基因克隆

克隆测序：
1、pcr扩增目的基因并回收 2、与克隆载体连接
连接效率非常重要； 目的片段与载体的质量比 3:1-10:1
3、转化涂板培养
感受态非常重要。
4、挑单菌落培养 5、pcr和提质粒酶切筛选鉴定 6、送阳性克隆测序
对测序结果的分析 1、在测序所得序列中找到目的基因序列，采 用NCBI中blast进行比对，或者采用比对软 件进行比对。 2、翻译出氨基酸，进行氨基酸序列比对。
基因克隆
基于PCR技术的基因克隆
中心法则

中心法则总结了 生物体内遗传信 息的流动规律， 揭示遗传的分子 基础。
复制
DNA
转录
逆转录
RNA
复制
翻译
蛋源自文库质

基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从 生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获 得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能， 或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因
克隆基因全长的策略 策略1、从目的基因的第一个碱基和最后一个 碱基开始分别设计引物 策略2、如果策略1不能设计出好的引物或扩 增失败，采用在目的基因两边设计合适引 物，克隆目的基因 策略3、如果前两种方案都不行，采用分段扩 增克隆基因后再拼接触全长
Load sequence
Preimer Premier 启动界面
Sequence name
Original sequence
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好
Sense strand or anti-sense strand



1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂， 形成单链DNA，称之为变性。 2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互 补的一小段DNA片段。 3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四 种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺 序合成新的DNA链。
PCR扩增的两大指标： 1、特异性 2、扩增效率
无论是扩增条件的选择还是各组分的用量都 要兼顾这两个指标。
PCR体系的组成和各组分的影响
1、模板 越少特异性越强 2、DNA聚合酶 不同的聚合酶扩增效率、保真性不同 3、buffer 有不同扩增buffer 4、dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) 越少特异性越强 5、Mg2+ 越少特异性越强扩增效率越低 6、primers 越少特异性越强 7、水
温度（℃）
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
循环3
94
72
60 60 ℃退火 （1min）
72 ℃延伸 （1.5min）
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应 延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃ 退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。
Useful information of the primer
如果没有找到合适的，只有手动设计，一 般都是在已找到较好的基础上再调整位置 或引物长度。设计好引物后最好在NCBI上 blast一下。
PCR原理和过程
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA序列的方法。
克隆植物未知基因的常用技术
1、通过已知基因产物的分析和鉴定 2、通过遗传表型分析 （1）基因标鉴法。 （2）激发子的寄主受体基因克隆技术 3、以图谱为基础的定位克隆技术
克隆植物未知基因发展中的技术
1、从研究缺失突变体的表型着手分离基因 2、从大的基因组区域直接分离编码序列 3、通过研究mRNA差异表达筛选克隆基因 4、表型克隆法 5、应用DNA芯片技术筛选新基因
谢谢大家！！
克隆基因最根本的是要找到合适的筛选 确定方法
如何获得已知基因序列：
一般在NCBI上查找基因序列，一定要是你 所用样本（或模板）的基因序列，采用引 物设计软件设计引物，pcr扩增
一般引物设计原则





① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
引物长度 一般引物长度为18-30碱基。 GC含量 一般引物序列中G+C含量一般为40%-60% 退火温度 一般公式Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 避免扩增模板的二级结构区域 防止与靶DNA或其它样本的错配 引物末端 3‘端不能是A，不能连续4个同一个核苷酸 不要产生引物的二级结构 为了下一步操作而产生的不完全匹配 主观添加的寡核苷酸序列
工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要
的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的
遗传性状，包括人体基因治疗。
设计引物（或探针）前要明确的几个方面： 1、明确要做的基因 2、明确做此基因的目的 3、明确检测此基因的技术 4、明确此基因是未知还是已知
如何获得未知基因序列 1、同源序列比对（亲缘要尽可能的相近）， 找到保守序列，设计引物扩增或采用RACE 法扩增 2、对于从未研究的基因，有很多的技术来研 究。

荧光定量PCR引物设计较一般引物设计严格，扩增基因片段 长度大小一般在100-200之间，上下游引物横跨一个内含子， 溶解温度（Tm）为60-65℃之间。
实践是检验真理的唯一标准
对于未知基因，我们得到一些亲缘近的已知 的基因序列进行分析比对得到其保守序列， 依据保守序列来设计引物。 对于已知基因，依据所查序列设计引物即可。
模板的获得：
1、模板类型：DNA或cDNA 2、获得模板的原材料 a 原材料的位置 b 采取原材料的时期 c 原材料的处理和储存 d 提取 DNA或RNA时原材料的用量 3、DNA或RNA的提取 4、反转录获得cDNA时所采用的试剂盒和引物
PCR扩增条件的选择： 1、主要是退火温度的选择 一般选引物Tm值 上下2℃；退火温度越高特异性越强 2、退火时间：时间越短特异性越强 3、延伸时间：根据聚合酶的扩增效率和扩增 基因的大小来确定 4、循环数