MGCs had similar growth characteristics and FSHR expression.The similar cell growth curves were observed by CCK-8 assay and the results of ELISA showed that they had comparable secretion of estrogen.CONCLUSION:Direct culture of CCs mechanically cutting from cumulus complex is an effective s had similar growth characteristics,growth curves and secretion of estro-gen to MGCs cultured in vitro and could be a substitutive source of granulosa cell subsets.%目的:建立有效分离、提纯及培养人卵丘颗粒细胞的方法,并与人壁层颗粒细胞的体外培养相比较.方法:收集卵胞浆内单精子显微注射取卵时的卵泡液和直接机械分离卵母细胞所得的卵丘颗粒细胞复合物,直接将卵丘颗粒细胞复合物接种于培养皿中培养.用密度梯度离心法分离卵泡液中的人壁层颗粒细胞.用免疫荧光法检测卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)的表达;用CCK-8法检测细胞生长曲线;用ELISA检测这2种颗粒细胞分泌雌激素的能力.结果:直接法所得人卵丘颗粒细胞培养24 h后可贴壁,体外培养生长状态与人壁层颗粒细胞相似;免疫荧光检测显示两者均表达FSHR;CCK-8实验结果表明,两者体外培养生长曲线相似;ELISA结果显示两者分泌雌激素能力相当.结论:利用机械切割获得人卵子周围卵丘颗粒细胞复合物直接培养的方法操作简单,获得的人卵丘颗粒细胞具有与人壁层颗粒细胞相似的生长状态、生长曲线以及雌激素分泌能力,可作为人颗粒细胞亚群体外培养方法的补充.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2018(034)002【总页数】5页(P380-384)【关键词】人卵丘颗粒细胞;人壁层颗粒细胞;细胞分离;体外培养;卵泡刺激素受体【作者】何文;吕杰;李涛;文艳飞;韩婵林;蔡柳洪【作者单位】中山大学附属第三医院生殖中心,广东广州510630;中山大学附属第三医院生殖中心,广东广州510630;中山大学附属第三医院生殖中心,广东广州510630;江门市中心医院,中山大学附属江门医院生殖中心,广东江门529030;中山大学附属第三医院生殖中心,广东广州510630;中山大学附属第三医院生殖中心,广东广州510630【正文语种】中文【中图分类】R363;R711卵巢颗粒细胞是组成卵泡最大的细胞群，是女性生殖过程中发挥重要作用的一类细胞。
人卵巢颗粒细胞基因表达特征
人卵巢颗粒细胞基因表达特征1.引言1.1 概述在这篇文章中，我们将讨论人卵巢颗粒细胞的基因表达特征。
卵巢颗粒细胞是卵巢中主要的支持细胞类型之一，对于卵子的发育和成熟过程起着重要作用。
随着科学技术的不断进步，我们现在可以更加深入地了解这些细胞的功能和特性。
通过对人卵巢颗粒细胞进行基因表达谱的分析，我们可以揭示这些细胞中参与卵巢发育和功能调控的关键基因。
这些基因通过调控细胞的代谢、增殖和分化等过程，直接或间接地影响着卵子的发育过程。
此外，人卵巢颗粒细胞还具有一定的异质性特征，即不同的颗粒细胞亚群在基因表达上可能存在差异。
这些差异可能与不同的生理状态、细胞周期和病理变化相关联，因此值得进一步的研究和探索。
本文的目的在于系统地总结和分析已有的研究成果，深入了解人卵巢颗粒细胞的基因表达特征，并探讨其在卵巢发育和功能调控中的作用。
通过对这些研究结果的综合分析，我们希望能够进一步揭示卵巢颗粒细胞的分子机制，为卵巢相关疾病的诊断和治疗提供理论依据。
在接下来的章节中，我们将首先介绍卵巢颗粒细胞的基本概念和研究背景，然后详细讨论人卵巢颗粒细胞的基因表达谱，包括已知的重要基因和调控因子。
随后，我们将探讨不同人卵巢颗粒细胞亚群之间的差异，并分析其与卵巢功能相关的可能机制。
最后，我们将对目前的研究进行总结，并展望未来的发展方向。
我们相信，通过深入研究和理解人卵巢颗粒细胞的基因表达特征，我们可以为解决相关疾病的诊断和治疗问题提供新的思路和方法。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以参考以下内容：文章结构部分的主要目的是介绍整篇文章的组织结构，为读者提供一个清晰的概览。
本文将采用以下结构：第一部分是引言部分，分为三个小节。
在概述部分，我们将介绍人卵巢颗粒细胞的基本概念和重要性。
接下来，文章结构部分将详细说明整篇文章的组织结构。
最后，在目的部分，我们将明确本文的研究目的和意义。
第二部分是正文部分，包括了两个要点。
在第一个要点部分，我们将详细介绍人卵巢颗粒细胞的基本特征和功能。
原代卵巢颗粒细胞分离培养方法
原代卵巢颗粒细胞分离培养方法《原代卵巢颗粒细胞分离培养方法：我的独家秘籍大分享》嘿，宝子们！今天我要跟你们唠唠原代卵巢颗粒细胞分离培养这事儿，就像分享我压箱底的宝藏秘籍一样。
这可超级有趣呢，虽然听起来有点高大上，但只要跟着我的步骤走，你也能轻松搞定。
首先呢，咱们得准备材料。
这就好比做饭之前要准备食材一样重要。
你得有新鲜的卵巢组织，这是咱的“主角”。
我可跟你们说，我有一次去取这个卵巢组织的时候，就像在执行一个超级机密的任务，小心翼翼地生怕把它给弄“伤”了。
除了卵巢组织，还得准备好各种工具，像手术刀、镊子这些手术器械，还有培养皿、细胞培养液、离心机之类的，这就像是厨师的锅碗瓢盆和各种调料。
接下来就是正式的分离步骤啦。
把取来的卵巢组织放在盛有平衡盐溶液的培养皿里，这个平衡盐溶液就像是给卵巢组织洗个舒服的澡，把它表面那些杂质啥的都给冲掉。
这时候你得动作轻柔点，就像对待刚出生的小婴儿一样。
我记得我刚开始做的时候，手有点抖，感觉自己像是个刚学绣花的新手，就怕一不小心给组织弄坏了。
然后呢，用手术刀把卵巢组织切成小块，这个大小要适中哦，不能太大也不能太小，就像你切菜的时候，得切成合适的块状才能炒得均匀。
我把这个过程想象成给卵巢组织做个造型，切成一个个小方块。
切好之后，再把这些小块转移到含有消化酶的溶液里。
这个消化酶就像是一群小小的“建筑工人”，它们的任务就是把细胞和细胞之间连接的那些“建筑结构”给分解掉，这样咱们就能把颗粒细胞分离出来啦。
不过消化酶的作用时间可得掌握好，时间短了，细胞分不开；时间长了，细胞可能就被“消化”得太狠，就像你煮面条，煮的时间短了不熟，煮久了就烂成一团了。
在消化的过程中，要时不时地轻轻摇晃一下容器，这就像是给里面的细胞做个按摩，让消化酶能更好地发挥作用。
我每次摇晃的时候，都感觉自己像在摇一个魔法瓶，里面的细胞正在发生神奇的变化。
等消化得差不多了，就用培养液终止消化。
这就像是给那些“建筑工人”下了个停工的命令。
卵巢颗粒细胞体外培养体系的建立及DEHP、MEHP对其增殖功能的影响
［ 摘要 ］目的 ：建 立卵巢颗粒细胞的原代培 养体 系，探 讨邻 苯二 甲酸二 （ ２一乙基 ） 己酯 （ Ｅ Ｐ 及 其 活性 中间产 物邻苯二 ＤＨ ） 甲酸单 （ 一 ２ 乙基 ） 己酯（ Ｈ ） ＭＥ Ｐ 对原代培 养的卵 巢颗粒细胞 增 殖作 用的影 响。方法 ：选 用 ２ １～２ 日龄 未成年雌性 Ｗｉａ 大 ５ ｓｒ ｔ
作用时 间长短有 关。ＭＥ ＨＰ在观 察剂量下 ，尚未显 示有促进 卵巢颗粒 细胞增 殖的作 用。 ［ 关键词 ］ Ｄ ＨＰ Ｅ ；ＭＥ ；细胞增殖 ；卵巢颗粒 细胞 ＨＰ ［ 中图分类号 ］ Ｒ ９ ．６ ９４ ［ 文献标识码 ］ Ａ ［ 文章编号 ］ １０ ０ ８—２４ （０ ８ ０ ０ ０ ０ ３ ４ ２ ０ ） ４— ２ ５— ３
Ｆ２ １ ．Ａｆ ｒｒ ｔｇ ａ ｕｏ ａ ｃ ｌ ｒ ｒ ｐ ｒ ｄ，ｃ ｌ ｅ ｅ ｅ ｐ ｓ ｄ ｔ ｉ ｅ ｅ ｔ ｏ ｅ ｆ １ Ｍ 、５ ｔ ａ ｒ ｎ ｌ ｓ ｅｌ ｗｅ ｅ ｐ ｅ ａｅ ｅ ｓ ｅ ｌ ｗ ｒ ｘ ｏ ｅ ｏ ｄ ｆ ｒ ｎ ｓ ｓ ｏ ｓ ｆ ｄ Ｍ 、 ２ Ｍ 、 ５ １Ｍ 、 ｌ Ｏ ￣ ＤＥ ５ ０ｘ Ｏ ｐＭ ＨＰ ａｄ１ Ｍ、５ ｎ Ｍ 、２ ｘ 、５ ｘ 、 １ ０￣ ＭＥＨＰ ｆ ｒ ４ｈ ｏ ８ ｅ ｐ ｃ ｉｅｙ，ｔｅ ｐ ｏｉ ｒ ｔ ｎ ｒｔ ｆｃ ｌ ａ ｎ ｌｚ ｄ ｂ Ｃ 一 ５Ｉ Ｍ ０１ Ｍ ０ Ｍ ｏ ｒ ｈ ｒ ｓ ｅ ｔ ｌ ｈ ｒｌ ｅ ａｉ ａｅ ｏ ｅｌ ｗ ｓ ａ ａｙ ｅ ｙ Ｃ Ｋ ２ ４ ｖ ｆ ｏ ｓ
５１ ０ｘ Ｍ、１０￣ 作 用 细 胞 ２ ｈ及 ４ ｈ ０ｐ Ｍ） ４ ８ ，以 Ｃ Ｋ８ 法检 测 细 胞 增 殖 情 况。 结 果 ：Ｄ Ｈ Ｃ 一 Ｅ Ｐ作 用 卵 巢 颗 粒 细 胞 ２ ｈ 时， ４
人卵巢颗粒细胞随年龄增长衰老的相关研究
２主 要 试 剂 及 仪 器：使 用 ＲＮＡ提 取 试 剂 盒 （ＱＩＡＧＥＮ），ＯｌｉｇｏｄＴ（Ｔａｋａｒａ），ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）， ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）， ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｓｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ＳｙｂｅｒｇｒｅｅｎＩＭｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）。 应 用 ＰＣＲ 仪 （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒｇｒａｄｉｅｎｔ）和 ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ仪（ＢｉｏＲａｄ，ＩＱ５）。
３颗粒细胞收集方法：显微镜下从卵泡液中找 到卵冠洗干净 后
·２４０·
中国生育健康杂志 ２０２０年第 ３１卷第 ３期 ｈｔｔｐ：／／ｃｊｒｈ．ｂｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
－２０℃冷冻保存用于基因表达及端粒长度检测。用 透明质酸酶消化成单细胞，离心用 ＰＢＳ洗 ２次，然 后在培养皿中培养，根据各自浓度计算加到培养皿 中的细胞细胞悬液量，保证初始加入培养皿的细胞 数均为 １×１０６。１２ｈ贴壁后计数，培养 ３６ｈ后再次 计数。
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｈｕｍａｎｏｖａｒｉａｎｇｒａｎｕｌｏｓａｃｅｌｌｓａｇｉｎｇｏｂｖｉｏｕｓｌｙａｓａｇｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｒａｎｕｌｏｓａｃｅｌｌｓｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｐｉｃｋｉｎｇｕｐｏｏｃｙｔｅｓ．ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏ ｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｉｒｔ１，ａｎｄＴ／ＳＲａｔｉｏｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆｔｅｌｏｍｅｒｅａｎｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｓａｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｉｒｔ１ｏｆｏｖａｒｉａｎｇｒａｎｕｌｏｓａｃｅｌｌｓｗａｓｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅｔｅｌｏｍｅｒｅｌｅｎｇｔｈｄｉｄｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｓｈｏｒｔｅｎ，ａｓａｇｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ．Ｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆｇｒａｎｕｌｏｓａｃｅｌｌｓｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｈｉｇｈｔｉｌｌｔｈｅａｇｅｏｆ４５ｙｅａｒｓ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅｏｖａｒｉａｎｇｒａｎｕｌｏｓａｃｅｌｌｓｗｅｒｅｎｏｔａｇｉｎｇｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ａｌｔｈｏｕｇｈｔｈｅｅｇｇｓｗａｓ ａｇｉｎｇｏｂｖｉｏｕｓｌｙａｓａｇｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ．
干细胞研究中的卵巢组织的分离与培养技术研究
干细胞研究中的卵巢组织的分离与培养技术研究干细胞研究是当今科学界备受瞩目的领域之一。
干细胞可以通过培养分化成各种细胞类型，从而为疾病的治疗提供了新的希望。
在这个领域，卵巢组织的分离与培养技术也备受关注。
卵巢组织是由卵泡、颗粒细胞和卵母细胞等组成的复杂结构。
近年来，研究人员逐渐发现，卵巢组织中存在着一定数量的卵巢干细胞，这些细胞可以分化成卵泡和颗粒细胞，从而为不孕症等疾病的治疗提供了新的方向。
卵巢组织的分离和培养技术是卵巢干细胞研究的关键。
目前，主要有两种方法用于卵巢组织的分离和培养：手术取卵和体外培养。
手术取卵是一种传统的方法，其优点是可以直接获取完整的卵巢组织，缺点是手术创伤大，需要精细的操作技术和较高的技术水平。
体外培养则是一种新兴的方法，其优点是无需手术创伤，适用范围广，但是目前仍存在着一些技术难题。
手术取卵的方法主要有开腹式和腹腔镜式两种。
开腹式手术取卵是一种直接开腹取卵的方法，适用于卵巢组织病变或其他原因无法进行腹腔镜手术的患者，其缺点是手术创伤大，恢复时间长。
腹腔镜手术取卵则是一种通过腹腔镜直视下进行卵巢取卵的方法，手术创伤小、恢复时间短，但是需要高超的技术水平。
体外培养的方法主要有生物反应器和仿生反应器两种。
生物反应器是一种经典的培养方法，其优点是稳定可控、培养环境易调节，缺点是需要大量的培养基和供氧装置，耗费成本较高。
仿生反应器是一种新兴的培养方法，其优点是能够模拟体内环境，不仅可以有效地培养卵巢组织，还能够提供更为精确的信息，缺点是技术难度较大。
不同的卵巢组织分离和培养方法在不同的研究领域有着不同的应用。
例如，在卵巢干细胞研究中，手术取卵是较为常用的方法，因为它可以获取完整的卵巢组织，有利于卵巢干细胞的分离和培养。
而在生殖医学领域，体外培养逐渐成为了主流，因为它能够精准地控制环境，为人类生殖治疗提供更为便利的手段。
总之，卵巢组织的分离和培养技术是卵巢干细胞研究中的关键环节，其不断发展和进步，将为卵巢相关疾病的治疗和人类繁衍健康提供新的希望。
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CHINESE JOURNAL OF ANATOMY V ol.42 No.2 2019 解剖学杂志 2019年第42卷第2期人卵巢颗粒细胞分离培养的优化及生物学特性*许素铭1 王耀琴1 朱鹏飞1 李 宵2 王春芳2Δ 武学清1#（1 山西省儿童医院山西省妇幼保健院生殖医学中心，太原 030013；2 山西医科大学实验动物中心，实验动物与人类疾病动物模型山西省重点实验室，太原 030001）摘要 目的：建立原代人卵巢颗粒细胞（hGCs ）的分离培养方法，观察其生物学特性。
方法：取卵日，收集hGCs ，分为对照组（DMEM 培养基）和实验组（DMEM 培养基∶卵泡液=1∶1）进行培养。
比较2组hGCs 的生长状态和雌激素分泌情况。
利用RT-qPCR 检测Nanog 、Oct4、Sox2的表达，应用流式细胞术检测CD44、CD73、CD45的表达。
结果：hGCs 培养24 h 贴壁良好，细胞间伸出伪足。
对照组和实验组分别在培养14 d 和21 d 后出现凋亡。
实验组雌激素的分泌显著增加，第9天出现高峰，第21天显著下降。
培养第7天实验组Oct4和Nanog mRNA 表达显著增加。
培养7 d 后，CD44、CD73表达阳性， CD45表达阴性。
结论：该方法简单、有效，可获得大量hGCs 。
培养基中添加卵泡液有益于hGCs 的生长，增加培养天数。
同时hGCs 可分泌雌激素并具有一定的干细胞特性。
关键词 人卵巢颗粒细胞；细胞培养；细胞沉淀法；生物学特性；干细胞Culture technique optimization and biological characteristicsof human ovarian granulosa cells *Xu Suming 1， Wang Yaoqin 1， Zhu Pengfei 1， Li Xiao 2， Wang Chunfang 2Δ， Wu Xueqing 1#（1. Center of Reproductive Medicine ， Children's Hospital of Shanxi and Women Health Center of Shanxi ，Taiyuan 030013；2. Laboratory Animal Research Center of Shanxi Medical University ， Shanxi Key Laboratory of Animal and Animal Model of Human Diseases ， Taiyuan 030001，China ）Abstract Objective ： To establish the methods of isolating and culturing human ovarian granulosa cells (hGCs) and observe biological characteristics. Methods ： hGCs were harvested during oocyte retrieval. Then they were divided into control group (DMEM medium) and experimental group (DMEM medium ： follicular fluid=1∶1). The characteristic of hGCs and secretion of estrogen were observed. The expression levels of Nanog ， Oct4 and Sox2 were detected by RT-qPCR. CD44， CD73 and CD45 were measured via flow cytometry (FCM). Results ： The hGCs grew well in vitro after 24 h ， and cells were connected by pseudopodia. Apoptosis began in the cells of control group after 14 d ， while cells of experimental group began to degenerate until 21 d. Compared with control group ， the secretion of estrogen in the experimental group increased significantly. It reached the peak at 9 d and significantly declined at 21 d. The results from RT-qPCR indicated that the expression levels of Oct4 and Nanog of experimental group increased significantly at 7 d. FCM analysis showed that CD44 and CD73 were positive and CD45 was negative after 7 d in vitro culture. Conclusion ： This method is simple and effective to obtain a large number of hGCs. Compared with the culture medium ， adding follicular fluid is beneficial to the growth of hGCs ， and increase the culture time. Meanwhile ， hGCs can secrete estrogen and has certain stem cell characteristics.Key words human granulosa cell ；cell culture ；cell precipitation ；biological characteristic ； stem cell* 国家重点研发计划（2018YFC1002103）；山西省回国留学人员科研资助项目（2012-100）第1作者E-mail ：fengye416@△ 通信作者，E-mail ：wangchunfang1@ #共同通信作者，E-mail ：xueqingwu416@收稿日期：2018-11-05；修回日期：2019-01-09doi ： 10.3969/j.issn.1001-1633.2019.02.002·论 著·随着体外受精-胚胎移植技术的不断发展，提高卵子、胚胎质量及临床妊娠率一直是生殖医学领域研究的热点和难点，而颗粒细胞作为卵泡内重要的功能细胞，对卵母细胞生长，卵泡发育、成熟及微环境的维持起重要作用 [1-4]。
研究显示未成熟卵母细胞培养中添加颗粒细胞可通过减数分裂过程的恢复 [5]或促进EGF 样蛋白的表达 [6]促进卵母细胞成熟。
反之，颗粒细胞的凋亡常会引起卵母细胞的闭锁 [7]。
因此，研究中获得大量高质量的卵巢颗粒细胞是基础实验研究的首要条件。
目前文献中有较多关于人卵巢颗粒细胞分离方法的报道[7-10]，然而获得的细胞在数量、纯度及培养时间等方面却不尽人意。
故本研究在体外简化操作、提高效率的基础上建立一种优化的人原代卵巢颗粒细胞分离和培养方法，将为研究卵巢颗粒细胞对卵母细胞成熟机制、多囊卵巢综合症发病机制、保护女性生殖功能等研究提供有力模型。
1 材料和方法1.1 研究对象卵泡液及卵丘颗粒细胞均来源于山西省妇幼保健院生殖医学中心接受体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer， IVF-ET）或卵胞浆单精子显微注射（oocyte intracellular single sperm injection， ICSI）治疗的患者。
纳入标准：（1）年龄25 ~ 30岁；（2）月经规律；（3）因输卵管因素或男方因素导致不孕；（4）基础激素水平正常；（5）取卵后获得卵母细胞数>4个者；（6）患者体质量指数在18 ~ 24 kg/m2；（7）近3个月未服用任何激素类药物。
排除标准：具有卵巢肿瘤、排卵障碍如多囊卵巢综合症（PCOS）、子宫内膜异位症及其他内分泌疾病的患者；或既往促排卵周期中应用促排卵药物后卵巢反应不良者（卵泡数≤3个）。
本研究经伦理委员会批准并获得患者本人知情同意。
1.2 主要试剂1×PBS（北京全式金公司）；胰蛋白酶（美国GIBCO公司）；透明质酸酶（美国 SAGE IVF，Inc公司）；DMEM/F12培养基、胎牛血清（美国GIBCO公司）；小鼠抗人CD44-FITC、CD45-PE、CD73-PE单克隆抗体（美国BD Parmingen公司）；RNA纯化试剂盒-Mini（50）（德国QIAGEN 公司）；反转录试剂盒（AT311-02）、PCR扩增试剂盒TransStart Tip Green qPCR SuperMix（AQ141-02，北京全式金生物技术有限公司）。
1.3 实验分组取卵日，在彩色多普勒超声引导下行经阴道穿刺取卵术，显微镜下回收卵母细胞后，收集卵泡液用于原代培养，并将其一分为二，分为对照组（DMEM培养基）和实验组（DMEM培养基∶卵泡液=1∶1）。
1.4 人卵巢黄素化颗粒细胞的分离与纯化将收集的卵丘颗粒细胞用透明质酸酶消化2 min，待消化完成后置于15 ml离心管中，用DMEM完全培养基（10%胎牛血清+100 U/ml青霉素+100 U/ml链霉素）终止消化。
同时将获得的卵泡液500 r/min低速离心5 min，收集上清。
将卵丘颗粒细胞与卵泡液1 500 r/min离心5 min，取出离心管，弃上清，同时收集部分卵泡液上清用于后续培养。
分别加入DMEM完全培养基或混合培养基（DMEM培养基∶卵泡液 = 1∶1）重悬细胞即为对照组和实验组，置于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养。
24 h后PBS缓冲液洗涤2次，分别添加DMEM培养基和混合培养基进行培养，以后2 d换1次液，倒置显微镜下观察细胞生长情况。
分别在培养7、14 d和21 d时，在高倍镜下（400×）随机选取5个视野并计数，进行统计学分析。
1.5 培养基上清雌激素浓度检测不同培养时间收集培养基上清，将标本送至检验科，使用全自动免疫分析仪AIA-2000 ST进行雌激素水平检测。