蛋白质的分离纯化与定性定量分析
蛋白质的定性和定量分析
➢ 样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉 淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去
➢ 多亚基蛋白质分子量检测 ❖ SDS和巯基乙醇 ❖ 用其它方法测定分子量进行参照
➢ SDS-PAGE测定的准确性 ❖ 电荷异常或构象异常 ❖ 带有较大辅基的蛋白质 ❖ 某些结构蛋白
• 许多干扰物质降低颜色反应 • 高盐浓度可引起沉淀
四、BCA (二喹啉甲酸)检测法
这是近年来新研制的一种改进的Lowry 测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质 的影响
原理
在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与 Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。 而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成 稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的 光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比， 可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量
注意事项 • 石英比色杯 • 调零所用溶液 • 配制标准蛋白所用溶液 • 光密度范围
二、Bradford检测法
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定 溶液中蛋白质含量的方法
原理
该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种 不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条 件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后， 产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物 在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液 中蛋白质浓度成正比，因此可检测595 mn的光 吸收值大小计算蛋白的含量
如果样品中含有脂类物质将明显 提高光吸收值
• 为促进BCA法的反应进程，可将 样品适当加热
小结（Summary）
掌握常用的测定方法 不同方法的操作步骤 操作过程的注意事项
其它蛋白质的定性定量方法
1. 蛋白质的染色定量 2. ELISA测定 3. 放射免疫测定
蛋白质组学 自上而下 自下而上
蛋白质组学自上而下自下而上蛋白质组学是研究生物体内蛋白质的种类、结构和功能，并通过大规模和高通量的技术手段进行分析和研究的学科。
蛋白质是生物体内最重要的功能分子，它们可以参与细胞的结构、运输、代谢、信号传导等多种生命活动，因此对蛋白质的研究对于理解生命活动、疾病机制以及药物研发具有重要意义。
蛋白质组学的研究可以从两个方向进行：自上而下和自下而上。
自上而下的研究方法是先对整个生物体的蛋白质进行分离和纯化，然后通过质谱等技术手段进行鉴定和定量分析。
自下而上的研究方法则是从蛋白质的序列出发，通过基因组、转录组等信息来推断蛋白质的结构和功能。
下文将详细介绍这两种研究方法及其在蛋白质组学中的应用。
自上而下的蛋白质组学研究方法主要包括蛋白质分离、纯化和质谱分析。
蛋白质分离常用的方法包括凝胶电泳、液相色谱和等电聚焦等，通过这些方法可以将生物体内的蛋白质按照大小、电荷、极性等物理性质进行分离。
分离后的蛋白质需要进行纯化，以去除杂质和提高样品的纯度。
质谱分析是自上而下蛋白质组学的核心技术，它可以通过质谱仪测定蛋白质的质量和荷电量，并进一步通过质谱图谱鉴定和定量目标蛋白质。
自上而下的蛋白质组学方法在蛋白质组学研究中得到了广泛应用，特别是在疾病蛋白标志物的发现和定量、药物作用机制研究以及蛋白质修饰等方面取得了重要进展。
例如，通过质谱分析可以发现一些具有特异性的疾病标志物，从而实现早期诊断和个体化治疗。
此外，质谱分析还可以用于研究蛋白质的翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等，从而揭示蛋白质的功能调控机制。
自下而上的蛋白质组学研究方法则是从蛋白质的基因组和转录组出发，通过生物信息学方法来预测蛋白质的结构和功能。
常用的自下而上的方法包括同源建模、蛋白质结构预测和功能预测等。
同源建模是利用已知蛋白质结构的模板来预测目标蛋白质的结构，通过结合同源序列比对和蛋白质结构预测软件可以获得目标蛋白质的三维结构模型。
蛋白质功能预测则是通过比对蛋白质序列与数据库中已知功能蛋白质的序列，从而推测目标蛋白质的功能。
【生物化学】第八章 蛋白质的分离纯化
㈤、凝胶过滤层析技术
⒈ 基原理
概念（排阻层析，分子筛层析）： 当生物大分子通过装有凝胶颗粒 的层析柱时，根据它们分子大小 不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网 状结构，被分离的混合物流过层 析柱时，比凝胶孔径大的分子不 能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之 间的空隙向下移动，并最先被洗 脱出来； 比网孔小的分子能不同程度的自 由出入凝胶孔内外，在柱内经过 的路程较长移动速度较慢，最后 被洗脱出来。
⒊ 分配纸层析
纤维素吸附的水是固定相，展层用的有 机溶剂是流动相
层析时混合氨基酸在这两相中不断分配， 使他们分布在滤纸的不同位置上。
此项技术可用于氨基酸成分的定量定性 测定。
⒊ 分配纸层析
操作：点样→展层→显 色用茚三酮显色时，得到 一个滤纸层析谱。 定义：原点到氨基酸停 留点的距离与原点至溶剂 前沿之比称为Rf值。 只要把溶剂系统、温度、 滤纸型号等条件确定，则 每一种氨基酸的Rf值是一 个确定值。
⒊ 分析型超速离心机
XL-A分析型超速离 心机 主要技术指标： 检测波长范围 200nm800nm 转子最大转速 40000RPM
什么是酶的活性中心？ 三维结构上比较接近的少数特异的氨基酸残基参与底物的 结合与催化作用，这一与酶活力直接相关的区域称酶的活 性部位。 在很多酶的活性中心均有His残基参与，原因是什么? 酶蛋白分子中组氨酸侧链咪唑基pK值为6.0-7.0，在生理条 件下，一半解离，一半不解离，因此既可以做质子供体，也 可以做质子受体，可以作为广义酸碱共同催化反应。 胰凝乳蛋白酶活性中心的催化三联体是指哪三种氨基酸？
⑵ 按两相所处的状态分类 流动相有两种状态：
*液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相
蛋白质的理化性质及分离分析
食品加工，消毒灭菌等； 非蛋白生物物质提取纯化，终止酶促反应；
生产生活中不利的一面：
活性蛋白制品（酶、抗体）的分离提取和保存；
四、蛋白质的沉淀作用
1. What’s precipitation of protein?
外加一些因素去除蛋白质胶体的稳定因素后，使蛋 白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀 （precipitation）。 变性后的蛋白质由于疏水 基团的暴露而易于沉淀， 但沉淀的蛋白质不一定都 是变性后的蛋白质。
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
What’s salt precipitation of protein?
盐溶作用 盐析作用
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
What’s salt precipitation of protein? 定义：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以 破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中 沉淀析出，称为盐析（salt precipitation）。 作用机制: 中和电荷的同时破坏水化膜;
蛋白质的理化性质 及分离分析
蛋白质的理化性质
一、两性性质及等电点 二、胶体性质 三、变性与复性作用 四、蛋白质的沉淀作用 五、沉降作用 六、蛋白质的颜色反应 七、蛋白质的紫外吸收性质
一、蛋白质的两性解离与等电点
蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的 氨基和羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两 性解离性质，具有特定的等电点（pI）。
沉降速度法测定分子量的原理； 梯度离心分离蛋白质（氯化铯）；
六、蛋白质的颜色反应
1. 双缩脲反应 2. 茚三酮反应 3. 考马斯亮蓝G250 4. 福林酚试剂反应 5. 黄色反应--芳香族氨基酸的特有反应 6. 米伦氏反应—酪氨酸的特有反应 7. 乙醛酸反应—色氨酸的特有反应 8. 坂口反应—精氨酸特有的反应
蛋白质分析中的液相色谱技术
蛋白质分析中的液相色谱技术蛋白质是生物体内非常重要的一种生物大分子，其具有重要的生理和生化功能。
在现代生物学中，对蛋白质的研究已经成为一个非常活跃的领域。
蛋白质分析技术的发展也得到了极大的推动，其中，液相色谱技术已经成为了蛋白质分析的一种重要的手段。
液相色谱技术（Liquid Chromatography，LC）是基于物质在流动液相中因理化性质的差异而发生分离的一种分离技术。
利用固定相、流动相及它们与样品相互作用的物理、化学参数，将混合物中的化合物分离并测定。
流动相可以是气体或液体，其中最常见的是液体。
与其他分离方法相比，液相色谱技术有着具有很多优点，如分离效果好、分离剂用量低、操作简单快捷、可靠性高等，因此被广泛应用在生化、制药、食品、环境等领域。
目前，液相色谱技术被广泛应用于蛋白质分析之中。
其主要包括以下几个方面：一、蛋白质分离纯化液相色谱技术可以实现对蛋白质的快速高效分离纯化。
根据蛋白质的理化性质，液相色谱可以对蛋白质进行不同方式的分离。
例如，按照蛋白质的相对大小进行分离的凝胶过滤色谱，按照蛋白质的电荷性质进行分离的离子交换色谱与电泳；按照蛋白质的疏水性进行分离的反相色谱与亲水色谱等。
通过液相色谱技术，不仅可以获得纯净的蛋白质，还可以对混杂物进行有效的去除。
这为后续的蛋白质分析打下了坚实的基础。
二、蛋白质定量液相色谱技术也可以用于蛋白质的定量。
对于蛋白质的定量需要了解蛋白质的含量、结构、各种功能配体的亲和性，从而推断其生物学性质和功能特点。
目前，蛋白质定量的方法有很多种，其中液相色谱技术是最具有前景的技术之一。
例如，用高效液相色谱分离定量蛋白质配体复合物的方法可以测定点钴原激活因子等的生物活性物质的蛋白质含量，用毛细管电泳定量可以测定血清白蛋白，糖化血红蛋白等各种蛋白质。
三、蛋白质序列分析液相色谱技术也可以实现蛋白质序列的解析。
对于蛋白质的序列分析，通常采用色谱方法和质谱法等多种方法。
其中，液相色谱方法是最常用的技术之一。
血清中蛋白提取方法
血清中蛋白提取方法血清是人体血液中的液体部分，其中含有丰富的蛋白质。
蛋白质是生命活动中不可或缺的重要分子，因此提取血清中的蛋白质对于研究和应用具有重要意义。
本文将介绍几种常用的血清中蛋白提取方法。
一、盐析法盐析法是一种常用的蛋白质提取方法，其原理是利用不同离子强度对蛋白质的溶解度差异进行分离。
首先将血清样品加入含有不同浓度盐溶液的离心管中，然后离心沉淀蛋白质。
通过调节盐浓度，可以选择性地提取特定类型的蛋白质。
二、凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于蛋白质分子大小差异进行分离的方法。
首先将血清样品加入具有特定孔径大小的凝胶柱中，较大分子量的蛋白质无法通过凝胶孔隙而被滞留，较小分子量的蛋白质则可以通过凝胶柱流出。
通过这种方式，可以将不同分子量范围的蛋白质分离提取。
三、电泳法电泳法是一种利用电场作用下蛋白质的电荷和分子量差异进行分离的方法。
在电泳过程中，将血清样品置于凝胶中，通过施加电场使蛋白质在凝胶中移动。
根据蛋白质的电荷和分子量差异，可以将不同类型和不同大小的蛋白质分离开来。
电泳方法具有高分辨率和高灵敏度的优点，广泛应用于蛋白质分离和分析领域。
四、亲和层析法亲和层析法是一种利用蛋白质与特定配体之间的特异性相互作用进行分离的方法。
在亲和层析过程中，将具有特定配体的固相材料填充在柱子中，然后将血清样品溶液通过柱子。
与配体有特异性相互作用的蛋白质将与配体结合，并通过洗脱步骤将蛋白质从柱子中洗脱出来。
亲和层析法可以高效地提取特定类型的蛋白质。
五、质谱法质谱法是一种基于蛋白质质量和电荷差异进行分离和鉴定的方法。
在质谱法中，首先将血清样品进行蛋白质提取和纯化，然后通过质谱仪对蛋白质进行分析。
质谱法具有高分辨率和高灵敏度的优点，可以对蛋白质进行精确的定性和定量分析。
血清中蛋白提取方法主要包括盐析法、凝胶过滤法、电泳法、亲和层析法和质谱法等。
根据需要和实验目的的不同，选择合适的方法可以高效地提取和分离血清中的蛋白质。
这些方法在生命科学研究和临床应用中发挥着重要的作用，为人们深入了解蛋白质的功能和相互作用提供了重要的技术手段。
蛋白质组学技术
蛋白质组学技术
蛋白质组学技术指在蛋白质组学研究中所用到的各种技术。
质谱技术是蛋白质组学技术中可实现高通量分析的技术之一，可用于蛋白质组的定性和定量分析。
百泰派克生物科技提供基于质谱的蛋白质组学分析服务。
蛋白质组学技术
蛋白质组学技术指在蛋白质组学研究中所用到的各种技术，包括蛋白质分离纯化技术、鉴定和测序技术、定量技术以及生物信息学分析技术等等。
纯化蛋白质的常规技术一般基于色谱，如离子交换色谱（IEC）、尺寸排阻色谱（SEC）和亲和色谱。
分析选择性蛋白质则可以使用ELISA和western blot技术，但是这些技术一般仅限于分析少数单个蛋白质，且无法确定蛋白质的表达水平。
质谱技术可用于确定蛋白质的氨基酸序列。
利用ICAT、iTRAQ等标记技术可对蛋白质组进行定量分析。
X 光散射技术和核磁共振（NMR）则可提供蛋白质的三维结构信息，这可能有助于理解蛋白质的生物学功能。
蛋白质组学技术。
蛋白质组学技术应用
蛋白质组学研究通过利用不同的技术来鉴定和量化细胞、组织或生物体中存在的总蛋白质，通过使用一种或多种蛋白质组学技术可完整描述细胞的结构和功能信息，以及细胞对各种类型的压力和药物的响应机制。
蛋白质组学技术可被用于多种不同
的研究环境，如用于检测各种诊断标志物、疫苗生产候选物，开发新药物，了解致病机制、应对不同信号改变的表达模式，以及解释不同疾病中的功能蛋白途径等。
蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的根本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。
可根据R f 作为定性依据。
Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。
将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。
取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。
在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
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Affinity chromatography
Possible elution strategies:
pH Ion strengh Denature Competitor ligand or analog
Ni-NTA columns
The high affinity of the Ni-NTA resins for 6xHis-tagged proteins or peptides is due to:
Na+
Na+ Na+ Na+
Na+ -
+
Cl-
+
Increased salt concentration
基本操作过程
1. 样品制备，装柱与平衡
2. 上样（样品溶解于A液中）
3. 洗脱：穿透峰，洗脱峰 4. 收集、鉴定
离子交换层析有两种洗脱方式
分步洗脱：用间断地递增的不同离子强度的流动
相分次洗脱样品蛋白的方法；
chrome意为“色彩”，graphy源自希腊文，意为 “写”。“层析”就是“色谱” 。 层析最早由俄国植物学家 Цвет 于1903年创造， 1941年英国学者Martin和Synge提出分配层析， 此后这种方法得到很大的发展。 层析是利用物质在固定相与流动相之间不同的分 配比例，达到分离目的的技术。
白的纯化；
通过免疫亲和层析技术，只需一步，即可纯化带 有标签的目标蛋白。
亲和层析的优点
1. 高效与简便：一旦固定化配体制备好后，操作使 用非常方便； 2. 亲和层析是高度浓缩的过程； 3. 可从样品中去除大量杂质； 4. 可在活性物质中去除理化性质几乎完全相同的但 已失活的那些“杂质”。
亲和层析中的三大通用技术
分离的蛋白质混合物的Mr范围，如Sephadex G-50
的分离范围是1500～30000。 常用的凝胶有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、 Superdex等。
Size-exclusion chromatography
Size-exclusion chromatography
Absorbance at 280 is used to identify protein-containing fractions. You can also perform an enzyme specific assay.
凝胶过滤的注意事项
1. 要根据待分离物质的分子量，选择特定的凝胶过 滤基质； 2. 凝胶过滤层析不仅可用于亲水性分子的分离，也 可用于疏水性分子的分离，当用于疏水性分子分 离时，该类层析往往被称为“凝胶通透层析”； 3. 凝胶过滤层析可提供样品的分子量信息； 4. 凝胶过滤的上样量一般在柱床体积的1～5％； 5. 凝胶过滤的样品浓度越大越好，但一般不要超过 100mg/ml。
3- Elute
2- Wash away non bound sample components from solid support
Affinity chromatography
Commonly used affinity columns:
Ni2+ binds to poly Histines (example 6xHis) Specific antibodies (anti-Flag tag) glutathione binds to GST Protein A or G binds antibodies
固定相：固定相是层析的基质。通常是固体（如
吸附剂，凝胶，离子交换剂等），能与待分离的
化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。
流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的 物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为 流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时
称为展层剂。
按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移 动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相 展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层 析类似的方法进行物质的分离和鉴定。 纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检 测分析和少量分离制备，通常为一次性使用； 柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。 生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和 层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。
可溶性：硫酸铵沉淀 等电点：离子交换层析 分子大小：凝胶过滤层析 生物学性质：亲和层析
蛋白质纯化的基本设计原则
原料应易得到，并尽可能富含目的蛋白； 应有特异性的蛋白质检测方法（最重要的因素， 决定了纯化能否成功）； 分级分离，先粗后细； 纯化条件尽量温和，避免蛋白失活。
若干区带。
稳态电泳：蛋白质迁移一段时间后达到稳态，带
的宽度不再随时间而改变。
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
凝胶由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（bis） 经共聚合而成，此过程在TEMED和过硫酸铵催化 下进行。 Acr在AP和TEMED的作用下形成单链，随后通过 bis的作用交叉互联形成网状结构，聚合成凝胶。 凝胶的孔径可在较宽范围内变化，以迎合不同的分 离需要。
梯度洗脱：连续改变流动相离子强度的方法。 目前随着层析的自动化，梯度洗脱成为大多数情
况下的首选方案。
分步洗脱分子量不同的蛋白质，通过凝胶分子筛时速度 不同来分离蛋白质的方法。
固定相：凝胶颗粒（gel bead），多孔的网状结构，
其网孔决定了凝胶的分级分离范围，即能被该凝胶
反向层析，或称反相色谱，reverse phase chromatography，是液相色谱分析中最常用的 技术。 当反相色谱用于蛋白质分离时，其原理与疏水层 析基本相同，区别在于： ① 疏水层析的配基疏水性较弱（苯基等），所 以高盐吸附，低盐洗脱； ② 反相色谱配基疏水性强（C18等），所以需要 使用有机溶剂洗脱。
蛋白质的检测方法
蛋白质的活性检测方法：必须快，必须是特异
性的
蛋白质的免疫学检测方法：western-blot，前提
是有特异的抗体
分离纯化的一般程序
1. 前处理（取决于采用的材料）
动物材料处理：剔除结缔组织和脂肪组织
种子处理：去种皮，有机溶剂脱脂
动物细胞破碎：匀浆器、超声波处理 植物组织：研磨，纤维素酶 细菌破碎：超声波，溶菌酶 如果蛋白质定位于某一细胞器，可用差速离心法 将其分离。
3. 亲和层析
以样品的生物活性为依据的分离方法。生物分子的 特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗原与 抗体，激素与受体，糖与凝集素……等。
将上述作用体系的一方连接到层析基质上，使之固
定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方。
Affinity chromatography
Makes use of specific binding interactions between molecules 1- Incubate crude sample with the immobilized ligand
其它杂蛋白分离开来。
常用方法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分
离等
特点：简便、处理量大、既能除去大量杂质（包
括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。
3. 细分级分离（fine fractionation） 主要方法： 层析：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲
和层析等
1. 蛋白质的层析分离
层析（chromatography）
怎样纯化蛋白质？
生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差 异，来分离或纯化它。 可溶性、等电点、分子大小、生物学性质……
可溶性：硫酸铵沉淀 等电点：离子交换层析 分子大小：凝胶过滤层析 生物学性质：亲和层析
1. 离子交换层析
离子交换层析利用物质的电荷与层析载体（离子 交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离纯化的 目的，属于吸附层析。 离子交换层析的固定相称为离子交换剂，由基质 和基团两部分组成。
相对离心力/×g 1 000 4 000 15 000 30 000 100 000
时间/min 5 10 20 30 3～10 h
沉降的组分 真核细胞
叶绿体、细胞碎片、 细胞核 线粒体、细菌 溶酶体、细菌细胞 碎片 核糖体
2. 粗分级分离（rough fractionation）
获得蛋白质提取液后，用一定方法，将蛋白质与
① 基质：纤维素、琼脂糖、葡聚糖、苯乙烯-二 乙烯苯等高分子聚合物；
② 基团：共价结合在基质上的带电基团，可分 为正电基团和负电基团。
Ion-Exchange chromatography
+ +
If pH mobile phase =7.2
Then charge of the proteins: (-) (-) (+) (+)
蛋白质具有亲水与疏水两重性，如果在层析基质 上接上疏水的基团，就能在一定条件下与某些蛋
白质的疏水基团相互作用，使之吸附，而达到分
离纯化的目的。
一般情况下，是高盐吸附（1～2M 硫酸铵），降
低流动相的盐浓度，使样品洗脱。 疏水层析的机制与离子交换层析正好相反，因此 两者是互补的。
反向层析与疏水层析原理相同
反相色谱分离蛋白质的原理
反相色谱是最高效的蛋白质层析技术之一
2. 蛋白质的电泳分离
电泳（electrophoresis）
带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电极移动 的现象称为电泳。 蛋白质是两性电解质，在不同pH溶液中带不同电 荷，在直流电场中能够泳动。
电泳基本原理
蛋白质在电场中泳动时，受到两种方向相反的力 的作用： 电场力 F＝qE，q为带电量，E为电场强度 摩擦力 Ff＝fv，f为摩擦系数，v为迁移速度 当蛋白质以恒速运动时，F－Ff＝0，即qE＝fv， 此时：v/E＝q/f＝q/6r