苏云金芽孢杆菌8010的研究(关雄编著)思维导图
苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白结构和功能研究进展
苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白结构和功能研究进展收稿日期：2007-05-16作者简介：吴洪福（1978-），男，黑龙江人，硕士研究生，研究方向为蛋白质分离纯化。
E-mail:chenyang69@吴洪福1,3，郭淑元2，李海涛1，高继国1（1.东北农业大学生命科学院，哈尔滨150030;2.北京理工大学生命科学与技术学院，北京100081;3.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100094）摘要：对目前解析的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的三维结构进行了比较分析。
它们都有类似的结构，有三个结构域，结构域Ⅰ是由7个α螺旋以α5螺旋为中心形成的α螺旋束；结构域Ⅱ是由三个反平行β折叠形成的β棱柱；结构域Ⅲ是一个β“三明治”结构。
对这三个结构域的Loop 及氨基酸残基与杀虫活性的关系、与通道形成相关的杀虫作用机制的研究进展进行了综述。
关键词：杀虫晶体蛋白；结构域；Loop 中图分类号：S482.2+92文献标识码：A苏云金芽孢杆菌（Bacillus thringiensis ，Bt ）是一种革兰氏阳性（G +）细菌，它在形成芽孢的同时能产生伴孢晶体，又称杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins ，ICPs ），对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目昆虫及动植物寄生虫线虫等有特异性毒杀作用，而对人和家畜无害，不污染环境，在农林卫生害虫防治中应用广泛[1]。
杀虫晶体蛋白包括Cry 和Cyt 蛋白两大类。
Cry 晶体蛋白被敏感幼虫吞食后，在幼虫肠道碱性环境和蛋白酶的作用下释放出活性毒素，可与昆虫中肠上皮细胞的特异受体结合并形成孔道，破坏细胞渗透压平衡，最终导致昆虫死亡[1]。
本文对Cry 蛋白的结构与功能关系的相关研究进行综述。
1B t 杀虫晶体蛋白的结构解析和结构比较解析杀虫晶体蛋白三维结构的方法主要有两种：单对或多对同晶置换法（SIR/MIR ）和分子置换法（MR）[2]。
苏云金芽孢杆菌Cry毒素共性结构短肽串联表达及功能分析
河南农业科学，2024，53（1）：96‑104Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi:10.15933/ki.1004-3268.2024.01.011苏云金芽孢杆菌Cry 毒素共性结构短肽串联表达及功能分析金嘉凤1，2，沈成2，3，孟萌2，4，陈蔚2，徐重新1，2，刘媛1，2，刘贤金2（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013；2.江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所/省部共建国家重点实验室培育基地—江苏省食品质量安全重点实验室，江苏南京210014；3.南京农业大学植物保护学院，江苏南京210023；4.江苏大学生命科学学院，江苏镇江212013）摘要：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis ，Bt ）Cry 毒素是一类具有抗虫功能的微生物蛋白。
将前期基于Bt Cry 毒素家族氨基酸序列及结构信息设计获得的呈现Cry 毒素共性结构的3个短肽，拼接成为具有免疫原性的长链多肽（Bt Cry-GXJG-11），以期研发Bt Cry 毒素杀虫功能的模拟物及制备Bt Cry 毒素检测用广谱抗体的免疫原。
分子建模预测结果显示，Bt Cry-GXJG-11与Bt Cry 毒素靶标害虫棉铃虫（Helicoverpa armigera ）钙黏蛋白受体（HaCad-TBR ）存在互作效应，并初步明确了两者互作的关键氨基酸位点为244TYR 。
经原核表达，获得了质量浓度为0.5mg/mL 的Bt Cry-GXJG-11纯蛋白，测得其与HaCad-TBR 的亲和力常数（KD ）为2.151×10-7mol/L 。
室内生测试验表明，Bt Cry-GXJG-11对棉铃虫具有一定杀虫活性，校正死亡率为27.5%；且以其免疫的小鼠血清能同时识别6种Bt Cry 毒素（Cry1Ab 、Cry1Ac 、Cry1Ah 、Cry1B 、Cry1C 、Cry1F ）。
苏云金芽孢杆菌伴孢晶体中20-kb DNAs上染色体基因的鉴定
苏云金芽孢杆菌伴孢晶体中20-kb DNAs上染色体基因的鉴定孙运军;袁志明;夏立秋;魏薇;付祖姣;黄璠;丁学知;胡胜标【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2007(030)004【摘要】已有的研究表明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4.0718菌株菱形晶体中含有与原毒素紧密结合的20-kb DNAs,利用PCR-RFLP分析发现在这些20-kb DNAs上含有cry1Aa、cry1Ac、cry2Aa和cry2Ab基因.本研究利用特异引物从4.0718菌株中20-kb DNAs上分别扩增出带有自身调控序列的cry1Ac 和cry2Aa基因,并将其分别电转至Bt无晶体菌株Cry-B中获得重组菌株Cry-B(pHC42)和Cry-B(pHC39).SDS-PAGE和透射电镜分析表明这两种重组菌株能够分别产生由130-kDa的Cry1Ac原毒素形成的菱形晶体以及由65-kDa的Cry2Aa原毒素形成的方形晶体.毒力生测的结果显示,这两种菌株的表达产物对棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫具有预期的杀虫效果.重组菌株分别形成的两种晶体经不同的缓冲液溶解后能释放出与20-kb DNAs紧密结合的原毒素,同时在20-kb DNAs上均可检测到源于Bt染色体的spo0A和nprA基因片段.【总页数】5页(P114-118)【作者】孙运军;袁志明;夏立秋;魏薇;付祖姣;黄璠;丁学知;胡胜标【作者单位】中国科学院武汉病毒研究所,中国,武汉,430071;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081;中国科学院武汉病毒研究所,中国,武汉,430071;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081【正文语种】中文【中图分类】TP18;O231.4【相关文献】1.常染色体STR基因座三等位基因在法医DNA鉴定及临床实践中的意义 [J], 周单华;陈鹏宇;余丽梅2.5种中国苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白基因分析 [J], 张光美;Raymo.,A3.苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kbDNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究 [J], 胡宏源;夏立秋;史红娟;孙运军;高必达;丁学知4.苏云金芽孢杆菌蜡螟变种伴孢晶体蛋白基因的克隆及表达 [J], 王智勇;吴柏桦5.苏云金芽孢杆菌的分离鉴定及伴孢晶体蛋白生物毒力效果分析 [J], 刘晨;王祯;朱先约;杨瑞;倪博立因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物苏云金芽孢杆菌蛋白(BT)酶联免疫分析
植物苏云金芽孢杆菌蛋白（BT）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞上清及相关液体样本中苏云金芽孢杆菌蛋白（BT）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物苏云金芽孢杆菌蛋白（BT）水平。
用纯化的植物苏云金芽孢杆菌蛋白（BT）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入苏云金芽孢杆菌蛋白（BT）,再与HRP标记的苏云金芽孢杆菌蛋白（BT）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的苏云金芽孢杆菌蛋白（BT）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物苏云金芽孢杆菌蛋白（BT）浓度。
试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
苏云金芽孢杆菌生物农药的制备、伴胞晶体的分离纯化及杀虫活性
JIUJIANG UNIVERSITY实验论文题目苏云金芽孢杆菌生物农药(Bt制剂)的制备、伴孢晶体的分离纯化及杀虫活性院系生命科学学院专业生物技术姓名樊晓乐、严学芬、王伟、周明宣、邹红虹班级B0933指导教师张炳火二零一一年十一月摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。
本试验采用固体培养，对一株苏云金芽孢杆菌进行了发酵，制备了Bt制剂，对伴孢晶体进行了分离纯化，采用菜地试验，检测了Bt制剂和伴孢晶体对白菜虫害的防治效果。
关键词：苏云金芽孢杆菌（Bt）；伴孢晶体；杀虫活性前言苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。
它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上），这些蛋白具有很高的杀虫活性。
Bt由于具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、生物降解无残毒、所用原料简单等优点，在虫害防治中发挥着越来越重要的作用，随着对Bt研究的深入，Bt的基因改造、毒理学研究、杀虫机理、对人类的安全性等方面的研究都对高纯度的Bt伴胞晶体提出了极大的需求。
因此，Bt伴胞晶体的分离纯化方法逐步得到了发展，如等密度梯度离心法、液体双相分离法、等电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高速离心法和生物物理法等。
本实验采用2种液体培养基、2种培养条件对苏云金芽孢杆菌进行培养。
镜检观察当90％以上的芽孢脱落时处理菌体，经碱液裂解后比较等电点沉淀和液体双相分层法提取Bt蛋白的收率和纯度。
1 材料与方法1.1 菌种苏云金芽孢杆菌为九江学院生命科学学院微生物实验室保藏。
1.2 培养基种子培养基：牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,NaCl 1.0%,调pH 7.2 左右,121℃灭菌30 min。
发酵培养基：牛肉膏0.5%,蛋白质 1.0%,葡萄糖0.3%,NaCl 0.2%, MgSO4·7H2O 0.03%, K2HPO4 0.03%, MnSO4 0.005%,调pH 7.5,121℃灭菌30min,灭菌后pH 7.3。
【doc】苏云金芽孢杆菌的研究发展史与“十一五”立项思考
苏云金芽孢杆菌的研究发展史与“十一五”立项思考第9卷第4期2005年12月河北农业科学JournalofHebeiAgriculturalSciencesV o1.9No.4Dec.2005文章编号:1008-1631(2005)04-0080-06苏云金芽孢杆菌的研究发展史与"十一五"立项思考冯书亮(河北省农林科学院植物保护研究所,河北保定071000)摘要:论述了苏云金杆菌研究发展史以及主要研究领域和今后的研究热点,并对"十一五"立项进行了探讨.关键词:苏云金杆菌;ICPs基因;产业化;抗癌研究中图分类号:$482.7文献标识码:A ResearchProgressandConsiderationof"llth"FiveY earsProgramonBacillusThuringiensisFENGShu-liang(InstituteofPlantProtection,HebeiAcademyofAgricultureandForestrySciences,Baoding 071000,China)Abstract:Inthispaper,wereviewedtheresearchphylogeny,primarydomainonbacillusthuri ngiensisinpastonehundredyears,andresearchfocusofwhichinfuture,moreover,wealsomakeadiscus sionaboutestablishmentof"1lth"fiveyearskeyprogram.Keywords:Bacillusthuringiensis;ICPsgene;Industrialization;Anticancer-research苏云金杆菌发现距今已有100余年,随着它在防治害虫中的成功而逐渐发展起来.该杀虫剂作用专一,对环境无害和对人畜安全,成为世界上一种卓有成效的微生物杀虫剂,并在微生物防治害虫实践中占有极其重要的地位¨J.1研究发展史1.1发展初期(1901—1952年)1901年日本学者石渡繁胤在大日本蚕丝会报上,第一次报道了家蚕患软化病急剧死亡的现象,被称之为"猝倒病",并从虫尸体液中分离出一种芽孢杆状细菌【.该菌就是现在的苏云金杆菌猝倒亚种(Bacillusthuringiensissubsp.Sotto),它的发现成为苏云金杆菌研究的起点.在欧洲,发现苏云金杆菌对一些害虫有致病性后,就把它作为防虫的潜在措施进行了研究.但是,早期实验的结果不稳定,一度对其应用前途失去信心.1920—1930年,大量论文又肯定了它作为生物防治剂防治玉米螟(Ostainianubilalis)的效果.为了进行正规微生物防治,第一个商品制剂Sporeine,1938年在法国问世,到20世纪50年代,它作为地中海粉螟的防治剂得到了应用J.1.2杀虫蛋白毒素和产业化(1953—1999年)1953年发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴胞晶体有关J,这种原杀虫蛋白毒素只有经昆虫肠液或在碱性条件下消化,才能成为毒性肽.1958年,美国第一个商品Thuricide投入市场,粮食药品管理司(FDA)批准暂行免除容许量限度;1960年正式批准,允许在20多种作物上防治23种害虫.收稿日期:2005-06-30作者简介:冯书亮(1957一),男,河北威县人,研究员,主要从事杀虫微生物研究.第4期冯书亮:苏云金芽孢杆菌的研究发展史与"十一五"立项思考?81.1970年Dulmage筛选出比当时生产菌株高20—200倍的HD-1菌株J,同时还研究了培养基和培养条件对毒力的影响.由于HD-1菌株对夜蛾科害虫毒力较高,很快取代了美国各公司生产菌株,发酵效价不断提高.从那时起,已有60多个国家生产了100多种苏云金芽孢杆菌商品,使苏云金芽孢杆菌成为世界上产量最大,防效最好和应用最广的微生物杀虫剂.1965年我国第一个商品制剂"青虫菌"问世,产量长期稳定在1000—5000t;20世纪90年代发展迅速,目前Bt制剂的生产厂家已达60多家,年产量达2万一3万t,并能部分出口[11,已经形成大吨位,大市场和高质量的局面.20世纪80年代,我国开始Bt产品的质量标准化研究,建立了以小菜蛾和棉铃虫为标准试虫的产品质量化技术,实现了与国际质量检测技术接轨.1995年,农业部农药鉴定所以生物测定为基础下达了我国Bt杀虫剂的部分标准,这对我国苏云金芽孢杆菌的稳步发展起到了推动作用.1.3新领域的开拓研究(200o一2005年)如果把抗癌研究看作是苏云金杆菌向医学领域拓展的转折点,那么,日本学者Mizuki等首先研究发现某些非杀虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthurinjiensis,Bt)株系的伴胞晶体蛋白对体外培养的人癌细胞(MOLT-d,HeLa)具有毒杀能力.这类蛋白不属于已知的任何一种Cry/cyt蛋白,有可能形成一类新型毒蛋白,其抗癌活性与Cry蛋白相似,需经蛋白酶水解活化,所导致的细胞病变有明显的核凝聚和细胞肿胀过程.目前该81KD蛋白的基因已被克隆,被苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry31Aal.这个发现具有极大的研究价值,可能导致Bt在医学上的新应用.2主要研究领域2.1防治范围及ICPs基因的多样性苏云金杆菌主要活性成分是杀虫晶体蛋白基因(即1CPs基因)编码的.不同亚种及菌株的1CPs基因,不仅在数量和存在状态上不同,而且在表达水平与杀虫特异性上也存在差异.1981年从库斯塔克亚种HD-1-Dipel克隆第一个1CPs基因¨,随后克隆了大量新的1CPs基因,到2003年10月,已报道的1CPs基因已达42群270种.我国从苏云金杆菌菌种YBT-1520中第一个克隆1CPs基因crylAcl0后,相继又克隆了crylFb3和cry3Aa7等共28个杀虫晶体蛋白基因.根据1CPs基因的重要性,现将其归为3类: 2.1.1防治鳞翅目害虫及其ICPs基因鳞翅目害虫是Bt菌株的主要防治对象,Bt菌株对几乎所有的鳞翅目害虫都有活性.用于防治鳞翅目害虫杀虫剂的大多数Bt菌株主要含有crylAc,crylAb和crylAa3个高毒力基因,它们主要来自于库斯塔克亚种(subsp.kuntaki),苏云金亚种(subsp.thuringiensis)和鲇泽亚种(subsp.aizawai).其中crylAc毒力最高,在构建杀虫工程和转基因植物中使用最多L】.crylAc是对甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)毒力最高的基因,主要来自鲇泽亚种.crygC基因的特点是,其产物与其它常规杀虫晶体蛋白相比,在中肠上皮细胞膜上具有不同的结合位点,可以克服昆虫可能产生的抗性,杀虫活性较强¨.2.1.2防治鞘翅目害虫及其ICPs基因拟步行甲亚种(subsp.tenebrionis)对鞘翅目马铃薯甲虫(Leptinotarsadecenlineata)具有较高毒力,在欧美等国已经形成商品,其主要的杀虫基因为cry3A.cry8C杀虫晶体蛋白基因主要来自日本亚种(subsp.japonensis),对鞘翅目金龟子类幼虫有杀虫毒力,如对日本丽金龟幼虫(Popilliojaponica)高毒力的buibui菌株L】,在美国和日本已申请专利,并于2002年在日本进行了产品注册.河北省农林科学院植物保护研究所杀虫微生物研究室筛选出的HBF.1菌株,对我国发生较为严重的黄褐丽金龟(Anomalaexoleta)和铜绿丽金龟幼虫(A.corpulenta)具有高毒力¨,2002年12月通过成果鉴定.目前已从HBF一1中分离克隆了被国际基金委员会正式登记命名为cry8Ca2的基因.金龟子芽孢杆菌(Bacilluspopilliae)是一类对金龟子幼虫专性寄生的细菌.近年来发现一些与Bt杀虫晶体蛋白具有一定同源性的杀虫毒素蛋白,如cryl8Aal毒素与cry2A具有40%相似性,以后又82?河北农业科学第9卷陆续发现了cryl8Ba和cryl8Ca.'2.1.3防治双翅目害虫及其ICPs基因杀蚊纳幼虫的Bt蛋白基因主要存在于以色列亚种(subsp.istealensls,Bti),该亚种含至少有cry4A,cry4S,cryl1A和crylA4个杀虫基因,Cryl1A活性最高.蛋白(Cytolyticcrystalprotein)即溶细胞毒素,能直接插入昆虫中肠细胞微绒毛膜上的不饱和脂肪酸,而后溶解细胞.它除具有抗双翅目昆虫活性外,还显示出对不同的无脊椎动物及脊椎动物的溶细胞活性,与cry蛋白在结构上无任何相关性,可延缓或克服对cry蛋白产生抗性,有协同杀蚊作用.2.2Bt转基因工程植物研究近年来,植物基因工程取得巨大成就,使外源基因能稳定地导人许多植物,Bt转基因工程植物应用前景广阔.自1987年第一例转Bt基因植物抗烟草夜蛾转基因烟草¨报道以来,相继又获得了棉花,玉米,土豆,水稻,番茄,油菜和大豆等Bt转基因植物.2002年Bt转基因植物主要是Bt玉米和Bt棉花,其中Bt玉米面积990万hm,占转基因(cry1Ab或cry1Ac)玉米面积的80%;Bt棉花460万hm,占转基因(crylAa或crylAc)棉花的68%.可见,Bt抗虫特性在转基因棉花和转基因玉米中占有重要地位.目前,在Bt转基因工程植物研究中,还面临着Bt转基因工程植物的安全性,提高基因的表达量,基因的定位表达以及昆虫的抗性等问题.我们相信,随着分子生物学的快速发展,科研工作者会不断开拓,探索新思想,新方法和新途径,为人类创造出多功能的新作物品种.3今后研究的热点3.1苏云金杆菌多功能菌株的构建与筛选Bt的ICPs基因的多样性,为遗传改良Bt提供了广阔空间.运用ICP编码质粒的遗传学操纵及用重组或非重组等生物技术来改变Bt的杀虫潜能,是继从天然菌株中筛选高效广谱的Bt菌株以满足生产需要的另一重要途径.目前,国内外主要通过质粒消除与交换及基因重组2条途径构建高毒力广谱杀虫Bt工程菌株.近年来,以美国为代表的发达国家已推出至少20种以上不同防治对象的Bt基因工程产品,而我国自行构建的Bt工程菌尚未进行商品化生产.因此,我国应加强这一领域的研究进程,通过现代基因操作技术,将不同ICP基因修饰优化组合,并与cytA增效基因和能诱导植物产生抗性的Har-bin基因重组,通过整合载体或"解离"载体系统转入具有良好发酵性能的Bt受体菌或对某些昆虫具有高毒力的野生型Bt菌株,构建高效,广谱,延缓抗性的Bt工程菌和杀虫抗病的Bt工程菌;优选不同Bt工程菌的发酵培养基,确定中试发酵工艺条件,探索提高Bt工程菌毒力的途径.3.2ICPs基因进入抗癌研究,为医学界开辟新领域长期以来,人们总是将Bt作为一类能合成杀虫蛋白的微生物进行研究和利用.那些在自然界中同样存在,甚至分布更广的非杀虫的Bt菌株却一直不受重视,它们的生物学特征也从未被研究过.虽然最近曾有报道一些非杀虫的Bt菌株具有抗细菌活性,但有关这类Bt菌株其它方面生物活性的研究仍然很少.这类Bt菌株是否具备可供开发利用的生物学活性还不清楚. 1999年,日本学者首先发现某些不具有杀虫能力的Bt菌株合成的81KD伴胞晶体蛋白对体外培养的人癌细胞(人类白血病T细胞和人类子宫颈癌细胞)具有杀伤能力.随后,他们在1744个Bt菌株(包括1700个13本株系和44个H血清型的参考型株系)中筛选具有杀人白血病T细胞(MOLT-4)活性的菌株和对绵羊红细胞具有溶血活性菌株.在1684个无溶血活性菌株中,有42个菌株对体外培养的MOLT-4具有杀伤能力,分别属于dakota,shandongiensis,corenensis和neoleonensis等亚种,它们对5个目(鳞翅目,直翅目,双翅目,蠊螳亚目和等翅目)11种体外培养的昆虫细胞均不表现毒杀活性.第4期冯书亮:苏云金芽孢杆菌的研究发展史与"十一五"立项思考?83?以Bt抗癌菌株的发现为契机,今后它将向防治害虫以及医学领域等方面更广泛的发展.4"十一五"立项思考4.1"十一五"国家攻关计划建议通过对我国主要农业生态区有害金龟子幼虫的种群分布调查,建立金龟子幼虫在主要为害植物上的空间分布模型,从而有针对性地指导防治工作;通过建立室内饲养种群,为长期快速进行金龟子幼虫的各项研究提供虫源保证;以自行筛选出对丽金龟科和鳃金龟科幼虫高毒力的Bt新菌株作为菌株资源,优化其发酵工艺条件,探明混合发酵工艺路线,建立防治金龟子幼虫Bt产品的质量检测标准,生产出新的Bt新品种;通过田间应用技术研究和田间示范推广,为持续有效控制我国主要金龟子幼虫做出新的贡献.具体包括:(1)调查我国不同生态区的金龟子幼虫种群分布,完善其室内饲养技术,建立2种常年继代饲养的金龟子种群;(2)筛选对鳃金龟科幼虫高毒力的Bt新菌株1—2株;(3)优选HBF-1和185菌株的发酵培养基和培养条件,优化发酵工艺,探明HBF.1和185菌株混合发酵工艺路线;(4)完善产后剂型加工技术,建立防治金龟子幼虫的Bt产品质量检}贝4标准化技术,研制出防治金龟子幼虫的Bt新品种;(5)确立防治金龟子幼虫的Bt制剂田间应用技术,建立666.7hm防治示范区.4.2国家"863"计划及建议4.2.1对金龟科地下害虫高效的Bt杀虫基因的研究针对重要的鞘翅目地下害虫,从我国自行分离的对金龟子幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株HBF一1和185菌株中分离克隆其杀虫基因,研究基因表达及产物的空间结构,进一步对关键位点进行诱变,以明确蛋白结构与功能的关系,筛选出毒力更高的新型杀虫基因.这项研究工作的完成,将会缩小与国外在Bt杀虫蛋白基础研究方面的差距,同时可以获得具有我国自主知识产权的对地下害虫蛴螬高效的杀虫基因,为构建微生物工程菌及转基因抗虫植物提供新的基因来源,因而具有重要的理论意义和广阔的应用前景.具体包括:(1)从我国Bt菌株HBF-1和185菌株中分离克隆cry8C和cry8E基因;(2)完成亚克隆,序列测定和分析,进行空间结构预测;(3)定点诱变,研究其不同结构域的关键位点和置换氨基酸;(4)cry8C和cry8E诱变基因的表达,活性检测,明确结构与功能的关系;(5)从Bt分离株中进一步鉴定,筛选对地下害虫金龟子有效的杀虫基因.4.2.2对人体癌细胞具杀伤活性的苏云金杆菌菌株研究日本学者Mizuki等于1999年首次发现不具有杀虫能力的Bt菌株合成的81kDa伴胞晶体蛋白对体外培养的人癌细胞具有杀伤能力,不同菌株显示了不同的毒力范围和不同的毒性水平.其中某些菌株对人类白血病T细胞和其他人类癌细胞的杀细胞活性很高,同时菌株蛋白能够区别白血病和正常T细胞,可特异性地杀死白血病细胞,而对正常T细胞没有损伤.为此,我们拟进行以下5个方面的研究:(1)具有非杀虫活性的抗癌Bt菌株筛选及生物学特性调查;(2)抗癌Bt菌株伴胞晶体蛋白质的确定及蛋白质分类;(3)抗癌Bt菌株伴胞晶体蛋白对人,鱼,绵羊红细胞正常细胞的毒性水平测定;(4)抗癌Bt菌株伴胞晶体蛋白对细胞导致的病理学变化研究;(5)抗癌Bt菌株伴胞晶体蛋白基因的克隆及表达.4.3转CrySC和CrySE抗虫基因草坪和马铃薯专项研究蛴螬是为害草坪和马铃薯的重要对象,且具有一定的隐蔽性,在地下害虫中为害居首位,占地下害虫总虫量的90%以上,是世界性一类难防治的地下害虫.目前我国防治蛴螬仍采用一些高毒高残84?河北农业科学第9卷留的化学农药作为主要手段,如3911和呋喃丹等,防治效果不是很理想,且使农产品的品质降低,限制了出口.因此,迫切需要转抗虫基因的草坪和马铃薯的研究,以达到持续有效控制的效果.另外,生产的Bt产品以及农产品还可以出口,增加我国产品在国际市场的占有份额,增强国际市场竞争力.为此,我们拟进行以下5个方面的研究:(1)对金龟子幼虫高毒的苏云金芽孢杆菌cr),基因的克隆及序列改造;(2)利用克隆及序列改造的c,),基因构建在草坪和马铃薯中表达载体;(3)向草坪草和马铃薯转化和表达;(4)转草坪和马铃薯的分子检测的研究;(5)金龟子幼虫的饲养及生物测定的研究.4.4转Bt杀虫蛋白基因枯草芽孢杆菌杀虫防病工程菌构建针对我国蔬菜上的灰霉病,白粉病和鳞翅目重要害虫,从我们自行分离的对鳞翅目害虫具高杀虫活性的苏云金杆菌G-03菌株中分离克隆其杀虫蛋白基因,通过电转化技术等,将杀虫毒蛋白基因导人对灰霉病和白粉病有特效的BS.208菌株中,使其发挥杀虫和防病的双重活性;并对杀虫防病工程菌的安全性,发酵工艺和剂型进行研究,为开发防治蔬菜灰霉病,白粉病和鳞翅目害虫的微生物农药奠定基础,具有重要的现实意义和广阔的应用前景.为此,我们拟进行以下5个方面的研究:(1)从苏云金杆菌G-03菌株中分离,克隆ICP基因;(2)对ICP基因的表达和活性进行检测;(3)ICP杀虫基因导人枯草芽孢杆菌BS一208及表达产物检}贝0;(4)对重组杀虫防病工程菌进行生物测定;(5)重组杀虫防病工程菌发酵工艺研究.参考文献:[1]顾宝根,姜辉.我国微生物农药的现状及问题[A].喻子牛.微生物农药及其产业化[c].北京:北京科学出版社,2000.13—20.[2]石渡繁胤.刺烈为一獯软化病(卒倒病)【:就[J].大日本蚕鲧会鞭,1901,104:1—5.[3]JacobsSE.Bacteriologicalcontroloftheflourmoth(Ephestiakuhniella)[J].ProcSocApp 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苏云金芽孢杆菌
• 很多问题也不是我这种小人物能说清楚的，
当然时间也不多。总之，我想说的是，关 注生活的点滴AND相信科学。
• 谢谢
个人认为关于基因漂流关于基因漂流近缘物种间通过花粉传播进行遗传物质基因近缘物种间通过花粉传播进行遗传物质基因的交流是一种普遍的自然现象不管是转基因的交流是一种普遍的自然现象不管是转基因作物还是非转基因作物的大面积种植都会发生作物还是非转基因作物的大面积种植都会发生近缘物种品种间的基因漂移基因漂移不是转近缘物种品种间的基因漂移基因漂移不是转基因作物特有的
关于基因漂流
• 近缘物种间通过花粉传播进行遗传物质（基因）
的交流，是一种普遍的自然现象，不管是转基因 作物还是非转基因作物的大面积种植，都会发生 近缘物种、品种间的基因漂移，基因漂移不是转 基因作物特有的。而对于一些重要的野生资源， 国家也都采取了相应的原地保护或异地保护策略。 因此，转基因作物的基因漂移问题是可以控制的。 同时，在自然群体中，如果没有长期的选择压力， 一些引入的低频率外来基因或性状，会在群体中 逐渐消失，这是群体遗传学的基本知识，换句话 说，即使偶然发生了转基因向相关物种的漂移， 这些外源基因也会逐渐从自然物种中消失。
当然，为追求科学的严谨性我们可以换一种表 达。1911年柏林纳从地中海粉螟的患病幼虫中 分离出苏云金芽胞杆菌，并依其发现地点德国 苏云金省而命名，简称Bt。
• Bt是产芽胞的革兰氏阳性土壤细菌，在菌
体的稳定生长期可形成伴胞晶体。每个伴 胞晶体又由一到多个杀虫晶体蛋白构成。 杀虫晶体蛋白又称δ-内毒素，即所谓的Bt 毒蛋白。
• 但是，当我们还在为农药残留而担忧的时
候，作为许许多多的安全的、可降解的生 物农药的一种，它早就在我们的身边了。
• 我觉得在生科院的各位面前，实在没有必
3种肠毒素基因在苏云金芽孢杆菌中的分布
福建农林大学学报(自然科学版)第34卷第3期Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Editi on)2005年9月3种肠毒素基因在苏云金芽孢杆菌中的分布黄必旺1,关春鸿1,邱思鑫2,关 雄1[1.生物农药与化学生物学教育部重点实验室(福建农林大学),福建福州350002;2.福建省农业科学院蔬菜研究中心,福建福州350013]摘要:采用PCR方法对引自美国俄亥俄州立大学芽孢杆菌遗传保存中心(BGSC)的45个苏云金芽孢杆菌(B t)进行了hbl A、bce T及ent S3种蜡状芽孢杆菌(B c)肠毒素基因的检测.结果表明,hbl A、bce T及ent S的检出率分别为60%、66.7%和44.7%.这45个准菌株涉及到44个B t亚种,说明B c肠毒素的基因在B t中是普遍存在的,B t的安全性问题仍需继续关注.关键词:苏云金芽孢杆菌;肠毒素基因;PCR中图分类号:S476+.11;Q781文献标识码:A文章编号:167125470(2005)0320339205D istr i buti on of three en terotox i n s genes i n B acillus thu ring iensisHUANG B i2wang1,G UAN Chun2hong1,Q I U Si2xin2,G UAN Xi ong1[1.Key Laborat ory of B i opesticide and Che m ical B i ol ogy(Fujian Agriculture and Forestry University),M inistry of Educati on, Fuzhou,Fujian350002,China;2.Vegetable Research Centre,Fujian Acade my of Agricultural Sciences,Fuzhou,Fujian350013, China]Abstract:The p resence of hemolysin Hbl A(Hbl A),enter ot oxin BecT(BecT)and enter ot oxin S(EntS)genes fr om45strains of B acillus thuringiensis(B t)were detected res pectively by poly merase chain reacti on(PCR).The results showed that60%B t strains contained hbl A gene sequences,66.7%and44.7%of the m contained becT and ent S genes sequences res pectively.These B t strains obtained fr om BGSC included44H2ser otypes,44ser ovars.Theref ore,the enter ot oxin genes p r oved p resent extensively in B t strains,suggesting that the potential risk of B t as a bi opestcide needs more attenti on.Key words:B acillus thuringiensis;enter ot oxin gene;PCR苏云金芽孢杆菌(B acillus thuringiensis,B t)与蜡状芽孢杆菌(B.cereus,B c)是2种高度近缘的细菌,但前者具有重要的经济价值,后者却与人类疾病紧密相关.B t与B c同属芽孢杆菌属蜡状芽孢杆菌组,虽然B t作为一个独立的种在《伯杰氏细菌手册》第7-9版中得到正式确认,然而,B t与B c具有相似的形态特征和较高的DNA同源性,B t与B c的区别仅仅在于前者在芽孢形成过程中能产生位于芽孢膜外的伴孢晶体,两者在G+C百分比、16S r RNA等方面都有高度的相似性[1-3].B t菌株含有多种质粒,杀虫基因大多定位在质粒上[4],B t在昆虫的体内和体外可以通过杀虫质粒的丢失而转化为B c,相反B c也可以通过DNA的细胞水平转移获得转化质粒而转化为B t.B t因可产生杀虫晶体蛋白而发展成为一种成功的微生物杀虫剂,广泛用于农林及卫生害虫的生物防治.B c是一种人类条件致病菌[5],它可以产生大量的胞外蛋白酶分解牛奶中的酪蛋白,影响牛奶工业,B c还产生胞外肠毒素、呕吐毒素造成食物中毒,危及人类健康.B c的肠毒素目前研究较深入的主要有溶血素BL(he molysin BL)、肠毒素T(enter ot oxin T)及非溶血肠毒素Nhe.溶血素BL从B c F837/76分离,由一个结合亚基B(分子质量为37.5ku)和2个溶血亚基L1 (38.2ku)与L2(43.5ku)组成,所有3个亚基都是其红细胞溶血活性所必需的[6],B亚基是由hbl A基因编码,该基因序列已被克隆和测序[7].肠毒素T为单一亚基的蛋白质,由bce T基因编码,同Hbl无同源性[8],而非溶血肠毒素Nhe也由3个亚基组成,但其结构及氨基酸顺序同Hbl有较高的相似性[9].另外, A sano et al[10]从B c菌株(B c F M1)中克隆了一个新的肠毒素基因en t F M,接着又以en t F M基因序列设计引物,从2个B t菌株(亚种为israelensis和sotto)中分别克隆了ent I和en t S2个肠毒素基因.分析ent S基因序收稿日期:2004-07-06 修回日期:2004-10-09基金项目:国家“863”高技术研究发展计划项目(2002AA245011);福建省自然科学基金资助项目(B0210032);福建省科技厅资助项目(2002N004,2001Z026).作者简介:黄必旺(1965-),助理研究员,博士.研究方向:杀虫微生物.列得知该基因含有完整的编码框,可编码一条45ku 的多肽.该基因的编码框与B c F M1菌株的肠毒素基因有很高的同源性,但对该基因的表达水平及肠毒素活性没有进一步报道.因B t 应用广泛,B t 的安全性问题一直是人们关注的问题.有研究表明,在B t 菌株中(包括一些商业化的菌株)广泛含有一些肠毒素基因;体外生物活性检测表明,B t 菌株在发酵过程中能产生一定活性的肠毒素[10-14].鉴于B t 与B c 之间极高的相似性以及B t 引起伤口感染和其它临床疾病,如角膜溃疡、肠胃炎、牙周炎等方面的报道[15-19],B t 对环境的安全性研究变得日益迫切.为了认识B t 对人类及高等动物是否具有潜在的致病性,检测其种群中不同亚种是否含有各类肠毒素基因是最快捷有效的方法之一.本研究采用PCR 方法对来自美国俄亥俄州立大学芽孢杆菌遗传保存中心(BGSC )的,大多数前人没有进行过肠毒素基因检测的47株B t 菌株的hbl A 、bce T 及ent S 3种肠毒素基因的分布进行了检测,为B t 的安全性评价及应用提供参考.1 材料与方法1.1 材料本试验所用45个B t 引自BGSC,其中大多数是前人没有进行肠毒素检测的菌株.1.2 方法1.2.1 DNA 模板的制备 将活化的B t 菌株接种于LB 平板,于30℃培养至对数期.取1环(直径为1.5mm )菌苔置于含有100μL 去离子水的Eppendorf 管中,混合均匀后置于100℃沸水中10m in 后迅速冷却.于12000r ・m in -1离心10m in,转移上清液至新的Eppendorf 管中,于-20℃保存备用.1.2.2 PCR 引物 用于PCR 检测的特异性溶血素(Hbl A )、肠毒素T (BecT )和肠毒素S 基因引物根据发表的3种肠毒素基因的核苷酸序列设计.合成的3组PCR 引物的序列、位置、预计扩增片断的大小和相关文献见表1.表1 肠毒素基因检测中应用的PCR 引物Table 1 PCR p ri m ers used f or detecti on of enter ot oxin gene in B t引物序列核苷酸的位置预计产物大小/bp文献Hbl15’-GCT AATGT AGTTCACCTGT AGCAAC 121-146874[13]Hbl25’-AATCATGCCACTGCGTGG ACAT AT AA 969-994BecT15’-TT ACATT ACCAGG ACGTGCTT 1354-1374428[10]BecT25’-TGTTTGTG ATTGT AATTCAGG 1761-1781Ent15’-GTTTCGTT AG AT ACAGCAG AACCACC 19-46581[10]Ent25’-GGTTT AGCAGCAGCTTCTGT AGCTGGGG574-5991.2.3 PCR 体系 供试的PCR 试剂均购自宝生物工程有限公司(T AK ARA ),PCR 仪型号为B I O 2RAD Gene Cycler T M.反应条件:95℃预变性5m in;95℃变性1m in,55℃复性1m in,72℃延伸3m in,35个循环;72℃延伸10m in .阳性对照菌为HD1(引自BGSC ),阴性对照为不加DNA 模板,以去离子水代替.1.2.4 PCR 产物电泳检测 PCR 产物用7g ・L -1琼脂糖进行电泳分析.取10μL 样品点样,电泳缓冲液为1×T AE,电压恒定120V 电泳1h .用B i o 2Rad Gel Doc 2000凝胶成像仪成像.2 结果与分析2.1 hbl A 基因的PCR 检测采用溶血素BL 基因特异性引物(Hbl1/Hb12),对45个引自BGSC 的菌株进行了PCR 检测,其中27个菌株扩增出了874bp 的特异性片段,阳性检出率为60%(图1A ).2.2 en t S 基因的PCR 检测用特异性的ent S 引物,对45个B t 菌株进行检测,有20个菌株检出581bp 的特异性DNA 片段,ent S 基因检出率为44.4%(图1B ).2.3 bce T 基因的PCR 检测用肠毒素T 基因特异性引物(BecT1/BecT2),可以从30个菌株中扩增出428bp 的肠毒素T 基因片・043・福建农林大学学报(自然科学版)第34卷段,bec T 基因的阳性检出率为66.7%(图2).M.DNA 分子质量标准;1.阳性对照;2.阴性对照;3-47分别为4CC1、4BH1、4C1、4Q1、4H2、4BR1、4AZ1、4BQ1、4AH1、4BV1、4BK1、4K1、4AP1、4P1、4BN1、4BZ1、4BA1、4BY1、4AO1、4AX1、4CE1、4BL1、4B1、4BM1、4BS1、4R1、4BX1、4O1、4AG1、4BU1、4AL1、4M1、4D2、4CA1、4A3、4J4、4AJ1、4CD1、4BW1、4E3、4AM1、4A5、4F4、4CB1、4L3.图1 B t 溶血素hbl A 基因和en t S 基因的PCR 扩增图谱Fig .1 PCR amp lificati on patterns with p ri m ers Hbl1/Hbl2(A ),Ent1/Ent2(B)M.DNA 分子质量标准;1.阳性对照;2.阴性对照;3-48分别为4BY1、4AO1、4AX1、4CE1、4BL1、4B1、4BM1、4BS1、4R1、4BX1、4O1、4AG1、4BU1、4AL1、4M1、4CC1、4BH1、4C1、4Q1、4H2、4BR1、4AZ1、4BQ1、4AH1、4BV1、4BK1、4K1、4AP1、4P1、4BN1、4BZ1、4BA1、阳性对照、4D2、4A3、4CA1、4J4、4AJ1、4CD1、4BW1、4E3、4AM1、4A5、4F4、4CB1、4L3.图2 B t 肠毒素bce T 基因PCR 扩增图谱Fig .2 PCR amp lificati on patterns with p ri m ers BceT1/BceT2 3种肠毒素基因在45个B t 菌株中的分布如表2所示.由表2可知:在被检测的45个菌株中只有10个没有检测到任意一种肠毒素基因;12个菌株含有3种肠毒素基因.说明3种B c 的肠毒素基因在B t 中是普遍存在的.表2 45个B t 菌株中肠毒素基因的分布1)Table 2 D istributi on of enter ot oxin gene in B t standard strains BGSC 编号亚种菌株血清型hbl A ent S bce T4CC1pulsiensis NARC B t 1765---4BH1chanpaisis JC5146---4C1alesti HD163a 、3c -++4Q1israelensis HD56714-++4H2canadensis HD2245a 、5c +++4BR1poloniensis Pbt2354+++4AZ1nigeriensis T08B0018b 、8d +-+4BQ1asturiensis E A3459453+++4AH I konkukian HL4734---4BV1argentinensis A2058---4BK1balearica P M948--+4K1m orrisoni HD128a 、8b +++4AP1fukuokaensis T03C0013a 、3d 、3e -++4P1pakistaniHD39513+-+・143・第3期黄必旺等:3种肠毒素基因在苏云金芽孢杆菌中的分布(续表2) BGSC 编号亚种菌株血清型hbl A ent S bce T4BN1xiaguangiensis 339751---4BZ1zhaodongensis HZ39-0462+-+4BA1pondicheriensis T20A00120a 、20c +--4BY1sylvestriensis Pbt5361---4AO1sum iyoshiensis T03B0013a 、3d -++4AX1novosibirsk T24A00124a 、24c +++4CE1vazensis E A1469667+++4BL1m uj u A3949---4B1finiti m us HD1912---4BM1navarrensis NA6950---4BS1pal m anyolensis E A4069455+++4R1dakota Oats4315+++4BX1pingluonsis NXP15-0460-+-4O1tho m psoni HD54212+++4AG1silo S LM5.A 26++-4BU1pirenaica NA21057+-+4AL1coreanensis HL125+++4M1dar m stadiensis HD146(103)10a 、10b +++4D2kurstaki 23a 、3b 、3c --+4CA1yosoo HL9418a 、18c +-+4A3thuringiensis HD21+++4J4aizaw ai/pacificus HD117+++4AJ1m onterrey G M3328a 、28b ++-4CD1graciosensis E A1519666---4BW1ibericaL6059+-+4E3sotto /dendroli m us s ott o 4a 、4b +++4AM1yunnanensis T2000120a 、20b +-+4A5thuringiensis HD141---4F4kenyae HD5604a 、4c ---4CB1azorensis E A1199664+++4L3tol w orthiHD5379+-+ 1)“+”为PCR 阳性,“-”为PCR 阴性.3 讨论本试验所选的45个菌株涉及到44个亚种、44种血清型.在合适的条件下,用特异性的肠毒素引物对供试B t 菌株进行肠毒素PCR 检测.结果表明,大部分B t 都含有2-3种不同的肠毒素基因.张文成等[12]对引自法国巴斯德研究所的45个标准菌株及15个生产菌株进行了hbl A 和bce T 2种肠毒素基因的检测,结果显示,标准菌株中含hbl A 基因的占66.6%,含bce T 基因的占64.4%,生产菌株中有86.6%的菌株含有bce T 基因.袁志明等[11]对来源不同的45个B t 菌株进行肠毒素检测,hbl A 、bce T 及ent S 的检出率都在90%以上.本试验的菌株来源于BGSC,其中大多数是前人没有进行肠毒素检测的菌株,这说明肠毒素基因在B t 种群中有广泛的分布.B t 含有肠毒素基因,采用商品化的B c 肠毒素免疫检测试剂盒对B t 的检测也表明,在B t 的营养生长阶段会产生肠毒素[10].然而,B t 制剂的大规模商业应用已有几十年的历史,这期间并没有因B t 制剂的应用而引起的人类健康问题的报道,在临床上也少有感染和引起食物中毒记录,说明B t 制剂具有较高的安全性.但是如何解释肠毒素在B t 中广泛分布这一现象呢?可能的原因如下:(1)B t 肠毒素基因序列和氨基酸序列与B c 的有差异性,使其肠毒素的活性较低,不能使人致病.本实验室曾克隆了B t 8010的ent 基因(另文发表),发现该基因虽与B c 肠毒素基因有很高的同源性,但对该基因序列分析发现,该基因有一段序列缺失,不含完整的编码框.(2)B t 肠毒素的表达受各种调控因子的作用而不能表达或者表达减弱.最近有报道证实,B t 及其它B c 组的细菌含有P lc R 基因,该基因对酯酶、溶血素等细胞外分泌蛋白的表达具有调节作用,P lc R 基因内部的突变会导致毒素不能产生[20-22].(3)由B t 引起的感染和中毒被误检为・243・福建农林大学学报(自然科学版)第34卷B c[17].(4)B t 芽孢不能在人和高等动物的小肠内萌发和生长,或不能产生足够量的肠毒素.因此,对于B t肠毒素对人和高等动物的安全性还需在毒素产生的水平及危害剂量等方面作进一步深入研究.参考文献:[1]CARLS ON C R,K OLSTE A B.A Comp lete physical map of a B acillus thuringiensis chr omos ome [J ].J Bacter i ol 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