微生物学实验讲义
微生物学实验讲义
实验二实验器具的灭菌一、实验目的1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。
2.了解其他灭菌方法。
二、基本原理高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。
其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
三、器材1、高压蒸汽灭菌锅2、牛皮纸3、棉绳4、仪器和其他用具四、操作步骤1、包扎将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。
2、加热烧开待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。
3、升压完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。
4、减压，取出器具到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。
当压力降到零后，才能开盖。
五、思考题（1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制—、目的要求1、明确培养基的配制原理2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。
二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨10.0gNaCI 5.0g水1000mIpH 7.4～7.6三、器材1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。
2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
四、操作步骤1、称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。
《微生物学》讲义
微生物学第一章第一章绪言一、一、微生物概述1、1、什么是微生物微生物(microbe，microorganism)通常是描述一切不借助显微镜用肉眼看不见的微小生物。
这类微生物包括病毒、细菌、古菌、真菌、原生动物和某些藻类。
微生物是指大量的、极其多样的、不借助显微镜看不见的微小生物类群的总称。
因此，微生物通常包括病毒、亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒）、具原核细胞结构的真细菌、古生菌以及具真核细胞结构的真菌（酵母、霉菌、蕈菌等）、原生动物和单细胞藻类，它们的大小和特征见表1.1所示。
但是有些例外，如许多真菌的子实体、蘑菇等常肉眼可见；相同的，某些藻类能生长几米长。
一般来说微生物可以认为是相当简单的生物，大多数的细菌、原生动物、某些藻类和真菌是单细胞的微生物，即使为多细胞的微生物，也没有许多的细胞类型。
病毒甚至没有细胞，只有蛋白质外壳包围着的遗传物质，且不能独立存活。
表1.1 微生物形态、大小和细胞类型2、2、生物中哪些是微生物物生非细胞生物病毒、亚病毒细胞生物原核生物真细菌、古细菌真核生物生动物真菌、单细胞藻类、原3、3、微生物的特点a a 个体微小，结构简单在形态上，个体微小，肉眼看不见，需用显微镜观察，细胞大小以微米和纳米计量。
b b 繁殖快生长繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代。
c c 代谢类型多，活性强。
d d 分布广泛有高等生物的地方均有微生物生活，动植物不能生活的极端环境也有微生物存在。
e e 数量多在局部环境中数量众多，如每克土壤含微生物几千万至几亿个。
f f 易变异相对于高等生物而言，较容易发生变异。
在所有生物类群中，已知微生物种类的数量仅次于被子植物和昆虫。
微生物种内的遗传多样性非常丰富。
所以微生物是很好的研究对象，具有广泛的用途。
二、二、微生物学的重要性微生物与人类生活所有方面紧密联系，下面仅列出几个：1、1、环境微生物在碳循环、氮循环和磷循环(地球化学循环)中承担主要作用，构成生物体的所有基本成分。
微生物学讲义
绪论一、什么是微生物非分类学上名词，来自法语“Microbe”一词。
是形体微小、单细胞或个体结构简单的多细胞、甚或无细胞结构的低等生物的通称。
一般只有借助显微镜才能其进行观察。
三界（域）系统Woese提出将生物分成为三界(后来改称三个域)：古细菌、真细菌和真核生物。
1990年，他为了避免把古细菌也看作是细菌的一类，他又把三界(域)改称为：Bacteria(细菌)、Archaea(古生菌)和Eukarya(真核生物)。
并构建了三界(域)生物的系统树。
微生物无处不在，我们无时不生活在“微生物的海洋”中。
微生物是人类的朋友微生物是自然界物质循环的关键环节；体内的正常菌群是人及动物健康的基本保证；微生物可以为我们提供很多有用的物质；微生物是现代生物技术使用的重要宿主和工具。
少数微生物也是人类的敌人！认识微生物的四大障碍：个体过于微小；群体外貌不显；种间杂居混生；形态与作用后果很难被认识。
二、人类对微生物世界的认识过程（一）、微生物的发现——形态学时期荷兰人列文虎克（1632-1723）首次观察到了细菌。
（二）、微生物学的奠基——生理学时期法国人巴斯德（1822-1895）（1）证实了微生物活动和否定了微生物自然发生学说。
（2）免疫学——预防种痘（3）发酵的研究——相信一切发酵作用都和微生物的存在及繁殖有关。
不同的发酵是由不同的微生物引起的。
（4）发明巴斯德消毒法。
德国人柯赫（1843-1910）1、建立微生物学研究基本技术（1）分离和纯化细菌：划线法，混合倒平板法。
（2）设计了培养细菌用的肉汁胨培养液和营养琼脂培养基。
（3）设计了细菌染色技术2、证实疾病的病原菌学说，提出了柯赫准则。
柯赫准则（1）某一种微生物，当被怀疑是病原体时，它一定伴随着病害而存在。
（2）必须能自原寄主分离出这种微生物，并培养成为纯培养。
（3）用已纯化的纯培养微生物，人工接种寄主，必须能诱发与原来病害相同病害。
(4) 必须自人工接种发病的寄主内，能重新分离出同一病原微生物并培养成纯培养。
口腔微生物实验讲义
（二）几种常见标本的采集方法
1.唾液：
最佳采集时间为晨间起床后，刷牙洗漱前或两餐之间。（10：00 am或4：00pm）。在采集标本前令受检者用温开水清漱口中的食物残渣，然后自然排出唾液于无菌容器中，至少采集0.5—1ml。然后塞好管口，立即送检。
复染：沙黄染液，1-2滴，1分钟，水洗，吸水纸吸干。
三、变链球菌的分离和鉴定
目的要求
1.初步掌握变链球菌分离、鉴定的主要程序和方法。
2.掌握变链球菌的菌落特点、菌细胞形态及革兰染色特征。
材料
1.菌种：变链球菌斜面培养物
2.培养基：（1）分离培养用培养基：MS琼脂平板或血琼脂平板
（2）生化反应用培养基：4.5%NaCl、甘露醇、乳糖、七叶苷
2.牙菌斑：
按菌斑的位置可分为龈上菌斑和龈下菌斑两大类。龈上菌斑指牙颈部龈缘以上牙面的牙菌斑，龈下菌斑指牙龈缘内侧被牙龈所覆盖牙面上的菌斑。
（1）龈上菌斑的采集：
适用于牙龈炎和早期牙周炎的细菌分离。受检者用温开水漱口后，用菌斑指示剂显示出龈上菌斑，然后在无菌纱球局部隔湿的情况下，用无菌匙形器采集，转至有还原转移液的无菌试管中送检。
目的要求：观察口腔微生物的基本形态和一些微生物的动力。
1.不染色检查方法：标本不染色，直接在显微镜下观察。
（1）压滴法
材料
①菌种：变形杆菌，葡萄球菌12小时肉汤培养物。
②其他：载玻片，盖玻片等。
方法
①用接种环取变形杆菌菌液2-3环，置于洁净载玻片中央。
制药工程专业微生物实验讲义
（怀化学院微生物学课程组）微生物学实验室学生要求为了营造一个安全有效、秩序良好的实验室环境，达到“科学、规范、安全、高效”的目的，特对进入微生物学实验室进行实验的学生作如下要求。
1.按已分好的班级组次，按时参加实验，并完成实验项目。
2.进入实验室前，要求穿戴整齐，需穿好实验服，不能穿人字拖类拖鞋进入实验室。
3.上课前要求上交当堂课程的实验预习报告。
4.要求独立或以小组为单位完成实验项目，实验期间保持实验室安静，不能大声喧哗，并及时记录好实验数据。
5.实验完成后及时对实验结果进行分析并完成实验报告。
6.实验完成后需及时清洗实验器皿，清洁和整理实验台，做好卫生，保持实验室干净整洁。
授课教师：刘卫今、黎晓英（以下实验内容仅供参考，具体内容以相应教材为准）实验一培养基的制备与灭菌一、实验目的1．掌握培养基配制的原理。
2．通过对牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、马铃薯培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
3．解高压蒸汽灭菌的基本原理及操作方法。
二、实验原理1．什么是培养基，一般培养基应具备哪些营养要素？2．培养基有哪些类型，为什么培养不同的微生物需要的培养基不同，培养基为什么要调节pH 值，配制好的培养基为什么要立即灭菌？3．高压蒸汽灭菌的原理是什么？三、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖（或蔗糖）、链霉素、1mol/L NaOH、1mol/LH Cl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布和玻璃漏斗等。
四、操作步骤(一)牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。
其配方如下:牛肉膏3g，蛋白胨l0g，NaCl5g，琼脂15-20g, 水1000mL，pH 7.4～7.61. 称量：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。
实验课6 ——【医学微生物学精品讲义】
TRUST (toluide red unheated serum regain test)
材料：TRUST试剂盒、病人血清
反应卡
1
2
3
Positive Negative Experimental control control group
（4）复染：稀释复红30sec，水洗，甩干水份。
（四）浅部真菌病标本的检查
1. 实验材料 （1）发癣或足癣患者的毛发或皮屑。 （2）10～20%NaOH溶液。 （3）载玻片、盖玻片等。
奋森螺旋体(革兰染色)
梅毒螺旋体(镀银染色)
钩端螺旋体(镀银染色)
暗视野显微镜下苍白密螺旋体 （暗视野，放大1000倍）
（二）梅毒血清学诊断试验
非螺旋体抗原试验：查反应素，特点是敏感性高, 但 易出现假阳性。 反应素是指非特异性抗类脂质抗体。当苍白螺旋体侵 入人体后,便会诱发人体产生两种相对应的抗体,即具 有种和属特异性的IgM和IgG抗体,另一种是非特异性抗 类脂质抗体称为反应素，它不是由螺旋体所产生而是 在螺旋体破坏人体组织过程中所释放的物质间接产生 的这种具有抗体特性的物质称为反应素。这种抗体主 要是IgE。
操作程序：
1. 将待检血清及TRUST抗原于试验前置（23-29℃）中平衡 片刻。
2. 分别吸取阴性和阳性对照各1滴（50μl）加到反应卡的二 个圆圈内并铺匀。
3. 吸取待检血清或血浆（不需灭活）1滴，分别滴加于卡片 上的另一个圆圈内并铺匀。
4. 轻轻摇匀抗原，用专用滴管针头垂直滴加抗原各1滴于 圈内。
真菌
（一）真菌的形态
真菌（fungi）大多为多细胞，仅少数为单细胞。单细 胞型真菌呈圆形或椭圆形，如酵母菌或类酵母型真菌。
微生物学实验讲义
微生物学实验讲义（2008级基地班）任课教师：熊芳教授教化时数：15学时实验周数：4周生物学实验教授教化中间微生物实验目次（15学时）微生物实验差不多常识介绍实验一：培养基的配制与灭菌（4学时）实验二：泥土自生固氮菌的分别纯化（5学时）实验三：显微镜的应用和简单染色（3学时）实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时）第一次实验：微生物学实验差不多常识一、实验目标1.熟悉实验室规矩和安稳守则，精确应对实验中显现的不测变乱；2.熟悉微生物学实验室常用仪器和有关试剂的全然常识；3.操纵实验申报的精确书写。
二、实验内容1.实验室规矩；2.实验室安稳守则；3.实验室中不测变乱处理；4.常用器皿及器具；5.显微镜及有关常识；6.实验预习、实验记录和实验申报。
实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌设备培养基的全然流程如下：原料称量→消融→调剂pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌培养基的配制原则一、养分成分1. 依照不合微生物的养分须要配制不合的培养基，如自养型微生物的培养基完全能够（或应当）由简单的无机物质构成。
异养微生物的培养基至少须要含有一种有机物质。
碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体供给全部心理活动所须要的能量（异养微生物）。
氮源(nitrogen source) 凡是供给微生物养分所需的氮元素的养分源，称为氮源。
氮源物质的重要感化是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能应用铵盐、硝酸盐作为机体进展的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的前提下，也能够应用氨基酸作为能源物质。
能源指能为微生物的生命活动供给最初能量来源的养分物或辐射能。
2. 留意各类养分物质的浓度与配比养分物的浓度：在一样情形下，浓度合适的养分物质才对微生物表示出优胜感化，浓度大年夜时对微生物进展起克制造用，浓度小时不克不及知足微生物进展的须要。
各养分物质之间的浓度比：培养基中各养分物质之间的浓度比直截了当阻碍微生物的进展与滋长和（或）代谢产品的形成与积聚，专门是碳氮比（C／N）（碳氮比一样指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的阻碍更为明显。
11-12(1)30学时微生物实验讲义1
《微生物学实验技术》讲稿任课教师：余文英、黄碧芳教学时数：30学时实验周数：5周微生物实验目录（30学时）第一周微生物学实验基础知识介绍（1学时）实验一：微生物大小的测定（3学时）实验二：培养基的配制与灭菌（3学时）第二周实验三：微生物血球计数板直接计数（3学时）实验四：酵母菌子囊孢子形态的观察（2学时）实验五：土壤中细菌、放线菌、真菌的分离与纯化（3学时）第三周实验六：稀释平板计数法微生物活菌测数（2学时）实验七：四大类微生物菌落的形态比较与识别（2学时）实验八：微生物菌种保藏（3学时）第四周实验九：细菌芽胞的观察（2学时）实验十：细菌染色观察个体形态（3学时）实验十一：滤膜法测定水中大肠菌群（3学时）第一周微生物学实验基础知识一、实验目的1.熟悉实验室规则和安全守则，正确应对实验中出现的意外事故；2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的基本知识；3.掌握实验报告的正确书写。
二、实验内容给学生介绍以下几点内容（具体内容见书上）：1.实验室规则；2.实验室安全守则；3.实验室中意外事故处理；4.常用器皿及用具；5.显微镜及有关知识；6.实验预习、实验记录和实验报告。
微生物的大小测定一、实验原理微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一。
由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。
由于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺（图1）是一块圆形玻片，在玻片中刻有精确等分的刻度。
测量时，将其放在接目镜中的隔板上来测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同的显微镜放大倍数不同，同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下，其放大倍数也不相同，而目镜测微尺时处在目镜的隔板上，每格实际表示的长度不随显微镜的总放大倍数的放大而放大，仅与目镜的放大倍数有关，只要目镜不变，它就是定值。
而显微镜下的细胞物象是经过了物镜、物镜两次放大成象后才进入视野的。
即目镜测微尺上刻度的放大比例与显微镜下细胞的放大比例不同，只是代表相对长度，所以使用前须用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求的得在一定放大倍数下的实际测量时的每格长度。
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微生物学实验讲义 Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】《生物学实验Ⅰ——微生物》（2008级基地班）任课教师：熊芳教学时数： 15学时实验周数： 4周生物学实验教学中心微生物实验目录（15学时）微生物实验基础知识介绍实验一：培养基的配制与灭菌（4学时）实验二：土壤自生固氮菌的分离纯化（5学时）实验三：显微镜的使用和简单染色（3学时）实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时）第一次实验：微生物学实验基础知识一、实验目的1.熟悉实验室规则和安全守则，正确应对实验中出现的意外事故；2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的基本知识；3.掌握实验报告的正确书写。
二、实验内容1.实验室规则；2.实验室安全守则；3.实验室中意外事故处理；4.常用器皿及用具；5.显微镜及有关知识；6.实验预习、实验记录和实验报告。
实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌配置培养基的基本流程如下：原料称量→溶解→调节pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌培养基的配制原则一、营养成分1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。
异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质。
碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需要的能量（异养微生物）。
氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。
氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。
能源指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。
2. 注意各种营养物质的浓度与配比营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。
各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或）代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。
二、控制培养基的PH值各类微生物生长的最适pH各不相同，细菌与放线菌生长的pH在之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。
在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式：内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。
外源调节：按实际需要流加酸或碱液三、渗透压注意营养物质要有适合的浓度，不能太低满足不了生长的需要，太高则渗透压太大，也会抑制微生物的生长四、氧化还原电位氧化还原电位越高，培养基的氧化活动越强，在厌氧菌培养中，加入还原剂，可降低自由氧的毒害。
培养基的种类据组成成分可分为:1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。
是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。
如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。
2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。
例如，马铃薯蔗糖培养基。
3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。
如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。
从培养基的物理状态可分为1.液体培养基：不加凝固剂（常用凝固剂为琼脂）的液体状态培养基。
2.固体培养基：在液体培养基中加入1-2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。
3.半固体培养基：在液体培养基中加入—%凝固剂而成的半固体状培养基。
按照培养基的用途，可将其分为1.加富培养基：加富培养基是指在普通培养基里加过血、血清、动物（或植物）组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基，用以培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物。
2.选择培养基：选择培养基是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。
利用这种培养基可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。
3.鉴别培养基：普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物。
牛肉膏蛋白胨培养基的制备一、实验原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。
由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。
基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl.其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。
在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。
琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。
固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。
由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH值调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。
牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏蛋白胨NaCl水 1000mlpH ～。
二、实验器材1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LnaOH，1mol/LHCl。
2、仪器或其他用具试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（～），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳/皮筋，纱布等。
三、操作步骤1、称量：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl放入烧杯中。
牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。
蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。
2、溶化：在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热，或在磁力搅拌器上加热溶解。
将药品完全溶解后，补充水到所需要的总体积，如果配置固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。
在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按%～%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同时进行，节省时间。
在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。
同时，需不断地搅拌，以防琼脂培糊底烧焦。
配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中。
3、调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达。
反之，用1mol/LHCl 进行调节。
对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。
pH不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
配置pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解而不能凝固。
4、过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。
一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去。
5、分装按实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角烧瓶中。
（1）液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。
（2）固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。
分装三角瓶的量以不超过三角瓶容积的一半为宜。
（3）半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。
6、加塞a)包扎：加塞后，将全部试管用麻绳/皮筋捆好，再外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿塞，其外再用一道麻绳/皮筋扎好。
用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。
三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。
（有条件的实验室，可用市售的铝箔代替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好。
）b)灭菌：将上述培养基以,121℃，20min高压蒸气灭菌。
c)搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
d)无菌检查：将灭菌培养基放入37℃的温室中培养24～28h，以检查灭菌是否彻底。
阿斯毕无氮培养基甘露醇（或蔗糖、葡萄糖） 10gKH2PO4NaClCaCO3 5g琼脂 20g水 1000mlPH ~121℃灭菌30分钟高压蒸汽灭菌一、目的要求1．了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。
2．学习高压蒸汽灭菌的操作方法。
二、基本原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。
导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2．26kJ（千焦）的热量。
这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种，其构造如图。
本实验介绍手提式和立式高压蒸汽灭菌锅的使用方法。
三、器材牛肉膏蛋白胨培养基，阿斯毕无氮培养基，培养皿，立式高压蒸汽菌锅等。
四、操作步骤1．首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
2．放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。
注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。
三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。
再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。
待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。