植物激活蛋白的分离_纯化及等电点的的测定
蛋白质等电点的测定 ppt课件
2020/11/13
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主要内容
(1)了解蛋白质的两性解离性质。 (2)学习测定蛋白质等电点的方法。
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精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
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• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
蛋白质的解离性质
• 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中 存在下列平衡：
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蛋白质的等电点
• 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液 的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值 时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等， 在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不 向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋 白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的 等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质 都有变化，可利用此种性质的变化测定各 种蛋白质的等电点。
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3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在 凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶 与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注 入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条 即可流出。
4 .固定染色
取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝 胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒 掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次 后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端 的距离。
植物激活蛋白的分离_纯化及等电点的的测定
第24卷 第4期《新疆师范大学学报》(自然科学版)V ol.24,N o.4 2005年12月Jour nal o f Xinjiang N or mal U niver sity Dec.2005(N atural Sciences Edition)植物激活蛋白的分离、纯化及等电点的的测定仲新华1, 邱德文2, 王纯利1, 刘 铮2(1.新疆农业大学,新疆乌鲁木齐830052;2.中国农业科学院环境与可持续发展研究所,北京,100081)摘要:文章主要介绍首次从真菌中提取的植物激活蛋白是一种高效、多功能、广谱性、能诱导植物对病虫害产生免疫抗性的新型植物诱导物质,通过分离纯化该蛋白,可以为下一步的活性检测,序列测定及基因克隆打下良好的基础。
关键词:植物激活蛋白;离子交换层析;分子筛;等电点中图分类号: O629.3 文献标识码: A 文章编号: 1008-9659-(2005)-04-0065-04植物激活蛋白主要通过激活植物体内分子免疫系统,提高植物自身免疫力,通过激发植物体内的一系列代谢调控,促进植物根茎叶生长和提高叶绿素含量,从而达到提高作物产量的目的。
中国农科院环境与发展研究所蛋白质药物工程实验室对其作用机理进行了初步研究,推测其机理可能为:来源于真菌的42-62K D 的一类信号传导分子,可通过不同的代谢途径实现信号传导,引起基因表达,激活植物自身防御系统和生长系统,提高植物自身免疫力,通过调节植物生长代谢系统,促进植物生长,提高作物产量和产品品质。
本实验在分离纯化植物激活蛋白的基础上,采用等电点聚焦电泳测定了该蛋白质的等电点,为进一步得到结晶及研究该蛋白的结构建立了坚实的基础,并对于下一步的活性检测,序列测定及基因克隆具有重要意义。
1 实验材料1.1 A lternaria ap p菌株系中国农业科学院环境与可持续发展研究所蛋白质药物工程实验室保存并提供;1.2 蛋白纯化仪型号A K T A exp lor er10,离子柱是H itrap TM Q FF1ml,H itrap T M DE AE FF1ml,脱盐柱是H itrap TM26/10Desalting5ml,分子筛是Sep hacry lS-100,均为瑞典A mer sham公司产品;等电聚焦仪R oto-f or cell及S DS-聚丙烯酰胺凝胶电泳均为Bid-red公司产品;A micon Ultra10K D超滤管为北京华美公司产品;1.3 低分子量标准蛋白由北京江晨公司提供,其余试剂均为分析纯。
蛋白质等电点的测定实验报告
蛋白质等电点的测定实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过离子交换色谱法测定蛋白质的等电点，探究蛋白质在不同 pH 条件下的电荷状态变化，进而确定蛋白质的等电点。
二、实验原理。
蛋白质的等电点是指蛋白质在溶液中呈电中性的 pH 值。
在等电点条件下，蛋白质的带电量最小，导致其在电场作用下停止迁移。
本实验采用离子交换色谱法，利用色谱柱对蛋白质在不同 pH 条件下的迁移情况进行监测，从而确定蛋白质的等电点。
三、实验步骤。
1. 将色谱柱连接至色谱仪，并进行平衡处理；2. 取一定浓度的蛋白质溶液，分别调节 pH 值至不同条件下；3. 将不同 pH 条件下的蛋白质溶液加入色谱柱，进行色谱分离；4. 监测蛋白质在色谱柱中的迁移情况，记录不同 pH 条件下的保留时间；5. 根据实验数据绘制蛋白质的等电点曲线，确定蛋白质的等电点。
四、实验数据及结果分析。
通过实验数据处理和分析，我们得到了不同 pH 条件下蛋白质的保留时间，绘制出了蛋白质的等电点曲线。
通过曲线的交叉点，我们可以确定蛋白质的等电点为X。
五、实验结论。
根据实验结果，我们成功测定出了蛋白质的等电点为 X。
这一结果对于进一步研究蛋白质的性质和功能具有重要意义。
六、实验总结。
本实验通过离子交换色谱法测定蛋白质的等电点，取得了较好的实验结果。
然而，在实验过程中仍然存在一些问题，例如实验操作的精度和准确度有待提高。
未来我们将进一步完善实验方法，提高实验数据的可靠性和准确性。
七、参考文献。
1. Smith, A. B., & Jones, C. D. (2017). A review of protein isoelectric focusing: methods, applications, and advances. Critical Reviews in Biotechnology, 37(4), 399-408.2. Wang, L., & Smith, R. (2019). Determination of protein isoelectric point by capillary isoelectric focusing. Journal of Chromatography A, 1601, 132-137.八、致谢。
植物激活蛋白在蔬菜中的应用现状研究
２０ ００年邱 德文 博 士从 植 物 病 原 真 菌 中提 取 获
得 一类 新 型蛋 白质 ，经 氨 基 酸 和 核 酸序 列 分 析 表
通过 与植 物受 体 蛋 白的相互 作 用 ，诱 导植物 的 信号 传导 ，激 活植 物 的一 系列代 谢 调控 反应 ， 目前 的研 究 证 明 ， 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 （Ａ ） 过 氧 化 物 酶 Ｐ Ｌ、
３ ． 引植和恢 复经 济类 水 生植物 ，通过试 验 种植 ．１ ４ 藕莲 、菱 角、芦 苇等 具有 较 高经济 价值 的湿 生 、水
生 植 物 ，提 高 水 生 植物 收 割 和 利 用 率 ，转 移 水 体
氮 、磷 等营 养盐 ， 降解污 染物 质 ，抑制 藻类 过 度生
长 ，净 化水 质 。 ３ ． 开展 渔业 增殖 放流 ，通 过科 学选 择 、合 理搭 ．２ ４ 配放养 草食 性 、滤食 性种 类摄 食水 草 、消耗 浮游 生
化 ，从 而达 到改 善水域 生态环 境 。
ห้องสมุดไป่ตู้
结构 设计 ，充 分利 用 当地 天然 生物物 种 ，慎 重 引进
外 来 种 ，提 高 衡 水 湖 水 体 自净 能力 和 自我 修 复 能
力。
参考 文献
３５ 利 用 生 态 补 水 。在 对 污 染 源 进 行 控 制 的 前 提 ． 下 ， 实施 生 态 补 水 ，并 力 争变 应 急补 水 为 常 规 补 水 ，引清 水入 湖 ，加大 水 资源调 度 ，增 加经 常性 下 泄量 ，以稀释水 体 ，迅速 有效 地改 善水质 。 ３６ 利 用 疏 浚 作业 。对 沉 积 较 深 的污 染 底 泥 ，采 ．
植物 自身 的防御 系 统 ，启动 植物 体 内一 系列 的代 谢 反应 ，最终加 强植 物对 病 原物 的抗性 或免疫 力 。
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定(共14张PPT)
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
新型真菌源激活蛋白的分离纯化及生物功能的研究的开题报告
新型真菌源激活蛋白的分离纯化及生物功能的研究的开题
报告
一、研究背景和意义
真菌是一类重要的微生物资源，其代谢产物具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种活性。
真菌源激活蛋白（FAPs）是一类新型的生物活性蛋白，具有抗肿瘤、抗炎症、免疫调节等多种生物学功能。
FAPs是由真菌生产的一类蛋白质，具有多种活性，但其生物合成机制尚不完全清楚。
因此，我们需要深入研究FAPs的结构和生物活性，为真菌代谢产物的开发和利用提供有力支持。
二、研究目的
本课题的研究目的是通过分离纯化和生物学功能的研究，探索FAPs的结构和生物活性，为其在生物制药、食品添加剂和农业等领域的应用提供理论和实验基础。
三、研究内容和方法
1. FAPs的分离纯化
本次研究将以优良生产菌株为基础，在其代谢产物中筛选出含有FAPs的菌株，并通过分离、纯化提取目标蛋白质。
其中，离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等技术将被运用。
2. FAPs的生物学功能研究
本次研究将采用多种技术手段，如质谱分析、基础生物学试验、免疫学实验、肿瘤模型等，对FAPs的生物学功能进行研究，探索其抗炎、免疫调节、促进细胞增殖和凋亡的生物学作用机制。
四、预期成果和意义
通过本次研究，我们将获取到高纯度的FAPs，探索其结构和生物学功能，为真菌代谢产物的开发应用提供新思路和新途径。
在免疫学、肿瘤学、生物制药等领域，FAPs具有广阔的应用前景，有望成为新型的生物学药物和食品添加剂，在促进人类健康、推动经济发展等方面发挥重要作用。
伞形科植物叶片中蛋白质的分离与纯化及利用
伞形科植物叶片中蛋白质的分离与纯化及利用SDS-PAGE电泳法测定相对分子质量生物工程09（2）班张翔指导老师：张芬琴（甘肃省河西学院生命科学与工程系734000）摘要：分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定的比例与蛋白质分子结合成为带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决与分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子质量的对数对迁移率所作的标准曲线来求得未知蛋白质的相对分子质量。
关键词：伞形科植物；叶片；蛋白质；分离；电泳法引言:20世纪60年代Shapiro建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法之后，Weber，Glossmann和Douglas等人进行了多次改进，已显示出了在分离、鉴定和纯化蛋白质方面的优越性，但对于M r小于10000的蛋白质来说是无能为力的［1］. 20世纪80年代初Sch%26auml;gger等［2］应用脲分离蛋白质复合体亚单位的11种蛋白质，但分离效果不甚理想且重复性较差.之后他们又进行了系统地研究和摸索，能够分离较大M r范围内的蛋白质.随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现，具有高生物活性的小分子多肽的分离、纯化和鉴定已显得尤为突出.我们在进行基因工程药物的开发研制中，对SDS-PAGE方法进行了多次改进，在较低的丙烯酰胺浓度下取得了理想的结果.此法所需仪器简单，操作方便，重现性好，时间短，只需微克量的蛋白质便可显带且能迅速估计出其M r，值得进一步推广和利用.材料和方法：1.1试剂Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，30 mM Tris-HCl (pH8.0)9, （含0.1 mM EDTA, 6mM Ascorbic acid，5 mM MgCl2)混匀。
蛋白质等电点的测定实验报告
蛋白质等电点的测定实验报告一、实验目的1、了解蛋白质等电点的概念及其重要性。
2、掌握测定蛋白质等电点的基本原理和方法。
3、学会使用酸度计等仪器进行实验操作。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在溶液中会发生解离。
当蛋白质溶液处于某一 pH 值时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（pI）。
在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易沉淀析出。
利用这一性质，可以通过调节溶液的 pH 值，使蛋白质沉淀，从而测定蛋白质的等电点。
本实验采用醋酸纤维素薄膜电泳法来测定蛋白质的等电点。
醋酸纤维素薄膜具有均一的微孔结构，对蛋白质分子的吸附作用小，电泳时泳动速度快，分辨率高。
在一定的电场强度下，不同 pH 值的缓冲溶液中，蛋白质分子会向与其所带电荷相反的电极方向移动。
当溶液的 pH值等于蛋白质的等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，泳动速度为零。
三、实验材料与仪器1、材料新鲜鸡蛋醋酸纤维素薄膜巴比妥缓冲液（pH 86、pH 74、pH 64、pH 54）蛋白质染色液（氨基黑 10B）漂洗液2、仪器电泳仪酸度计培养皿镊子剪刀直尺四、实验步骤1、醋酸纤维素薄膜的处理将醋酸纤维素薄膜剪成 2×8cm 的小条，在巴比妥缓冲液（pH 86）中浸泡 30 分钟，使其充分浸透。
用镊子取出薄膜，用滤纸吸干多余的缓冲液。
2、点样用毛细管吸取少量鸡蛋清样品，在薄膜的无光泽面距一端 15cm 处轻轻点样，点样宽度不超过 05cm。
3、电泳将点样后的薄膜光滑面朝下，搭在电泳槽的支架上，两端分别与电泳槽的正、负极相连。
在电泳槽中加入巴比妥缓冲液（pH 86），使薄膜完全浸没在缓冲液中。
接通电源，调节电压为 160V，电泳 40 分钟。
4、染色与漂洗电泳结束后，将薄膜取出，放入氨基黑 10B 染色液中染色 10 分钟。
取出薄膜，放入漂洗液中漂洗数次，直至背景无色，蛋白质条带清晰可见。
5、测定 pH 值分别配制 pH 74、pH 64、pH 54 的巴比妥缓冲液。
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第24卷 第4期《新疆师范大学学报》(自然科学版)V ol.24,N o.4 2005年12月Jour nal o f Xinjiang N or mal U niver sity Dec.2005(N atural Sciences Edition)植物激活蛋白的分离、纯化及等电点的的测定仲新华1, 邱德文2, 王纯利1, 刘 铮2(1.新疆农业大学,新疆乌鲁木齐830052;2.中国农业科学院环境与可持续发展研究所,北京,100081)摘要:文章主要介绍首次从真菌中提取的植物激活蛋白是一种高效、多功能、广谱性、能诱导植物对病虫害产生免疫抗性的新型植物诱导物质,通过分离纯化该蛋白,可以为下一步的活性检测,序列测定及基因克隆打下良好的基础。
关键词:植物激活蛋白;离子交换层析;分子筛;等电点中图分类号: O629.3 文献标识码: A 文章编号: 1008-9659-(2005)-04-0065-04植物激活蛋白主要通过激活植物体内分子免疫系统,提高植物自身免疫力,通过激发植物体内的一系列代谢调控,促进植物根茎叶生长和提高叶绿素含量,从而达到提高作物产量的目的。
中国农科院环境与发展研究所蛋白质药物工程实验室对其作用机理进行了初步研究,推测其机理可能为:来源于真菌的42-62K D 的一类信号传导分子,可通过不同的代谢途径实现信号传导,引起基因表达,激活植物自身防御系统和生长系统,提高植物自身免疫力,通过调节植物生长代谢系统,促进植物生长,提高作物产量和产品品质。
本实验在分离纯化植物激活蛋白的基础上,采用等电点聚焦电泳测定了该蛋白质的等电点,为进一步得到结晶及研究该蛋白的结构建立了坚实的基础,并对于下一步的活性检测,序列测定及基因克隆具有重要意义。
1 实验材料1.1 A lternaria ap p菌株系中国农业科学院环境与可持续发展研究所蛋白质药物工程实验室保存并提供;1.2 蛋白纯化仪型号A K T A exp lor er10,离子柱是H itrap TM Q FF1ml,H itrap T M DE AE FF1ml,脱盐柱是H itrap TM26/10Desalting5ml,分子筛是Sep hacry lS-100,均为瑞典A mer sham公司产品;等电聚焦仪R oto-f or cell及S DS-聚丙烯酰胺凝胶电泳均为Bid-red公司产品;A micon Ultra10K D超滤管为北京华美公司产品;1.3 低分子量标准蛋白由北京江晨公司提供,其余试剂均为分析纯。
2 实验方法2.1 粗蛋白的提取将培养好的交链胞菌液用真空抽滤器抽成菌块,于研钵中用液氮研磨成细粉,迅速加入0.05mol/L磷酸提取缓冲液并混合均匀,于沸水浴中煮沸20min后,迅速投入到冰水混合物中,降温后在高速冷冻离心机上以12000rp m离心15min,上清液用微孔过滤器过滤,再分装到1m l离心管中,取一管作S DS-P A GE电泳检测,然后用Bid-Rad公司的电泳回收装置做胶回收,其余置-20℃冰箱中冷冻保存。
2.2 硫酸铵分级沉淀[收稿日期]2005-6-19[作者简介]仲新华(1965-),女,汉族,新疆库尔勒人,工程师,主要从事环境微生物的研究工作。
先用10%(W/V)浓度的硫酸铵在0℃条件下沉淀粗蛋白半个小时,4℃下10000rp m离心30min,取上清,加入硫酸铵至50%(W/V),在0℃条件下沉淀半个小时,4℃下10000rp m离心30min,取沉淀,提取液溶解后过脱盐柱。
2.3 植物激活蛋白的纯化2.3.1 过离子柱选用柱子为H iT rap Q F F1ml,先用5倍体积的0.2mol/Lp H4.0的醋酸缓冲液平衡离子柱,直到达到平衡为止,选用脱盐后获得的蛋白经12000转离心10min,取上清液上柱,流速:1ml/min,淋洗至基线,再用含2mol/L K CL 的相同缓冲液进行梯度洗脱,用自动收集器收集,每管收集1.5ml,合并各梯度洗脱峰,再分别通过Desalting5ml脱盐柱,然后再合并各峰,冷冻干燥后经S DS-PA GE电泳检测是否有目的蛋白条带。
2.3.2 Sep hacrylS-100分子筛层析取2.3.1得到的含有目的条带的蛋白组分1ml加入用同样的缓冲液预平衡过的Sep hacry lS-100上过滤,流速为1.0ml/min。
检测A280nm值后收集不同组分,超滤后冷冻干燥备用。
2.3.3 纯度检测取经上述步骤纯化后得到的含目的条带的蛋白液与已知分子量的标准蛋白样品一起进行SDS-P A GE 分析,方法参照郭尧君《蛋白质电泳实验技术》进行,分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度为5%,电泳后凝胶用考马斯亮蓝R250染色。
2.4 等电点聚焦电泳参照B id-R ad公司产品说明书。
2.5 N端序列分析SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后(SDS-P A GE)去除浓缩胶,将凝胶和PV DF膜分别在CA P S 缓冲液中浸泡20分钟,采用Bid-Rad公司的Semi-Dry Tr ansf er Cell装置,以20V恒压1小时,将蛋白质从凝胶电转移到P VDF膜上,将滤膜置于100%甲醇中润湿几秒钟后在染色液中浸泡1分钟,50%甲醇脱色至蛋白条带清楚显现并在超纯水中漂洗后自然晾干,N端氨基酸序列测定由上海基康测序公司完成。
3 结果与分析图1 粗提蛋白的聚丙烯酰铵凝胶电泳图3.1 粗蛋白的提取粗提蛋白经SDS-PA GE电泳检测结果显示:A lternar-ia app.菌株能分泌一种42K D左右的蛋白质,如图1所示。
3.2 硫酸铵分级沉淀 在硫酸铵沉淀粗蛋白的过程中发现:蛋白液在不同饱和度硫酸铵中的百分含量有较大的变化,在10%基本没有沉淀,20%左右42K D蛋白明显增加且杂蛋白明显减少,30～40%饱和度区间,沉淀物中均含有42kD左右的蛋白条带,但杂蛋白也明显增加;50～80%饱和区间内,沉淀物中42kD蛋白浓度明显减少,而且杂蛋白明显增加;90～100%饱和区间内,沉淀物中基本没有42kD蛋白条带,由此可见,42kD蛋白集中在一定的沉淀范围而不是弥散在整个硫酸铵浓度范围内,可以利用硫酸铵分级沉淀植物激活蛋白粗体液,除去大量杂蛋白,根据实验结果,确定适宜42kD蛋白的硫酸铵沉淀范围为10～20%。
3.3 植物激活蛋白的纯化 将硫酸铵沉淀、脱盐后的样品经过H itrap TM Q FF1ml离子交换柱(0.02M醋酸缓冲液,p H4.0),2M K Cl线型洗脱后得到一个穿透峰和三个洗脱峰D1、D2和D3,S DS-PA GE电泳检测发现目的蛋白质主要集中在第一个洗脱峰D1上(图3),收集D1脱盐、冷冻干燥及离心后,其上清液上Sep hacry lS-100柱,,得三个峰(图4),收集第1、2、3峰后冷冻干燥,分别经S DS-P A GE电泳检测,显示为1峰为42K D单一条带(图5)3.4 激活蛋白等电点的测定 用等电点聚焦电泳测定激活蛋白的等电点(电泳图谱示于图6),其中42K D 的p I为3.06,说明42K D蛋白是一种酸性蛋白。
3.5 植物激活蛋白的42K D N端氨基酸序列两次测序结果均N端封闭。
66新疆师范大学学报(自然科学版)2005年图2 粗提蛋白经不同饱和度硫酸铵沉淀后的聚丙烯凝胶电泳图图3 H itrap T M Q F F 1ml离子交换层析图4 Sep hacrylS -100分子筛层析67第4期仲新华等: 植物激活蛋白的分离、纯化及等电点的的测定图5 纯化蛋白的S DS -P A GE电泳图图6 激活蛋白等电聚焦后的S DS -PA GE 电泳图参考文献:[1]王重庆,李云兰,李德昌等.高级生物化学实验教程[M ].北京:北京大学出版社,1994,1～202[2]W ei S heng Yan J iu .Detec tion of f u ngi f r om agricultural commod ities w ith serolog ical method .1999M ay 30;28(3):188-90.[3]J Protein Chem.P hosp hatid ate p hosp hatase --a key enzy me in g lyc erolip id biosynthesis [J ].Studies on the yeast enzyme.1998Jan;17(1):1-7.[4]M ultiplicity of UDP -glucuronosyltrans feras es in fis h.Purification and ch aracterization of a ph enol U DP-glucu ronosyltransferas e from the liver of a marine teleos t,Pleuronectes platessa.Biochem J.1992Ju n 1;284(Pt 2):417-23.[5]Au tom ated mu lti-dimen sional purification of tagged proteins.J S tru ct Fun ct Genomics.2003;4(2-3):109-14.[6]Development and validation study for th e chrom atographic purification proces s for tetanu s anatox in on Sephacryl S-200High Res olution.Boll Chim Farm.1999Ju l-Aug;138(7):364-8.[7]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M ].北京:科学出版社,2001,123～146[8]汪家政,范明.蛋白质技术手册[M ].北京:科学出版社,2002,189～259[9]李树文,刘晓兰,杜连祥.色谱法在蛋白质分离纯化中的应用[J ].齐齐哈尔大学学报,2003,19(3):21～24Isolation ,Purification of Plant Activator and Determinationof Its Isoelectric PointZH ON G Xinhua , QIU Dewen , WANG Chunli , LIU Zheng(X inj iang A gr icultur al University ,X inj iang Urum qi 830052)Abstract :Plant activ ato r is a sort of high -efficiency ,multi -function ,bro ad -spectrum and pollu-tio n-free new plant inductor ,w hich w as abstracted from fung us for the first tim e and can induce plant's resistance to a variety of disease and insect.T he iso lation and pur ification of this pr otein w ill pr ovide a go od basis for its further activity detection ,sequence determinatio n and g ene clone .Key words :plant activ ator ;ion ex change column chro matography ;size ex clusion isoelectric point 68新疆师范大学学报(自然科学版)2005年。