《免疫学实验技术》实验讲义修订版2014

亲们：

曾老师发来的实验讲义，请下载打印，每次课带相应的讲义。

1.下周一实验1点开始，切记时间不要迟到哟。

2.作业：第一次（今天）的实验报告，还有“大吞噬”和"小吞噬"的图。

3.漂亮美女们要把头发扎好，为自己的健康着想哟。

实验一小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验

【原理】吞噬细胞具有对异物(细菌、绵羊红细胞、鸡红细胞等)吞噬和消化的功能，在机体固有免疫中发挥重要作用。

【目的】

1.通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过程及其

意义。

2.掌握小鼠腹腔注射给药和摘眼球放血及脊椎脱臼处死的方法。

【材料】小鼠、2％鸡RBC（CRBC）、尖吸管、玻片、瑞氏染液、眼科剪、弯头眼科镊、1mL 注射器

【方法】10％的硫乙醇酸钠溶液腹腔注射1ml（诱导腹腔巨噬细胞大量渗出）

（4d）

2％CRBC腹腔注射1ml

（45min）

摘眼球放血，处死小鼠

轻揉腹部1min，剪开表皮，暴露腹膜，剪一小口，取腹腔液（用尖吸管）滴于玻片一端

推片（自然干燥）

瑞氏染色（10min）

冲洗，印干，镜检

【注意事项】

⒈腹腔注射时勿注入皮下；

⒉染色时玻片勿互相碰触；

⒊观察时注意玻片正反面。

结果：吞噬百分率＝吞有SRBC的吞噬细胞/100个吞噬细胞×100％

吞噬指数＝所吞SRBC数/100个吞噬细胞

附：

⒈2%CRBC悬液的制备：吸取在阿氏液中保存的CRBC沉淀0.3mL，置于玻璃试管内，加入2mL生理盐水，混匀，2000rpm, 5min离心，此为洗涤红细胞。离心毕，观察上清，如无溶血现象，即可弃上清，取红细胞沉淀（即为压积红细胞）0.2mL，移入15mL离心管中，以10mL注射器吸取生理盐水10mL加入，混匀，即为2%CRBC悬液。若洗一次后仍可见溶血现象，则重复第一步，直至无溶血发生，方可配制实验用红细胞悬液。

⒉摘取胸腺，脾脏。均为重要的免疫器官，做动物实验获取免疫细胞的重要来源

示教片：

大吞噬实验：即本实验结果；

小吞噬实验：外周血嗜中性粒细胞吞噬葡萄球菌（标本片示教）

实验二淋巴细胞转化实验（MTT法）

一、原理：

四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。

二、材料：

小鼠、鼠板、眼科剪、眼科镊、75%乙醇湿棉球、小平皿、200目筛网、研棒（注射器针芯）、细胞计数板、盖玻片、加样器（1mL、200uL、20uL）及枪头、96孔血凝板、15mL离心管、4mL EP管、96孔板、白细胞计数液、MTT、ConA、无菌PBS、Tris-NH4Cl、完全1640(含10% FBS、1%双抗)、0.01N HCl-10%SDS、无菌针头过滤器、10mL注射器、废物（液）缸、冰浴、无菌操作台、CO2培养箱，显微镜、酶标仪，冰箱、低温离心机。

试剂的准备：

1. MTT：称取50mg的MTT，溶于10ml PBS后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，1mL/管，-20℃避光保存。

2. ConA：25mg/瓶，Sigma出品。取25mg，溶于25mLPBS中，终浓度为1mg/mL，过滤除菌，无菌EP管分装，1mL/管，-20℃保存。用时取1mL，以无菌PBS稀释为100ug/mL （即稀释10倍）。

3. PBS：取市售配好的PBS粉末一袋，加1000mL蒸馏水，混匀，高压或过滤除菌，4℃保存。

4. 0.01N HCl-10%SDS：设市售浓HCl为10N（实际约为11N），取0.1mL加99.9mL蒸馏水稀释为0.01N HCl 100mL；称取10g SDS，置于100mL量筒内，以上述HCl溶解，使终体积为100mL，即得0.01N HCl-10%SDS。

5. 完全1640:取市售RPMI1640 89mL，加1mL 100×双抗、10mLFBS，即得含10%FBS的完全1640.

6. Tris-NH4Cl （红细胞裂解液）：称取3.735g 氯化铵、Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.3g

加水溶解并稀释至500ml 。0.22μm 滤膜过滤除菌，4℃保存。

无菌器械的准备：

1. 200目筛网、研棒、平皿：提前1d 高压灭菌，烘干备用。

2.手术器械：临用前酒精擦拭或浸泡、酒精灯火焰灭菌。

3.冰浴：将碎冰置于一白色浅盘(或小塑料泡沫盒)内，备用。

（三）实验方法：

1、脾细胞制备：

（1）小鼠摘眼球放血、脱颈椎处死，75%乙醇湿棉球擦拭腹部，置于鼠板上固定；

（2）在小鼠腹部中间部位剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；

（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，另一镊子分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml 无菌PBS 液的培养皿中；

（4）制备脾细胞悬液: 无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（200目）上，置于盛有适量无菌

PBS 的小平皿中，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用

PBS 洗3次，每次离心2000r/min 5min 。取出10μl ，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，调整细胞浓度为5×106/ml 。

细胞计数的方法：

①稀释脾细胞：在96孔血凝板内分别加白细胞计数液90μL/孔，根据细胞数量加2-3

个孔；取脾细胞悬液10μL ，依次10倍稀释。

②取最后1孔的细胞悬液10μL 置于白细胞记数板槽内，待细胞不再移动，100倍镜下

进行细胞计数。 ×1mm ×0.1mm=0.1mm 3=0.1×10-3细胞浓度:

细胞数/ml =5个中格的细胞数x 5x 104（RBC W W

W W ③根据细胞计数结果，取适量细胞以完全1640稀释为5×106/mL

2、淋巴细胞增殖反应： 将5×106/ml 脾细胞悬液加入到96孔培养板中，100ul/孔，加6个孔，再加培养液100μL/孔；前3个孔加ConA 10μL/孔(终浓度5μg/mL)，另3个孔不加ConA 作为对照。置5％ CO2，37℃培养72h 。