胰腺干细胞及其分离培养

胰腺干细胞及其分离培养

随着临床同种胰岛移植治疗糖尿病在近年取得的突破性进展，对胰岛移植治疗的需求日益增多，而供者的严重短缺制约了同种异体胰岛移植的广泛开展。解决供者短缺的两条可能的途经之一是利用异种供者如猪的组织或器官，但目前仍有如前所述的诸多总问题尚未解决，近年内恐难在临床应用。另一条解决供者短缺的有效途经则可能是在体外大量培养可用于移植的细胞和组织。

近20年来，人们注意到胰腺的某些肿瘤细胞具有永生性，即在一定条件下可以不断复制、增殖和分化。因而有研究试图在体外培养并改造这些细胞，使之可在体外大量增殖和培养传代形成一定的细胞系。然而，由于对这些细胞内在的增殖、分化调控机制的认识尚不够深入，因而这类细胞系有的在植入动物体内后难以调控其增殖及分化，可能形成肿瘤，而有些细胞系则在培养传代过程中逐渐失去了它们在正常生理条件下应有的如合成、分泌胰岛素等功能。

胰腺在其胚胎发育过程中，胚胎胰腺上皮细胞增殖继之分化形成胰腺内的三种类型的细胞：内分泌细胞、腺泡细胞和导管上皮细胞[9]。

在人和啮齿类动物实验中已证实这些细胞的共同祖细胞（progenitor）具有导管上皮细胞的表型，即角朊素细胞19（Cytokeratin-19，CK-19）或角朊细胞素20（Cytokeratin-20，CK-20）[10，11]。近10年来，可以通过在体外培养外分泌细胞，从而获得成人胰腺内具有导管上皮表型且有增殖潜能的细胞[12，13]。

Langerhans胰岛有4种细胞组成，即可合成激素肽的细胞：1、产生胰岛素的β细胞；2、产生胰高血糖素的α细胞；3、产生生长抑素的δ细胞；4、产生胰多肽的PP细胞。它们在胰岛内有一定的立体位置和次序，与神经细胞紧邻。

胰腺干细胞存在于胚胎及成年胰腺内，尽管胰腺和中枢神经系统具有不同的起源和功能，但控制这两个器官发育的机理都非常相似[14-16]。

胰岛素促进因子（insulin promoter factor l , IPF-1）亦称（pancreas duodend homeobox 1 , PDX-1 ）是一种主要局限于成年胰腺已分化的β细胞内的转录因子。胰腺再生时，正处于增殖状态的导管上皮细胞也重新表达这一转录因子。因此IPF-1被认为是重新获得多能分化潜能的胰腺干细胞的标志[17]。国内外已有数个研究组报道成功地分离和在体外培养了表达IPF-1的人胰腺导管上皮细胞，这些细胞具有分化为胰岛细胞的潜能，因而被认为是胰腺干细胞（pancreatic stem cell）

[18-20]。

（二）胰腺干细胞的分离、培养

由于胰腺干细胞主要来源于胰腺导管上皮及少量来源于胰岛，因而成功地分离胰腺导管上皮细胞就可获得大量的具有分化潜能的干细胞。但干细胞与其它细胞相比，在培养方面有其特殊性，故有必要在此予以描述。

胰腺干细胞的分离：胰腺导管上皮是具有干细胞潜能的一类细胞，其在胰腺中所占比例甚少。目前成人、动物胰腺导管上皮细胞的分离多采用胶原酶消化法[18,20]。具体方法为：按供者器官切取原则和技术获取胰腺后，于导管内注入胶原酶（普通胶原酶或纯化的Liberase ），在一定温度下（30℃~37℃）消化，当观察到较多游离且完整的胰岛细胞团时，中止消化，低温清洗3次。消化后胰岛已从外分泌组织中释放出来，但仍与外分泌组织混悬在一起。由于内、外分泌组织的密度不同，可用密度梯度离心法将它们纯化。如消化的胰腺组织较多，可用Euro Ficoll或Lymphaprep 或Ficoll液在COBE 2991细胞分离机中进行连续密度梯度离心，亦可对少量组织采用非连续密度梯度离心。离心后，绝大多数胰岛即与外分泌组织（腺泡细胞和导管上皮细胞）分开而得到纯化，胰岛可用于移植等方面的研究，而外分泌组织则需进一步处理以便达到获取导管上皮细胞的目的。

另一种获取导管上皮细胞的方法是将胰腺的大导管以外科方法剪取，然后再将大导管切成小块后以胶原酶消化，在显微镜下将消化后的导管上皮细胞从导管上皮和其他细胞的混悬液中挑出。此法无法获得大量的小导管上皮细胞，仅适用于需少量细胞的研究工作，此外，尚有用机械的方法将导管上皮从导管上刮下后收集，此方法难度大，收获量小，已较少有人应用。

胰腺干细胞的培养：消化后的胰腺细胞经密度梯度离心后，胰岛细胞即被从混悬液中分出，而外分泌细胞中则绝大多数（＞99%）为腺泡细胞，少量为导管上皮细胞。根据这2种细胞的不同生物学特性，即导管上皮细胞在6～12小时即可贴壁生长而腺泡细胞不具备此特性，在培养的前期置换培养液时，几乎可将所有的腺泡细胞在换液时丢弃，仅留有少量的贴壁细胞即导管上皮细胞生长[20-21]。一般来说，培养早期（前3～7天）可使用未经处理的T-75培养瓶，CMRL1066培养液，37℃，5% CO2条件下培养，其中葡萄糖浓度为5.6 mmol/L，加10%胎牛血清。贴壁生长的细胞自12～24小时起即开始增殖、复制，从单个或少量几

个细胞逐渐变为小细胞集落。由于干细胞可在无血清培养液中生长和增殖，而其他细胞（除成纤维细胞外）不易生长，故在培养3～7天后即换为不含血清的DMEM/F12（含8mmol/L葡萄糖）培养液，其中加入一定量的胰岛素、转铁蛋白和硒、青霉素、链霉素、牛血清白蛋白、尼克酰胺和角朊细胞生长因子（keratinocyte growth factor, KGF）等。笔者等从实验中发现，早期即培养3天后即换为不含血清的DMEM/F12培养液，更有利于导管上皮细胞即干细胞的生长和增殖，而早期加入微量霍乱毒素于培养液中则可有效的抑制成纤维细胞的生长，消除成纤维细胞的污染。加入少量抗真菌的二性霉素B可比较有效的预防真菌的污染。有文献报道使用鼠基底膜提取物制成的胶状物（Matrigel）具有促进胰腺干细胞生长的作用。但笔者在实践中体会到Matrigel价格昂贵，干细胞在其中生长后很难将细胞完整取出，而使用胰酶消化时，很容易损伤或溶解干细胞，故建议不使用Matrigel为宜。在此后的培养阶段，应较频繁地添加KGF，以促进干细胞的生长和转分化。一般经培养5～7天后，细胞集落增大，互相开始连接成片，大片细胞在光镜下的形状如铺路的鹅卵石一般。在此基础上细胞可形成一单层细胞，几乎覆盖培养瓶底，此时亦开始出现具有三维结构的细胞团，在相差显微镜下呈山嵴或山峰样隆起，这种三维细胞团结构随培养时间的延长逐渐增大，当直径达到100μm以上时，轻摇培养瓶则可使胰岛细胞团悬于培养液中，双硫腙染色呈红色。Bonner-Weir报告成人全胰腺的干细胞经过5~7周培养后，可平均收获32000新生的胰岛细胞团。而笔者等人报告经27天培养后平均每克胰腺组织可收获760个胰岛[20-21]。

在胰腺干细胞培养过程中，不同的外部条件可以促进干细胞的增殖与分化，它们包括：生长激素，如胰岛素样生长因子（insulin－like growth factor，IGF）；其他激素如胃泌素，胰高血糖素样多肽（GLP-1）等；生长因子和细胞因子如转型生长因子（transforming growth factor ,TGF-α），表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF），β细胞素（Betacellulin），白介素1β（interleukin-1β, IL-1β），肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF），角朊细胞生长因子（keratinocyte growth factor ,KGF）等；营养成份如葡萄糖；细胞外基质如上皮细胞粘附分子（Ep-CAM），胶原1和胶原4等；其它物质如尼克酰胺，丁酸钠等也有促进干细胞增殖和分化的作用[22]。

目前仍未找到培养干细胞的最佳条件。成年胰腺干细胞在体外培养后所获的胰岛因数量及其胰岛素含量尚不足以用于临床试验。部分动物实验表明，小鼠胰腺干细胞在体外培养后获得的胰岛植入同种糖尿病小鼠体内，可纠正糖尿病状态，基本恢复正常的糖代谢[23-24]。

三、胰腺干细胞及其在体外培养所生成胰岛的鉴定

胰腺干细胞或胰岛前体细胞在体外培养过程中需进行可靠的鉴定。除形态学观察外，还应对这些细胞的抗原标志物进行探测。自20世纪90年代以来，通过大量的实验研究，人们已发现了一些用于检测胰腺干细胞的物质，主要分为两大类：一类为转录因子，它们在胰岛素基因的表达等方面具有重要作用；另一类为其他蛋白类物质。

在转录因子中，最重要的一个转录因子是IPF-1（Insulin-promoter-factor 1），亦称PDX-1（pancreas duodend homeobox 1）。它不仅在胰岛素基因表达的调节方面具有重要作用，也是成熟的胰腺细胞分化时所必需的物质。IPF-1缺失的小鼠则胰腺不发育[25-26]。此外，在胰腺发育分化过程中先后有Hnf 6、H1x 69和Hnf 3β等的表达。另一组转录因子在胰岛的前体细胞中有表达，它们包括Isl-1, Pax 4、Pax 6 Nkx 2.2、Beta 2/Neuro D 和Ngn 3等。随着胰腺干细胞研究的不断深入更多与干细胞的分化有关的转录因子会被发现。

其他蛋白类物质中，胰腺激素YY，某些酶类如酪氨酸羟化酶，胰腺多肽等亦在胰岛发育成熟过程中有较高表达。在已分化的β细胞中IPF-1可诱导胰岛素基因和Glut-2的表达，角朊细胞素-20，（Cytokeratin-20，CK-20）, 角朊细胞素-19（Cytokeratin-19 或CK-19）, Vimentin，Bcl-2，Nestin 等亦在胰腺干细胞增殖分化中起重要作用。

上述转录因子及其他蛋白类物质中，最常被用于成年胰腺干细胞鉴定的物质是IPF-1和CK-20，CK-19。近年来Nestin亦常见存在于啮齿类动物胰腺导管上皮和胰岛内。

IPF-1和CK-20，CK-19可用免疫组化方法测得，亦可用分子生物学方法检测源于胰腺干细胞的胰岛细胞内IPF-1及胰岛素的mRNA表达情况，以判断培养细胞是否为胰腺干细胞。笔者在实验中发现，早在成人胰腺细胞培养第一天，贴壁生长的导管上皮细胞即开始表达IPF-1，随着培养进程，表达逐渐增强。

四、胰腺干细胞临床应用前景

近年来，对利用干细胞治疗不同疾病的可能性的研究引起了广泛重视。属多能干细胞的表皮干细胞、造血干细胞、胰腺干细胞及胰岛、神经元干细胞等均具有自身更新和分化为多种细胞系的可能。人们已成功地从胎儿及成年动物或人分离出这些干细胞并在体外培养，其中皮肤的上皮、造血干细胞已用于临床治疗，显示了干细胞临床应用的广阔前景。

体外培养的、源于干细胞的胰岛亦可能在不远的将来替代同种供者的胰岛，用于治疗糖尿病。世界上已有几个研究小组对此进行深入的研究，其中包括美国波斯顿麻省总医院的Bonner-Weir及其同事们，西安第四军医大学宋振顺及其同事们已在体外成功地将成人胰腺导管上皮组织扩增并转分化为胰岛样细胞团。尽管这些体外培养出的胰岛表达胰岛素、胰高血糖素、胰多肽及生长抑素、CK19、泛CK和IPF-1，并且对葡萄糖刺激有反应（释放胰岛素），但胰岛素阳性细胞在胰岛中分布较杂乱，有些细胞IPF-1阳性但胰岛素染色阴性，部分胰岛素阳性细胞内胰岛素含量很低。因此，这些研究结果表明体外培养的胰岛尚不够成熟，如何在体外从干细胞获得具有正常解剖和生理功能的胰岛仍有待深入的研究。

尽管健康成人和糖尿病人胰腺内都有干细胞，但怎样在体外刺激这些具有转分化潜能的细胞是其生成具有正常生理功能的胰岛是一项重要研究课题。一旦此问题得到圆满的解决，人们将可利用这种治疗潜能治疗糖尿病人。从目前情况看，虽然可在体外将这些干细胞扩增和分化，但我们对此基本过程的了解尚不深入，对全过程还不能很好控制。对不同阶段细胞表达不同基因的观察，将有助于获得如何刺激这些细胞成熟的信息，以便使用合适的刺激因子促进干细胞向成熟的终末阶段的胰岛转化。也许不成熟的胰岛在体内环境下可血管化，从而增殖、分化成更多成熟的胰岛。上述理论上的推测需要实验证明。

何时能将同种供者的干细胞起源的胰岛用于治疗糖尿病是人们要问的一个问题，应当说，目前已具备了这一条件。利用自体胰岛不论在伦理上及免疫反应上都明显优于同种供者或异种供者。因而，如果能将糖尿病人的胰腺干细胞以细针穿刺法从胰腺中取出，再在体外培养成胰岛后回植给该病人，将可造福大量的糖尿病人。也许这些自体胰岛会遭到自身免疫系统的攻击，但如果能在植入这些胰岛前能将其基因作适当的改造，人们就可能获得具有耐受免疫的胰岛。真正地将此技

术用于临床治疗糖尿病的方法，仍要克服不少障碍，但在不久的将来，人们一定能达到这一目标。