胰腺干细胞及其分离培养
第七章干细胞与组织工程
中的多能干细胞。
二、胚胎干细胞（Embryonic Stem cell, ES细胞）
（一）定义：当受精卵分裂发 育成囊胚时，内层细胞团的细 胞即为胚胎干细胞。 ES细胞的研究可追溯到上世纪 五十年代，由于畸胎瘤干细胞 （EC细胞）的发现开始了ES 细胞的生物学研究历程。
胚胎干细胞和成体干细胞的比较
霍金批评欧美人士试图禁止人类胚胎 干细胞研究
中国人对胚胎干细胞研究的看法 比较一致
• 大多数中国人能够接受此项研究,主要是 受儒家思想的影响。儒家很早以前就已 经指出，人生出来的时候，人才开始。 按照大多数中国人的看法，胚胎还不是 人，不涉及人权问题。
伦理冲突
• ES研究也引发了当前最为激烈而敏感的伦 理之争。主要围绕如何看待胚胎。ES主要 有三个来:
• （1）（自然和人工）流产的胚胎； • （2）辅助生殖剩余的胚胎； • （3）通过体细胞核转移术得到的胚胎。
• 不管哪一个来源，提取ES必定会损毁胚胎。 于是，胚胎是不是生命，是不是人，研究 ES是不是“毁灭生命”、“杀人”，很自 然地成为争论的焦点。
新进展
※ 1999年12月，美国《科学》杂志公布了当年世界科 学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗 资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。 ※ 2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们 首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎 干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。
胰腺干细胞治疗糖尿病鼠的实验研究
胰腺干细胞治疗糖尿病鼠的实验研究摘要：本文以胰腺干细胞为试验材料，对细胞的表达特征、生长特性、体内外分化能力进行了较为系统的鉴定，以进一步完善其生物学特性的检测，同时将其体外定向分化为胰岛样细胞团并植入糖尿病大鼠模型体内，观察其能否改善糖尿病症状，旨在为糖尿病的临床治疗研究提供一株背景清楚的种子细胞。
关键词：胰腺干细胞糖尿病鼠实验研究【中图分类号】r4 【文献标识码】a 【文章编号】1008-1879（2012）12-0028-02胰腺干细胞具有特定的分化潜能，在医学和生物学上能够表现出全能性、多能性。
现阶段，胰腺干细胞的研究虽尚处于早期阶段，但是它却以迅猛的速度发展着，经过多年的分离培养与研究，胰腺干细胞已成为一种有广阔前景的实验及治疗源细胞。
糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上主要表现为高血糖。
1 资料与方法在实验中分别选取三组生理状况相同的大鼠，标为a、b和c三组。
a为正常对照组、b为患糖尿病组、c为干预对照组，每组九只大鼠。
实验分为3个阶段，分别于造模后的第3、7、14、21天时（摸索中四个时间是血糖变化的四个时相），采用光化学血糖监测仪，每组随机抽取三只大鼠，采鼠尾静脉取血、测血糖、c-肽水平测定。
1.1 研究方法。
胰岛干细胞的转分化研究，在现在的有关胰腺干细胞治疗糖尿病的医学研究中，医学研究人员通过一些特殊的分化（转分化）就可以很简单的得到降低血糖的有关细胞的分泌细胞（胰岛素分泌细胞），该类特殊的分化转具体指的是两种毫无关联的组织细胞在特定的条件下经过特定的技术进行由一种组织细胞到另一种组织细胞分化的过程。
最开始的研究表明，成体的胰腺干细胞的分化的能力是最差的，然而就现在的研究看来，胰腺干细胞的分化具有扩散性。
一些医学研究者的研究实验中，首先从大鼠的胰腺中分离出胰岛分泌细胞，接着在体外进行长时间的细胞培养，在培养的过程中增加适量的化学剂就能转分化出中间源细胞，这样就可以分化成为胰岛b细胞。
细胞培养历年名解简答
1.cell line（细胞系）：原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系。
2.Contact inhibition（接触抑制）：当一个贴壁生长的正常细胞与另一个细胞相互接触时，便停止了分裂增殖，相互虽然紧密接触，但不形成交叉重叠生长。
3.In vitro transformation （体外转化）：细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖或其他特性的可遗传的变化，但不一定具有致瘤性。
4.Cell fusion（细胞融合）：体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使不同种的体细胞融合产生杂交细胞的过程。
5.Passage（Subculture，传代或传代培养）：将细胞从一个培养瓶转移到更多培养瓶的过程。
6.Saturation density（饱和密度）：在特定条件下，培养容器能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止增殖。
在贴壁生长的细胞以每平方厘米的细胞数表示，而悬浮生长的细胞则以每立方厘米的细胞数表示。
7.Suspension culture（悬浮培养）：细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中的一种培养方法。
8.Transfection （转染）：用生物学的、物理的或化学的方法将目的基因转移到培养细胞内的实验方法。
9.饲细胞（Feeder cells）：也称滋养细胞，通常成纤维细胞或其他细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力，但仍能存活并有代谢活动。
可作为支持物，然后接种上其他细胞，饲细胞的代谢产物利于其他细胞生长，用于某些难培养细胞的培养。
10. Apoptosis（细胞凋亡）：是指细胞死亡程序的开启而导致细胞自杀的过程，因此也常称为程序性细胞死亡。
细胞凋亡与机体正常发育、形态形成以及多余细胞的清除等生理过程密切相关，所以被认为是一种积极的生理性死亡。
11.裸鼠（nude mouse)是20世纪60年代作为无毛变种被发现，后来查明该类小鼠先天性胸腺缺陷，此性状由隐性遗传基因“nu”传递。
【CN109749986A】一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910190210.4(22)申请日 2019.03.13(71)申请人 武汉大学地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山(72)发明人 蒋卫 檀梦天 (74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 42222代理人 彭劲松(51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)C12N 5/0735(2010.01)C12N 5/10(2006.01)(54)发明名称一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法(57)摘要本发明提供了一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的方法。
在由人多能干细胞来源的内胚层细胞向胰腺谱系细胞特化过程中，通过阶段性加入WNT信号通路抑制剂可以提高人多能干细胞向胰腺前体细胞分化效率。
本发明在提高胰腺前体细胞分化效率后，进而提高成熟的胰岛β细胞分化效率。
该方法适用于不同细胞系的胰腺分化，获得大量胰岛β细胞，为糖尿病细胞治疗、药物筛选、疾病模型等提供有力的支持，具有良好的应用前景。
权利要求书2页 说明书13页序列表2页 附图6页CN 109749986 A 2019.05.14C N 109749986A权 利 要 求 书1/2页CN 109749986 A1.一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：所述的方法步骤为：1)人多能干细胞分化为定型内胚层细胞：a.配制定型内胚层阶段培养基1，将人多能干细胞使用所述培养基于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养1天；b.配制定型内胚层阶段培养基2，将经过上述步骤a培养后的细胞更换为定型内胚层阶段培养基2，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养3天，每天更换培养基；所述定型内胚层阶段培养基1的组成为：以IMDM培养基和F12培养基以1:1比例混合做基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.2％牛血清白蛋白(BSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)、50ng/ml Wnt3a蛋白，所述浓度均为终浓度；所述定型内胚层阶段培养基2的组成为：以IMDM培养基和F12培养基以1:1比例混合做基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.2％牛血清白蛋白(BSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)，所述浓度均为终浓度；2)诱导定型内胚层细胞向胰腺前体细胞分化：配制胰腺前体细胞培养基，将经过步骤1)培养后的细胞，更换为胰腺前体细胞培养基，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；所述胰腺前体细胞培养基的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：0.5％牛血清白蛋白(BSA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、50ng/ml成纤维细胞生长因子(KGF)、0.5μM SANT1(抑制剂靶点为smo)、100nM维甲酸(TTNPB)、500nM佛波醇12，13-二丁酸酯(PDBu)、2μM ALK抑制剂(K02288)、WNT信号通路抑制剂，所述浓度均为终浓度；3)由胰腺前体细胞进一步分化获得胰岛β细胞：a.配制胰岛β细胞培养基1，将经过步骤2)培养后的细胞，更换为胰岛β细胞培养基1，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；b.配制胰岛β细胞培养基2，将经过上述步骤a胰岛β细胞培养基1培养后的细胞，更换为胰岛β细胞培养基2，于37摄氏度二氧化碳培养箱内培养5天，每天更换培养基；所述胰岛β细胞培养基1的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：20m M的葡萄糖、2％牛血清白蛋白(B SA)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.05mM维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、2μM ALK抑制剂(K02288)、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM YO-01027(Notch信号通路抑制剂)、10μM 硫酸锌，所述浓度均为终浓度；所述胰岛β细胞培养基2的组成为：以MCDB131培养基为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：20m M的葡萄糖、2％牛血清白蛋白(B S A)、1.5g/L碳酸氢钠、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.05mM维生素C、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM Repsox(ALK5抑制剂)、10μM维生素E、10μg/ml肝素钠、2μM R428(Axl 抑制剂)、10μM硫酸锌、10mM N-乙酰-L-半胱氨酸(N-cys)，所述浓度均为终浓度。
动物细胞工程
动物细胞工程第一章动物细胞工程概论一、动物细胞工程的概念1.动物细胞工程的定义动物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的技术方法对动物细胞进行各种操作并使其在体外生长、增殖、分化以生产有用产品或引向成体化（产生新型生物个体）的技术体系，是生物技术（生物工程）的重要组成部分。
狭义细胞工程指对细胞个体进行的各种操作，广义的细胞工程包括对细胞、组织、器官所进行的各种操作。
2.动物细胞工程研究的主要内容以狭义细胞工程为主，兼顾组织、器官工程等内容的研究。
(1)狭义细胞工程：研究体外分离、培养、增殖、分化动物细胞的条件以及保存、操作及利用动物细胞的工艺技术体系。
(2)组织工程：研究体外培养、增殖动物组织的条件以及保存、操作及利用动物组织的工艺技术体系。
(3)器官工程：研究体外培养、增殖器官的条件以及保存、操作及利用动物器官的工艺技术体系。
(4)动物胚胎工程：研究动物胚胎生产、保存、操作及移植的工艺技术体系。
3.动物细胞工程研究的意义(1)是动物繁殖的重要技术手段加快动物繁殖速度：A.体外受精生产胚胎 B.胚胎移植生产动物(2)是人类辅助生殖技术的重要组成部分体外受精—胚胎移植技术，可以克服雄性不育和雌性不孕；(3)是动物遗传育种的重要技术手段对精子或卵子进行遗传操作，或利用细胞融合、胚胎嵌合技术可以使若干个动物性状进行有机组合，产生新的生物个体；(4)生产药物直接培养细胞或组织，从细胞或组织代谢物中直接获得药物;对细胞进行遗传操作，生产转基因动物，利用转基因动物生产药物（生物反应器）；(5)保存珍惜动物资源由于动物克隆技术的成功，保存细胞、组织、胚胎，就意味着保存一个生命个体，保存细胞、组织、胚胎，就意味着保存一个生物种群(6)提供人类器官移植的材料人类器官移植发展很快，目前可以进行心脏、肝、肾脏移植，可以进行皮肤、角膜、骨髓细胞移植。
三、动物细胞工程讲授的主要内容1.动物细胞、组织培养2.动物细胞融合3.动物细胞重组4.向细胞内引入高分子物质5.动物细胞冷冻保存6.动物胚胎工程四、动物细胞工程实验（实习）内容1.实验仪器设备的识别与使用2.动物细胞培养用液的制备3.动物胎儿成纤维细胞分离与培养4.动物细胞常规检查和生物学检测5.培养细胞的冻存与复苏五、动物细胞工程研究取得的重要进展1.精液采集、精液冷冻与人工授精技术的成熟和发展，为充分发挥利用雄性动物生殖潜力奠定了基础；2.雌性动物卵母细胞体外成熟培养技术的成功，使人们在体外完成动物生殖过程成为可能；3.体外受精与胚胎移植技术的成功，产生了试管婴儿，试管牛，试管猪，试管山羊，试管兔；4.细胞核移植技术的成功，使人们克隆高等哺乳动物的梦想得以实现体细胞核移植、胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植技术的成功，为克隆动物和转基因动物生产提供了技术支撑；5.胚胎干细胞与组织干细胞成功分离、体外扩增与诱导分化研究的成功，为人类医学发展提供了宝贵的材料；胚胎干细胞，胰腺干细胞，神经干细胞，骨髓干细胞，皮肤干细胞，角膜干细胞6.转基因细胞（细胞转染基因）技术的成功，为转基因动物的生产创造了条件；7.胚胎嵌合技术一种或两种动物胚胎共同生长发育形成一个生物个体的技术，即在一个生物体内，含有来源于两个不同胚胎的细胞和组织；8.细胞融合技术将两种或两种以上的细胞融合，形成一个具有新性状的细胞，这种技术称为细胞融合技术。
猪胰腺干细胞分离与培养
猪胰腺干细胞分离与培养猪腺干细胞分培细胰离与王细～细忠英～细海～细～细春细婷;西北细林科技大家干细胞生物技细中心细西分中心～细西细凌学国712100, 摘要,【目的】探细一细细细的腺干细胞的分方法胰离,以便细糖尿病的细胞治细究提供富的细研丰【方法】采用细消化法分细得细胞～利用细含有胰离 5%的血的清 RPMI 1640 培细基培细细胞～低细度的细胞大量死亡漂浮～只留下少细壁的小细细胞数。
而后血细度提高到将清 15%以上细细培细;采用免疫细细得的细胞是否具有腺干细胞特征予以细细胰～细定了细胞的生细曲细并。
【细果】在血细度提高后每清胞能快速增殖形成一克隆～细细细细增殖后的细胞可以细细细代～目前已细至并个 60 代。
细免疫细化细表达 PDX-1、GLUT-2、vimentin 等腺干细胞的细志胰;细胞也表达Glucagon、insulin、somatostatin、pol等胰腺内分泌细胞的细志.【细细】通细本方法细得的细胞细细细定确细胰腺干细胞,在体外可自细分化分泌部内 4 细主要细胞。
细细细,胎猪～细～腺干细胞～糖尿病胰胰Isolation and Culture of Porcine Fetus Islet Stem CellWANG Yun, DOU Zhong-ying, QIAO Hai, ZHAO Ting, YANG Chun-rong(Shaanxi Province Branch Center of National Stem Cell Engineering Technology Center, Northwest Agricultural aUniversity, Yangling 712100, Shaanxi)Abstract:【Objective】To find an easy method for islet stem cell isolation.【Method】Cells derived fromporcinhave been cultured in RPMI 1640 with only 5% serum. This method made most of those cells die. Only a few lsurvived. These cells proliferated quickly when medium was changed to RPMI 1640 with 15% serum and could foIslet stem cell’s marker was noticed and detected by immunochemical method.【Result】Cells possess strongproliferawere sub cultured over 60 passages till now. It expressed islet stem cell’s marker such as PDX-1, GLUT-2, and vimen expressed insulin, Glucagon, somatostatin and polypeptide.【Conclusion】Cells derived by this method were determincells. It can differentiate into islet endocrine cell in vitro. This study has provided a reference for isolation and expansicell. Also, it has provided materials for diabetes therapy.Key words: Porcine fetus; Islet; Islet stem cell; Diabetes成熟～细细胞移植已成细治愈糖尿病胰[2]0引言法。
从胰岛移植到胰岛干细胞移植
从胰岛移植到胰岛干细胞移植姚 磊(哈尔滨医科大学第二临床医学院普外四科,黑龙江哈尔滨150086)关键词:胰岛移植;胰岛干细胞移植学科分类代码:32012765 中图分类号:R62219 文献标识码:A 文章编号:1004-5775(2008)04-0266-04 糖尿病是由多种原因引起的胰岛β细胞功能减退或衰竭,导致胰岛素绝对或相对不足,机体出现糖代谢紊乱,进而造成全身多器官损害的一种疾病。
其中,I型糖尿病患者终生需要依赖胰岛素治疗,给患者的生活带来极大的不便。
借助于分子生物学技术,利用基因工程的方法,人们现在已经可以为糖尿病患者提供十分优质的胰岛素及其类似物,并在胰岛素输注技术上也有了全新的改观,从而提高了糖尿病治疗的顺应性,但糖尿病学家在胰岛移植这一研究领域的艰辛探索并未停止过。
从最初的胰腺移植到以后的胰岛移植;从同种异体胰岛移植到异种胰岛移植;从免疫特许部位胰岛移植到微囊化胰岛移植;从胰岛的分离、纯化到冷冻保存;从转基因克隆细胞到胰岛干细胞的诱导及移植,不仅反映了人们在这一领域的认识轨迹,同时也反映了这一技术内在的发展规律。
1 胰岛的制备和培养自从1967年Lacy等,从胰腺分离出胰岛并体外培养成功后,胰岛分离纯化技术不断改善〔1〕。
111 常规分离培养法常规消毒后,无菌条件下取出胰腺,置于冷的无菌的Hanks液中漂洗,除去包膜、血管、脂肪组织、淋巴结等胰外组织,将胰腺剪成110mm3的小块置于RP MI-1640培养液(20%胎牛血清与庆大霉素50μg/m L)中,pH约712,在37℃恒温, 95%氧气、5%C O2的细胞培养孵箱内培养,隔日调换培养液,培养1～2周。
但用此方法分离出的胰岛纯度及质量不高。
112 胶原酶消化方法无菌条件下除去胰外组织,Hanks液冲洗,剪成015～110mm3大小,用新配制的胶原酶消化,再用Ficoll液密度梯度离心,使其与外分泌部分离〔2〕。
自1984年G ray及1985年Scharp相继介绍先从胰管内注入高浓度胶原酶,经短期培养后,用尼龙筛过滤或行Ficoll密度梯度离心,可获得较大数量的纯化胰岛,每个成人胰腺能分离出810～20万个胰岛。
诱导胰腺干细胞再生胰岛治疗糖尿病的研究
对患 者 造成 的损 伤较 大 ，该 方 法 主 要 用 于需 要 联 合 移植 肾脏或其 他 脏 器 的 工型 糖 尿病 患 者 ．又 因为 缺 乏完 全合 适 的供 体 ，胰 腺 器 官移 植 的 临 床应 用 受 到
性糖 尿病 并发 症 得到 缓 解［ ，移 植 ３年存 活 率 达 ２ 。 到 ７ 一８ ，与 其 他 器 官 移 植 成 活 率 基 本 相 Ｏ ０
似 ．但是 ， 由于 剖腹 手术 和长 期使 用 免 疫抑 制 剂
岛 ，将 诱导 胰 岛 细 胞 团移 植 在 ＮＯ 成 年 小 鼠 肾囊 Ｄ 区 ，可 降低 ＮＯ 小 鼠血糖 ，抗 糖 尿 病［ ． 同年 ， Ｄ ５ ］
前 ，在世 界范 围 内 ，分 离 克 隆胰 腺 干细 胞 并将 其 定 向诱 导分 化为 功能 性 胰 岛 移植 治 疗糖 尿 病 的研 究 已
成为 细胞 组织 工程 研究 的一 大热 点 。． ¨ 。
１ 胰腺和胰岛移植治疗糖 尿病的历史与现状
１ １ 胰腺 器 官移植 ．
１６ ９ ７年 ，Ｋｅ ｙ等成 功 地 将 同源 异 体 胰 腺 器 官 ｌ ｌ 移植 给糖 尿病 患 者． 至 ２ ０ ０ １年 ，全 世界 约 有 １ ０ ０ ５ ０ 例糖 尿病 患者 进行 了胰 腺 器官 移 植口 ¨．移 植后 ，糖 尿病 患 者恢 复 了血糖 调 控 能 力 ，存 活 时 间 延 长 ，慢
＊＊ Ｅ— ｉ：ｘａ ｍ ｅ０ ２ ｙ ｈ ｏ ｃ ｒ． ａ ｍａｌ ｉｏ ｉ８１ ＠ ａ ｏ ． ｏ ｃ ｎ
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胰腺干细胞及其分离培养随着临床同种胰岛移植治疗糖尿病在近年取得的突破性进展，对胰岛移植治疗的需求日益增多，而供者的严重短缺制约了同种异体胰岛移植的广泛开展。
解决供者短缺的两条可能的途经之一是利用异种供者如猪的组织或器官，但目前仍有如前所述的诸多总问题尚未解决，近年内恐难在临床应用。
另一条解决供者短缺的有效途经则可能是在体外大量培养可用于移植的细胞和组织。
近20年来，人们注意到胰腺的某些肿瘤细胞具有永生性，即在一定条件下可以不断复制、增殖和分化。
因而有研究试图在体外培养并改造这些细胞，使之可在体外大量增殖和培养传代形成一定的细胞系。
然而，由于对这些细胞内在的增殖、分化调控机制的认识尚不够深入，因而这类细胞系有的在植入动物体内后难以调控其增殖及分化，可能形成肿瘤，而有些细胞系则在培养传代过程中逐渐失去了它们在正常生理条件下应有的如合成、分泌胰岛素等功能。
胰腺在其胚胎发育过程中，胚胎胰腺上皮细胞增殖继之分化形成胰腺内的三种类型的细胞：内分泌细胞、腺泡细胞和导管上皮细胞[9]。
在人和啮齿类动物实验中已证实这些细胞的共同祖细胞（progenitor）具有导管上皮细胞的表型，即角朊素细胞19（Cytokeratin-19，CK-19）或角朊细胞素20（Cytokeratin-20，CK-20）[10，11]。
近10年来，可以通过在体外培养外分泌细胞，从而获得成人胰腺内具有导管上皮表型且有增殖潜能的细胞[12，13]。
Langerhans胰岛有4种细胞组成，即可合成激素肽的细胞：1、产生胰岛素的β细胞；2、产生胰高血糖素的α细胞；3、产生生长抑素的δ细胞；4、产生胰多肽的PP细胞。
它们在胰岛内有一定的立体位置和次序，与神经细胞紧邻。
胰腺干细胞存在于胚胎及成年胰腺内，尽管胰腺和中枢神经系统具有不同的起源和功能，但控制这两个器官发育的机理都非常相似[14-16]。
胰岛素促进因子（insulin promoter factor l , IPF-1）亦称（pancreas duodend homeobox 1 , PDX-1 ）是一种主要局限于成年胰腺已分化的β细胞内的转录因子。
胰腺再生时，正处于增殖状态的导管上皮细胞也重新表达这一转录因子。
因此IPF-1被认为是重新获得多能分化潜能的胰腺干细胞的标志[17]。
国内外已有数个研究组报道成功地分离和在体外培养了表达IPF-1的人胰腺导管上皮细胞，这些细胞具有分化为胰岛细胞的潜能，因而被认为是胰腺干细胞（pancreatic stem cell）[18-20]。
（二）胰腺干细胞的分离、培养由于胰腺干细胞主要来源于胰腺导管上皮及少量来源于胰岛，因而成功地分离胰腺导管上皮细胞就可获得大量的具有分化潜能的干细胞。
但干细胞与其它细胞相比，在培养方面有其特殊性，故有必要在此予以描述。
胰腺干细胞的分离：胰腺导管上皮是具有干细胞潜能的一类细胞，其在胰腺中所占比例甚少。
目前成人、动物胰腺导管上皮细胞的分离多采用胶原酶消化法[18,20]。
具体方法为：按供者器官切取原则和技术获取胰腺后，于导管内注入胶原酶（普通胶原酶或纯化的Liberase ），在一定温度下（30℃~37℃）消化，当观察到较多游离且完整的胰岛细胞团时，中止消化，低温清洗3次。
消化后胰岛已从外分泌组织中释放出来，但仍与外分泌组织混悬在一起。
由于内、外分泌组织的密度不同，可用密度梯度离心法将它们纯化。
如消化的胰腺组织较多，可用Euro Ficoll或Lymphaprep 或Ficoll液在COBE 2991细胞分离机中进行连续密度梯度离心，亦可对少量组织采用非连续密度梯度离心。
离心后，绝大多数胰岛即与外分泌组织（腺泡细胞和导管上皮细胞）分开而得到纯化，胰岛可用于移植等方面的研究，而外分泌组织则需进一步处理以便达到获取导管上皮细胞的目的。
另一种获取导管上皮细胞的方法是将胰腺的大导管以外科方法剪取，然后再将大导管切成小块后以胶原酶消化，在显微镜下将消化后的导管上皮细胞从导管上皮和其他细胞的混悬液中挑出。
此法无法获得大量的小导管上皮细胞，仅适用于需少量细胞的研究工作，此外，尚有用机械的方法将导管上皮从导管上刮下后收集，此方法难度大，收获量小，已较少有人应用。
胰腺干细胞的培养：消化后的胰腺细胞经密度梯度离心后，胰岛细胞即被从混悬液中分出，而外分泌细胞中则绝大多数（＞99%）为腺泡细胞，少量为导管上皮细胞。
根据这2种细胞的不同生物学特性，即导管上皮细胞在6～12小时即可贴壁生长而腺泡细胞不具备此特性，在培养的前期置换培养液时，几乎可将所有的腺泡细胞在换液时丢弃，仅留有少量的贴壁细胞即导管上皮细胞生长[20-21]。
一般来说，培养早期（前3～7天）可使用未经处理的T-75培养瓶，CMRL1066培养液，37℃，5% CO2条件下培养，其中葡萄糖浓度为5.6 mmol/L，加10%胎牛血清。
贴壁生长的细胞自12～24小时起即开始增殖、复制，从单个或少量几个细胞逐渐变为小细胞集落。
由于干细胞可在无血清培养液中生长和增殖，而其他细胞（除成纤维细胞外）不易生长，故在培养3～7天后即换为不含血清的DMEM/F12（含8mmol/L葡萄糖）培养液，其中加入一定量的胰岛素、转铁蛋白和硒、青霉素、链霉素、牛血清白蛋白、尼克酰胺和角朊细胞生长因子（keratinocyte growth factor, KGF）等。
笔者等从实验中发现，早期即培养3天后即换为不含血清的DMEM/F12培养液，更有利于导管上皮细胞即干细胞的生长和增殖，而早期加入微量霍乱毒素于培养液中则可有效的抑制成纤维细胞的生长，消除成纤维细胞的污染。
加入少量抗真菌的二性霉素B可比较有效的预防真菌的污染。
有文献报道使用鼠基底膜提取物制成的胶状物（Matrigel）具有促进胰腺干细胞生长的作用。
但笔者在实践中体会到Matrigel价格昂贵，干细胞在其中生长后很难将细胞完整取出，而使用胰酶消化时，很容易损伤或溶解干细胞，故建议不使用Matrigel为宜。
在此后的培养阶段，应较频繁地添加KGF，以促进干细胞的生长和转分化。
一般经培养5～7天后，细胞集落增大，互相开始连接成片，大片细胞在光镜下的形状如铺路的鹅卵石一般。
在此基础上细胞可形成一单层细胞，几乎覆盖培养瓶底，此时亦开始出现具有三维结构的细胞团，在相差显微镜下呈山嵴或山峰样隆起，这种三维细胞团结构随培养时间的延长逐渐增大，当直径达到100µm以上时，轻摇培养瓶则可使胰岛细胞团悬于培养液中，双硫腙染色呈红色。
Bonner-Weir报告成人全胰腺的干细胞经过5~7周培养后，可平均收获32000新生的胰岛细胞团。
而笔者等人报告经27天培养后平均每克胰腺组织可收获760个胰岛[20-21]。
在胰腺干细胞培养过程中，不同的外部条件可以促进干细胞的增殖与分化，它们包括：生长激素，如胰岛素样生长因子（insulin－like growth factor，IGF）；其他激素如胃泌素，胰高血糖素样多肽（GLP-1）等；生长因子和细胞因子如转型生长因子（transforming growth factor ,TGF-α），表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF），β细胞素（Betacellulin），白介素1β（interleukin-1β, IL-1β），肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF），角朊细胞生长因子（keratinocyte growth factor ,KGF）等；营养成份如葡萄糖；细胞外基质如上皮细胞粘附分子（Ep-CAM），胶原1和胶原4等；其它物质如尼克酰胺，丁酸钠等也有促进干细胞增殖和分化的作用[22]。
目前仍未找到培养干细胞的最佳条件。
成年胰腺干细胞在体外培养后所获的胰岛因数量及其胰岛素含量尚不足以用于临床试验。
部分动物实验表明，小鼠胰腺干细胞在体外培养后获得的胰岛植入同种糖尿病小鼠体内，可纠正糖尿病状态，基本恢复正常的糖代谢[23-24]。
三、胰腺干细胞及其在体外培养所生成胰岛的鉴定胰腺干细胞或胰岛前体细胞在体外培养过程中需进行可靠的鉴定。
除形态学观察外，还应对这些细胞的抗原标志物进行探测。
自20世纪90年代以来，通过大量的实验研究，人们已发现了一些用于检测胰腺干细胞的物质，主要分为两大类：一类为转录因子，它们在胰岛素基因的表达等方面具有重要作用；另一类为其他蛋白类物质。
在转录因子中，最重要的一个转录因子是IPF-1（Insulin-promoter-factor 1），亦称PDX-1（pancreas duodend homeobox 1）。
它不仅在胰岛素基因表达的调节方面具有重要作用，也是成熟的胰腺细胞分化时所必需的物质。
IPF-1缺失的小鼠则胰腺不发育[25-26]。
此外，在胰腺发育分化过程中先后有Hnf 6、H1x 69和Hnf 3β等的表达。
另一组转录因子在胰岛的前体细胞中有表达，它们包括Isl-1, Pax 4、Pax 6 Nkx 2.2、Beta 2/Neuro D 和Ngn 3等。
随着胰腺干细胞研究的不断深入更多与干细胞的分化有关的转录因子会被发现。
其他蛋白类物质中，胰腺激素YY，某些酶类如酪氨酸羟化酶，胰腺多肽等亦在胰岛发育成熟过程中有较高表达。
在已分化的β细胞中IPF-1可诱导胰岛素基因和Glut-2的表达，角朊细胞素-20，（Cytokeratin-20，CK-20）, 角朊细胞素-19（Cytokeratin-19 或CK-19）, Vimentin，Bcl-2，Nestin 等亦在胰腺干细胞增殖分化中起重要作用。
上述转录因子及其他蛋白类物质中，最常被用于成年胰腺干细胞鉴定的物质是IPF-1和CK-20，CK-19。
近年来Nestin亦常见存在于啮齿类动物胰腺导管上皮和胰岛内。
IPF-1和CK-20，CK-19可用免疫组化方法测得，亦可用分子生物学方法检测源于胰腺干细胞的胰岛细胞内IPF-1及胰岛素的mRNA表达情况，以判断培养细胞是否为胰腺干细胞。
笔者在实验中发现，早在成人胰腺细胞培养第一天，贴壁生长的导管上皮细胞即开始表达IPF-1，随着培养进程，表达逐渐增强。
四、胰腺干细胞临床应用前景近年来，对利用干细胞治疗不同疾病的可能性的研究引起了广泛重视。
属多能干细胞的表皮干细胞、造血干细胞、胰腺干细胞及胰岛、神经元干细胞等均具有自身更新和分化为多种细胞系的可能。
人们已成功地从胎儿及成年动物或人分离出这些干细胞并在体外培养，其中皮肤的上皮、造血干细胞已用于临床治疗，显示了干细胞临床应用的广阔前景。
体外培养的、源于干细胞的胰岛亦可能在不远的将来替代同种供者的胰岛，用于治疗糖尿病。
世界上已有几个研究小组对此进行深入的研究，其中包括美国波斯顿麻省总医院的Bonner-Weir及其同事们，西安第四军医大学宋振顺及其同事们已在体外成功地将成人胰腺导管上皮组织扩增并转分化为胰岛样细胞团。