植物激活蛋白的分离_纯化及等电点的的测定

第24卷　第4期《新疆师范大学学报》(自然科学版)V ol.24,N o.4 2005年12月Jour nal o f Xinjiang N or mal U niver sity Dec.2005

(N atural Sciences Edition)

植物激活蛋白的分离、纯化及等电点的的测定

仲新华1,　邱德文2,　王纯利1,　刘　铮2

(1.新疆农业大学,新疆乌鲁木齐830052;2.中国农业科学院环境与可持续发展研究所,北京,100081)

摘要:文章主要介绍首次从真菌中提取的植物激活蛋白是一种高效、多功能、广谱性、能诱导植物对病虫害产生免疫抗性的新型植物诱导物质,通过分离纯化该蛋白,可以为下一步的活性检测,序列测定及基因克隆打下良好的基础。

关键词:植物激活蛋白;离子交换层析;分子筛;等电点

中图分类号:　O629.3 文献标识码:　A 文章编号:　1008-9659-(2005)-04-0065-04

植物激活蛋白主要通过激活植物体内分子免疫系统,提高植物自身免疫力,通过激发植物体内的一系列代谢调控,促进植物根茎叶生长和提高叶绿素含量,从而达到提高作物产量的目的。中国农科院环境与发展研究所蛋白质药物工程实验室对其作用机理进行了初步研究,推测其机理可能为:来源于真菌的42-62K D 的一类信号传导分子,可通过不同的代谢途径实现信号传导,引起基因表达,激活植物自身防御系统和生长系统,提高植物自身免疫力,通过调节植物生长代谢系统,促进植物生长,提高作物产量和产品品质。本实验在分离纯化植物激活蛋白的基础上,采用等电点聚焦电泳测定了该蛋白质的等电点,为进一步得到结晶及研究该蛋白的结构建立了坚实的基础,并对于下一步的活性检测,序列测定及基因克隆具有重要意义。

1　实验材料

1.1　A lternaria ap p菌株系中国农业科学院环境与可持续发展研究所蛋白质药物工程实验室保存并提供;

1.2　蛋白纯化仪型号A K T A exp lor er10,离子柱是H itrap TM Q FF1ml,H itrap T M DE AE FF1ml,脱盐柱是

H itrap TM26/10Desalting5ml,分子筛是Sep hacry lS-100,均为瑞典A mer sham公司产品;等电聚焦仪R oto-f or cell及S DS-聚丙烯酰胺凝胶电泳均为Bid-red公司产品;A micon Ultra10K D超滤管为北京华美公司产品;

1.3　低分子量标准蛋白由北京江晨公司提供,其余试剂均为分析纯。

2　实验方法

2.1　粗蛋白的提取

将培养好的交链胞菌液用真空抽滤器抽成菌块,于研钵中用液氮研磨成细粉,迅速加入0.05mol/L磷酸提取缓冲液并混合均匀,于沸水浴中煮沸20min后,迅速投入到冰水混合物中,降温后在高速冷冻离心机上以12000rp m离心15min,上清液用微孔过滤器过滤,再分装到1m l离心管中,取一管作S DS-P A GE电泳检测,然后用Bid-Rad公司的电泳回收装置做胶回收,其余置-20℃冰箱中冷冻保存。

2.2　硫酸铵分级沉淀

[收稿日期]2005-6-19

[作者简介]仲新华(1965-),女,汉族,新疆库尔勒人,工程师,主要从事环境微生物的研究工作。

先用10%(W/V)浓度的硫酸铵在0℃条件下沉淀粗蛋白半个小时,4℃下10000rp m离心30min,取上清,加入硫酸铵至50%(W/V),在0℃条件下沉淀半个小时,4℃下10000rp m离心30min,取沉淀,提取液溶解后过脱盐柱。

2.3　植物激活蛋白的纯化

2.3.1　过离子柱

选用柱子为H iT rap Q F F1ml,先用5倍体积的0.2mol/Lp H4.0的醋酸缓冲液平衡离子柱,直到达到平衡为止,选用脱盐后获得的蛋白经12000转离心10min,取上清液上柱,流速:1ml/min,淋洗至基线,再用含2mol/L K CL 的相同缓冲液进行梯度洗脱,用自动收集器收集,每管收集1.5ml,合并各梯度洗脱峰,再分别通过Desalting5ml脱盐柱,然后再合并各峰,冷冻干燥后经S DS-PA GE电泳检测是否有目的蛋白条带。

2.3.2　Sep hacrylS-100分子筛层析

取2.3.1得到的含有目的条带的蛋白组分1ml加入用同样的缓冲液预平衡过的Sep hacry lS-100上过滤,流速为1.0ml/min。检测A280nm值后收集不同组分,超滤后冷冻干燥备用。

2.3.3　纯度检测

取经上述步骤纯化后得到的含目的条带的蛋白液与已知分子量的标准蛋白样品一起进行SDS-P A GE 分析,方法参照郭尧君《蛋白质电泳实验技术》进行,分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度为5%,电泳后凝胶用考马斯亮蓝R250染色。

2.4　等电点聚焦电泳参照B id-R ad公司产品说明书。

2.5　N端序列分析SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后(SDS-P A GE)去除浓缩胶,将凝胶和PV DF膜分别在CA P S 缓冲液中浸泡20分钟,采用Bid-Rad公司的Semi-Dry Tr ansf er Cell装置,以20V恒压1小时,将蛋白质从凝胶电转移到P VDF膜上,将滤膜置于100%甲醇中润湿几秒钟后在染色液中浸泡1分钟,50%甲醇脱色至蛋白条带清楚显现并在超纯水中漂洗后自然晾干,N端氨基酸序列测定由上海基康测序公司完成。

3　结果与分析

图1　粗提蛋白的聚丙烯酰铵凝胶电泳图3.1　粗蛋白的提取粗提蛋白经SDS-PA GE电泳检测结果显示:A lternar-ia app.菌株能分泌一种42K D左右的蛋白质,如图1所示。

3.2　硫酸铵分级沉淀　在硫酸铵沉淀粗蛋白的过程中发现:蛋白液在不同饱和度硫酸铵中的百分含量有较大的变化,在10%基本没有沉淀,20%左右42K D蛋白明显增加且杂蛋白明显减少,30～40%饱和度区间,沉淀物中均含有42kD左右的蛋白条带,但杂蛋白也明显增加;50～80%饱和区间内,沉淀物中42kD蛋白浓度明显减少,而且杂蛋白明显增加;90～100%饱和区间内,沉淀物中基本没有42kD蛋白条带,由此可见,42kD蛋白集中在一定的沉淀范围而不是弥散在整个硫酸铵浓度范围内,可以利用硫酸铵分级沉淀植物激活蛋白粗体液,除去大量杂蛋白,根据实验结果,确定适宜42kD蛋白的硫酸铵沉淀范围为10～20%。

3.3　植物激活蛋白的纯化　将硫酸铵沉淀、脱盐后的样品经过H itrap TM Q FF1ml离子交换柱(0.02M醋酸缓冲液,p H

4.0),2M K Cl线型洗脱后得到

一个穿透峰和三个洗脱峰D1、D2和D3,S DS-PA GE电泳检测发现目的蛋白质主要集中在第一个洗脱峰D1上(图3),收集D1脱盐、冷冻干燥及离心后,其上清液上Sep hacry lS-100柱,,得三个峰(图4),收集第1、

2、3峰后冷冻干燥,分别经S DS-P A GE电泳检测,显示为1峰为42K D单一条带(图5)

3.4　激活蛋白等电点的测定　用等电点聚焦电泳测定激活蛋白的等电点(电泳图谱示于图6),其中42K D 的p I为3.06,说明42K D蛋白是一种酸性蛋白。

3.5　植物激活蛋白的42K D N端氨基酸序列两次测序结果均N端封闭。

66新疆师范大学学报(自然科学版)2005年