微生物学实验讲义

实验二实验器具的灭菌

一、实验目的

1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。

2.了解其他灭菌方法。

二、基本原理

高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

三、器材

1、高压蒸汽灭菌锅

2、牛皮纸

3、棉绳

4、仪器和其他用具

四、操作步骤

1、包扎

将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。

2、加热烧开

待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。

3、升压

完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。

4、减压，取出器具

到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖。

五、思考题

（1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？

实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制

—、目的要求

1、明确培养基的配制原理

2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。

二、基本原理

牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：

牛肉膏 3.0g

蛋白胨10.0g

NaCI 5.0g

水1000mI

pH 7.4～7.6

三、器材

1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。

2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。

四、操作步骤

1、称量

按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。牛肉膏常用破棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时，如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。

（蛋白质很易吸湿，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。）

2、溶化

在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5％~2.0％的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。

3、调pH

在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LnaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。

4、分装

按照实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。

5、加塞

培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞），以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。

6、包扎

加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

7、灭菌

将上述培养基以0.103Mpa，121℃，20min高压蒸汽灭菌。

8、搁置斜面和倒平板

将灭菌的试管培养基冷至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜，冷凝；倒入平板适当量培养基，冷凝。

9、无菌检查

将灭菌培养基放入37℃的温度中培养24～48h，以检查灭菌是否彻底。

五、思考题

你认为在加热融化琼脂的过程中应注意哪些环节？

实验四微生物的接种和培养

一、实验目的

1、掌握各种接种方法。

2、掌握无菌操作基本环节。

二、基本原理

微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。

三、器材

1、恒温培养箱。

2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。

3、培养基（上次实验配制的）。

4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。

四、操作步骤

1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）

（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。

（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。

（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。

（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。

（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。

（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。

（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。

（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。

（9）将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。

2、穿刺接种

把菌种接种到固体深层培养基中，此法用于嫌气性细菌接种或为鉴定细菌时观察生理性能用。

（1）操作方法与上述相同，但所用的接种针应挺直。

（2）将接种针自培养基中心刺入，直刺到接近管底，但勿穿透，然后尚原穿刺途径慢慢拔出。

3、液体接种

（1）由斜面培养基接入液体培养基，此法用于观察细菌的生长特性和生化反应的测定，操作方法与前相同，但使试管口向上斜，以免培养液流出接入菌体后，使接种环和管内壁磨擦几下以利洗下环上菌体。接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。

（2）由液体培养基接种液体培养基，菌种是液体时，接处除用接种环外尚用无菌吸管