实验,微生物培养基的配讲义制和灭菌创新
实验一培养基的配制及灭菌
实验一培养基的配制及灭菌培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、别离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。
各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。
在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。
培养基的配制，一是要求在营养成分上能满足所培养微生物生长发育的需要，二是培养基在使用前不带菌，三是以灭菌后和保存过程中营养成分不发生变化。
培养基的灭菌通常在培养基配制后进行，其目的是杀灭培养基中残存的微生物或活的生物残体，保证培养基在贮存过程中不变质，也防止其他生物对培养的污染。
一、实验目的1．掌握实验室常用玻璃器皿的清洗、干燥和包扎方法。
2．明确培养基的配制原理。
3．掌握配制培养基的一般方法和步骤。
4．了解湿热和干热灭菌的原理，并掌握有关的操作技术。
二、实验原理灭菌是指杀灭物体中所有微生物的繁殖体和芽孢的过程。
消毒是指用物理、化学或生物的方法杀死病原微生物的过程。
灭菌的原理就是使蛋白质和核酸等生物大分子发生变性，从而到达灭菌的作用，实验室中最常用的就是干热灭菌和湿热灭菌。
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而到达灭菌的目的。
细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。
因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高〔160～170℃〕，时间长〔1～2h〕。
但干热灭菌温度不能超过 180℃。
否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。
待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。
导致菌体蛋白质凝固变性而到达灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。
实验二 培养基的配制和灭菌
实验二培养基的配制和灭菌一、实验目的微生物的生长发育都有一定的营养需要，培养基即人工培养微生物、为其生长发育提供所需营养的基质。
培养基配好后必须经过灭菌方能用于分离培养微生物试验，因此培养基的配制和灭菌是植物病理实验室中最基本的工作，通过本次实验学习植病实验室中常用培养基的配制方法和高压灭菌锅的使用方法。
二、内容、材料和方法(一)培养基的配制培养基按组成成分及对这些成分了解的程度分为天然培养基、半组合培养基和组合培养基三类，从物理性质上又分为液体培养基和固体培养基两类，培养基的种类不同，配制方法也有差异，限于时间，本次实验仅配制马铃薯琼脂培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。
1马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）这是植病实验室最常用的培养基(简称PSA)，主要用于植物病原真菌的分离和培养，有时也用于植物病原细菌。
成分：马铃薯200克蔗糖 10~20克琼脂 17~20克加水至1000毫升方法：将马铃薯洗净去皮切块，加水煮沸半小时，用双层纱布滤去薯块，补足水量，加入琼脂，加热熔化，再加糖，待完全化后，乘热用双层纱布过滤分装，塞好棉塞高压灭菌。
马铃薯蔗糖琼脂培养基略带酸性，培养真菌无需调节pH，培养细菌则调节pH至中性，此培养基留作下次实验分离培养病原真菌用，故不必调节pH。
5人分作一组，1、2组各作此培养基500毫升，其中200毫升分装试管，每管约10毫升，灭菌后摆成斜面；其余300毫升，分装在3个250—300毫升的三角瓶中，每瓶装100毫升左右，灭菌后妥善保存，留待下次实验使用。
2肉汁胨培养基（BPA）这种培养基主要用于细菌的分离和培养成分：牛肉浸膏 3克蛋白胨 5~10克蔗糖 10克酵母浸膏 1克琼脂 17~20克加水至 1000毫升方法：先将琼脂加热熔化于大部水中，再将其它各成分用少量水化开加入，调节pH至7，趁热用双层纱布过滤，分装，塞棉塞高压灭菌。
牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易称重，称重时用小烧杯盛装，以玻璃棒沾取，故要先称好杯和棒的重量后，再开始沾取浸膏称重，称后将杯和棒上粘着的浸膏洗净于锅中。
细菌培养基的制备、灭菌及接种、培养技术ppt课件
目的要求
掌握从环境中分离培养细菌的方法，从 而获得若干种细菌纯培养技能。 掌握几种接种技术。
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实验材料
无菌培养皿(直径90mm)10套、无菌移液管1mL2
支、10mL1支。
营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶， 无菌稀释水90mL1瓶、9mL5管。 其它：接种环、酒精灯、恒温箱。
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c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放 在37℃恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。
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实验程序4
（培养基和玻璃器材的灭菌方法）
过滤除菌法： 不能用加热灭菌的 液体物质（如维生 素、血清），一般 可用细菌过滤器进 行除菌。
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第二部分 细菌纯种分离、培养和接
种技术
目的要求 实验材料 实验程序
9
实 验 程 序2
（培养基的配制方法和步骤） 3. 调pH值：用10％ NaOH调pH至7.6，用精 密pH试纸对照。 4. 分装：将培养基分装于5支试管，其余全部 倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。注意 不要污染棉塞和瓶口。 5. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。 6. 灭菌备用：培养基灭菌后必须在37℃下恒 温培养24h，确定无菌生长，方可使用。
实验二
细菌培养基的配制、灭 菌及接种、培养技术
1
第一部分 细菌培养基的制备、灭菌
目的要求 实验材料 实验程序
2
目的要求
熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 掌握培养基和无菌水的制备方法。 掌握高压蒸气灭菌技术。
3
实验材料
药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。
高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。 其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻 璃珠等。
微生物实验培养基制备和灭菌课件
称量：按培养基配方比例依次准确地称 取所需药品逐一放入搪瓷杯中
溶化：在电炉上加热溶解。
注：琼脂要在沸水中溶解，用玻棒不断搅拌，直至 完全溶解（分装试管）。
• 高氏一号培养基（同上）
1个组：配1000ml，分装三角瓶（150ml/瓶）
• 马丁氏培养基（同上）
2个组：各配500ml，分装三角瓶（150ml/瓶）
实验安排（ 4人/组）
一、器皿包扎和灭菌 （1）培养皿12只（6只1包） （2）1mL移液管6支 （3）干热灭菌（160 ℃ ，2h）
二、制备无菌水 （1）250mL三角瓶：内装玻璃珠和90mL水 （2）试管6支：分装9mL水/支 （3）牛皮纸包扎，高压蒸汽灭菌(121 ℃,20min)
• 一般采用0.103 MPa的蒸汽压力，此时温度是121.1℃，维 持15~20 min。当灭菌物品中有易破坏的成分，可采用 较低温度115℃（蒸汽压力0.075 MPa）下维持30 min左右.
手提式高压蒸汽灭菌锅
图示 手提式灭菌锅结构 1、安全阀；2、压力表；3、放气阀；4、软管；5、螺 栓6、灭菌桶；7、筛架；8、水
不同的微生物对培养基 pH要求不同，霉菌和酵母菌的 培养基 pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基 pH
一般为中性或微碱性。
实验器材
• 仪器或其他用具：搪瓷杯，试管，三角瓶，烧杯， 量筒，玻棒，电磁炉、培养基分装器，高压蒸汽 灭菌锅，精密pH试纸（pH 5.5~9.0），牛角匙， 棉花（或橡胶塞），牛皮纸，记号笔，纱布，棉 绳等。
实验一 微生物培养基的制备与灭菌知识讲解
实验一微生物培养基的制备与灭菌（8课时）一、目的要求1、学习配制微生物培养基的一般方法和步骤。
2、掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。
二、基本原理正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。
由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异，但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。
三、实验材料1、药品：牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂粉、1mol/L的NaOH和1mol/L HCl溶液。
2、仪器及玻璃器皿：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、酒精灯、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿和玻璃棒等。
3、其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、报纸、线绳和注射器等。
四、操作步骤（一）玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须用洗涤剂洗刷干净，然后用自来水冲净，置于烘箱中烘干后备用。
（二）牛肉膏蛋白胨培养基的配制1、培养基配制（1）称量：按培养基配方计算出各成分的用量，然后用电子天平进行准确称量后倒入一烧杯中。
注意：称量药品时，一定要用称量纸而不能用滤纸。
称药品用的药匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。
（2）溶解：用量筒称量所需体积的水（根据实验需要可用自来水或蒸馏水），倒入烧杯中，用玻璃棒搅动溶解即可。
（3）调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH，可用1mol/L NaOH或1mol/L HCl 溶液进行调节。
调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。
边加边搅拌，并不时用PH试纸测试，直至达到所需pH为止。
注意：pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
2、制备液体培养基（1）用量筒准确量取20ml培养基，倒入100ml三角瓶中，塞好棉塞，用报纸包好瓶口并用棉线包扎好，灭菌。
微生物学 实验 培养基的配制、器具的包装和灭菌
间歇灭菌法： 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天 蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。 在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基） 放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以 使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营 养体，以便下次蒸煮时杀灭。
过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、 血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。
105kgcm用于分离和培养真菌之用是一种半合成培养基去皮马铃薯或鲜豆芽200g去皮切成小块放水中煮沸保持20min用双层纱布过滤取汁蔗糖20g自来水1000ml琼脂20gph自然灭菌
实验五
培养基的制备、器具包 扎和灭菌
一、实验目的
了解培养基的配制原理和方法，掌握其 配制过程。
了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和 加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
高氏一号培养基
(用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基)
可溶性淀粉
KNO3 K2HPO4 MgSO4• 7H2O NaCl
FeSO4• 7H2O pH 琼脂 自来水 灭菌： 1.05kg/cm2
20.0g 1.0g 0.5g 0.5g 0.5g 0.01g 7.4~7.6 20g 1000mL 30min
水。 分装：注意不要污染棉塞。 包扎成捆，挂上标签（最好用铅笔写），注明何
种培养基。 灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌
生长，方可使用。
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）
牛肉膏
3g
蛋白胨
5g
氯化钠
5g
琼脂
20g
自来水
1000mL
制备无菌水
无菌水为下一次微生物分离实验中所需要的材 料。 250mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水 90mL，试管中装9.0mL自来水，塞上塞子， 包扎、灭菌备用。
实验三 培养基的配制、灭菌及混合微生物的分离和纯化培养
试管培养：
1,准备干净试管 ；
2,培养基的配制及试管分装；
3,含培养基的试管灭菌；
4,灭菌后试管趁热摊斜面；
5,试管无菌接种
6,恒温箱中培养
7,菌种的保存
实验 三 微生物实的培验养 内容（3人为小组单位）
6X 培养皿 包扎，干热灭菌，160度，2h
实验要求
每人完成
培养皿 2 个，混合菌种划线分离用；
（ 一般每个皿可加10···15ml 的培养基）
试管 1 个，做试管斜面用；
实验 三 微生物的培养
实验过程及内容
一、器皿的准备（30 分钟内完成）
空白培养皿包扎，干热灭菌，160度，2 h
二、培养基的配制、分装及灭菌（ 75 分钟完成）
六、在一定温度下培养，几天后至可见菌落，镜检。
实验 三 微生物的培养
微生物实验室培养的基本操作程序
培养皿作为培养容器时： 1,空白培养皿包扎、灭菌 2,培养基的配制 3,培养基的灭菌 4,倒平板 5,平皿无菌接种 6,恒温箱中，倒置培养 7,菌种的保存
实验 三 微生物的培养
如何实现：烘箱160-170 ℃下加热1-2h，
实验 三 微生物的培养
常用灭菌、无菌技术
4,高温高压蒸气灭菌: 系指用高压饱和水蒸气加热杀灭微生物的方 法。能杀灭所有细菌繁殖体和芽孢，适用于耐 高温和耐高压蒸汽的所有药物制剂 、玻璃容 器、金属容器、瓷器、橡胶塞、滤膜过滤器等。
常用灭菌温度（蒸气表压）和时间： 含糖分高、或含氨基酸高的培养基 115℃、30min； 大多数，比较耐高温培养基 121℃、20min；
实验 三 微生物的培养
培养基的配制与灭菌实验报告
培养基的配制与灭菌实验报告篇一：培养基的制备与灭菌实验报告陕西师范大学远程教育学院生物学实验报告报告题目培养基的制备与灭菌姓名刘伟学号专业生物科学批次/层次指导教师学习中心培养基的制备与灭菌一、目的要求1. 掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。
2. 掌握培养基的配置原则和方法。
3. 掌握高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。
二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基：是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。
由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。
高压蒸汽灭菌：主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。
将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。
待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。
此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，获得高于100℃的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。
三、实验材料1. 药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。
2. 仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。
3. 其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。
四、操作步骤（一）玻璃器皿的洗涤和包装1．玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。
将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。
移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。
洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。
2．灭菌前玻璃器皿的包装（1）培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。
包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。
（2）移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作用是避免外界及口中杂菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。
微生物培养基的配制和灭菌 PPT课件
實驗程式18
（培養基和玻璃器材的滅菌方法）
思考題
固體培養基加瓊脂後加熱溶化時要注意哪些問 題？ 培養基中加瓊脂的作用是什麼？ 幹熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和間歇滅菌的場合有 何不同？ 如何檢查培養基滅菌是否徹底？
實驗程式16
（培養基和玻璃器材的滅菌方法）
實驗程式17
（培養基和玻璃器材的滅菌方法）
紫外線滅菌法： 一般30W燈管，9m3空間，距地面2m每次打開紫外線照射0.5h， 就使室內空氣滅菌。若照射紫外線時先噴灑石炭酸等化學消毒劑， 可增強滅菌效果。紫外線雖有較強的殺菌力，但穿透力弱，即使 一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除，因此只適用於空氣 及表面殺菌。
實驗程序
培養基的配製 分離培養微生物常用器皿的準備 培養基和玻璃器材的滅菌方法
實 驗 程 序1
（培養基的配製）
培養基的種類 培養基的配製方法和步驟 三種培養基的配方及配製 無菌水的製備
實 驗 程 序2
（培養基的種類）
據組成成分可分為:
1.合成培養基：由各種純化學物質按一定比例配製而成。 2.半合成培養基：有一部分純化學物質和另一部分天然物質配製 而成。 3.天然培養基：利用天然來源的有機物配製而成。
實 驗 程 序9
（三種培養基的配方及配製）
澱粉瓊脂培養基（高氏一號Gause´1），用於分離 和培養放線菌，是一種合成培養基。配方如下：
可溶性澱粉
KNO3 K2HPO4 MgSO4• 7H2O NaCl FeSO4• 7H2O 瓊脂 自來水
实验七培养基的配制与灭菌课件
五、 思考题
1、简述高压灭菌锅的灭菌原理及使用注意点。 2、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌
后的培养基是无菌的？ 3、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什
么？
一、实验目的
1、掌握培养基配制的一般方法与步骤。 2、了解常见的灭菌方式，掌握高压灭菌的原理及操作。 3、掌握基本实验器材的包扎。
二、实验原理
（一）培养基的配制
培养基是由人工配制的能够满足微生物生长、繁殖或 积累代谢产物所用的营养基质。
培养基的六大营养因素： 碳源 氮源 能源 生长因子 无机盐 水
分装
塞棉塞和包扎
液体：试管 ¼，三角瓶1/3 固体：三角瓶 1/2
灭菌
（摆斜面）
（二）灭菌和消毒技术
1. 火焰灼烧：对金属器皿的灭菌 2. 干热灭菌：180℃2－3小时（对器皿的灭菌） 3. 湿热灭菌
常压蒸汽灭菌 ：巴氏消毒法，间歇灭菌法 蒸汽持续灭菌法 高压蒸汽灭菌： 121 ℃ 30分钟 4. 过滤除菌 5. 紫外线杀菌：紫外线照射20分钟以上，对空气杀菌 6. 化学药剂消毒和杀菌
形管 伊红美兰培养基 固体 500ml （500ml 三角瓶分装 X 2，每
瓶加琼脂7.5克） 无菌水 9ml/支 30 支 无菌水 90ml/瓶 20 瓶
四、实验内容
牛肉膏蛋白胨培养基: 1%NaCl 5%NaCl 各300mL（500ml 三角瓶，每瓶加琼脂8克） 10%NaCl
pH5 pH7 各300mL（500ml 三角瓶，每瓶加琼脂8克） pH9
2个 1ml移液管5根 10N NaOH 孟加拉红水溶液 pH试纸 ，电炉，标签纸 ，玻棒，铝锅 ，天平
四、实验内容
牛肉膏蛋白胨培养基 固体 3L（500ml 三角瓶分装 X 9， 每瓶加琼脂8克）