动物微生物学实验指导
微生物实验指导书-教材
微⽣物实验指导书-教材微⽣物学实验指导书⽬录实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术 (3)实验⼆培养基的配制 (8)实验三从⼟壤中分离微⽣物及纯化 (11)实验四微⽣物的接种技术 (14)试验五细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察 (17)实验六细菌的简单染⾊和⾰兰⽒染⾊ (20)实验七⼤肠杆菌⽣长曲线的测定 (23)实验⼋实验室环境和⼈体表⾯微⽣物的检查 (25)实验九乳酸菌的检测 (28)实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术【⽬的要求】1. 学习并掌握棉塞制作的⽬的、原理及⽅法；2. 学习并掌握玻璃器⽫清洗及包扎⽅法；3.掌握⾼压蒸汽灭菌的基本原理及操作⽅法。
4.了解其它常⽤消毒灭菌技术原理及技术【基本原理】棉塞的作⽤有⼆：⼀是防⽌杂菌污染，⼆是保证通⽓良好。
因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有较⼤的影响。
微⽣物学实验所⽤的器⽫，⼤多数要进⾏清洗、消毒、灭菌，才能⽤来培养微⽣物。
玻璃器⽫的包扎⽅法正确合理，在使⽤过程中才能有效防⽌杂菌的污染。
玻璃器⽫包扎好后，⼀般⽤⾼压蒸⽓灭菌法进⾏灭菌。
⾼压蒸⽓灭菌是将待灭菌的物品放在⼀个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的⽔沸腾⽽产⽣蒸⽓。
待⽔蒸⽓急剧地将锅内的冷空⽓从排⽓阀中驱尽，然后关闭排⽓阀，继续加热，此时由于蒸⽓不能溢出，⽽增加了灭菌锅内的压⼒，从⽽使沸点增⾼，得到100℃以上的⾼温，导致菌体蛋⽩质凝固变性⽽达到灭菌的⽬的。
此外，常见灭菌⽅法还有⼲热灭菌、灼烧灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等。
对空间灭菌常使⽤甲醛加⾼锰酸钾熏蒸、喷洒消毒灭菌药剂等消毒灭菌⽅法。
【实验⽤品】棉花，试管，培养⽫，纱布，三⾓瓶，棉线，量筒，⽜⽪纸（或旧报纸），LDZX-50KBS ⽴式⾼压蒸⽓灭菌锅，常⽤灭菌⽤具、药剂等等。
【⽅法步骤】⼀、棉塞的制作正确的棉塞要求形状，⼤⼩，松紧与试管⼝（或三⾓瓶⼝）完全适合，过紧妨碍空⽓流通，操作不便；过松则达不到滤菌的⽬的。
制作过程见图1，包括取棉花、整理、折⾓、卷紧、成形、塞试管等步骤。
微生物学实验指导-湖南农大
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包括细菌单染技术、细菌的革兰氏染色技术、细菌的芽孢染色技术、细菌的荚膜染色技术和细菌的鞭毛染色技术Ⅰ、细菌的单染技术简单染色通常只用一种染色剂，使细菌整个细胞染上颜色。
但看不清结构。
所以只便于检查细菌的形态、大小和排列方式等。
【实验目的】1、掌握单染色的操作技术2、观察细菌的基本形态【实验原理】单染色即用单纯的种染料进行染色，多数采用美蓝、结晶紫或石碳酸复红等碱性染料。
此法仅能显示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构。
染色前必须将细胞固定，其目的是杀死细菌，并使它粘附在载玻片上。
此外，还可以增加菌体对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
无论用哪种方法都应尽量使细菌维持原有的形态，防止细胞膨胀或收缩。
【实验材料、药品及器具】1、菌种大肠杆菌（Escherichia col i）枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）2、染色液石炭酸品红染色或结晶紫染色液（Stining Solutions）3、无菌水4、洗瓶装蒸馏水5、洗净的载玻片（Slicle）5片6、显微镜、香柏油、接种环、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、二甲苯【实验步骤】1、涂片：取一片干净无油载玻片，在其中央滴一滴无菌水，然后用接种环以无菌操作方法取少许培养好的大肠杆菌，放在载玻片的水滴中涂匀，注意菌量不宜过多，否则，不易看清单个菌体。
微生物学类实验指导书(下)
实验一产酶微生物的分离、纯化与选育酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。
由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。
目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。
通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。
1. 淀粉酶产生菌的分离与纯化1.1 实验目的学习从自然界中分离淀粉酶产生菌，并进行分离与纯化。
1.2 实验原理淀粉是由葡萄糖通过α-1，4糖苷键构成的直链淀粉和α-1，6位有分支的支链淀粉组成的。
按照水解淀粉方式的不同，主要的淀粉酶可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和解枝酶（或异淀粉酶）4大类。
产淀粉酶的微生物有细菌、霉菌和酵母菌等。
利用淀粉遇碘液变为蓝色的特性，将分离的芽孢杆菌（或其他微生物）接种在含有淀粉的固体培养基表面进行培养，利用滴加碘液后菌落周围出现的透明圈判断该菌是否产生淀粉酶及初步判断淀粉酶活力的高低。
1.3实验仪器与材料土壤样品或其他富含淀粉质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、淀粉培养基平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。
1.4 实验方法与步骤1.4.1分离1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液；2）取1：10土壤悬液5 ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h；4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
动物微生物实训报告模板
一、实训背景随着生物科学技术的飞速发展，动物微生物学在农业、医药、环保等领域发挥着越来越重要的作用。
为了提高学生的实践操作能力，加深对动物微生物学理论知识的理解，我们开展了本次动物微生物实训。
本次实训旨在通过实验室操作，使学生掌握动物微生物的基本操作技能，了解微生物在自然界中的作用，以及微生物在动物体内的生态平衡。
二、实训目的1. 熟悉动物微生物实验室的基本操作规程和安全规范。
2. 掌握微生物的分离、培养、鉴定等基本实验技能。
3. 了解微生物在动物体内的生态平衡及其与人类健康的关系。
4. 培养学生的团队协作精神和严谨的科学态度。
三、实训时间2023年X月X日至2023年X月X日四、实训内容1. 微生物实验室基本操作- 实验室安全知识讲解- 实验室常用仪器设备的使用- 无菌操作技术2. 微生物的分离与纯化- 粪便样品的采集与处理- 肉汤琼脂平板划线分离法- 稀释涂布平板法3. 微生物的鉴定- 显微镜观察- 培养基颜色反应- 生化实验4. 微生物的生态学研究- 动物体内的微生物生态平衡- 微生物与动物健康的关系五、实训过程1. 微生物实验室基本操作实验室讲解员首先向学生介绍了实验室的安全知识，包括化学品的正确使用、实验室设备的操作规程以及无菌操作的重要性。
随后，讲解了实验室常用仪器设备的使用方法，如显微镜、培养箱、高压灭菌锅等。
2. 微生物的分离与纯化在粪便样品的采集与处理实验中，学生学会了如何采集和处理动物粪便样品。
在肉汤琼脂平板划线分离法和稀释涂布平板法实验中，学生掌握了微生物的分离和纯化技术。
3. 微生物的鉴定通过显微镜观察，学生学会了观察微生物的形态结构。
在培养基颜色反应实验中，学生根据微生物在不同培养基上的生长情况，初步判断了微生物的种类。
生化实验则进一步验证了微生物的鉴定结果。
4. 微生物的生态学研究实验室讲解员介绍了动物体内的微生物生态平衡，以及微生物与动物健康的关系。
学生通过查阅文献，了解了微生物在动物体内的作用，以及微生物与人类健康的关系。
(完整版)微生物学实验指导书
03微生物在自然界和人类生活中的作用阐述微生物在生态系统、工业生产、医疗卫生等领域的重要性。
01微生物的定义与分类包括细菌、真菌、病毒等微生物的基本概念和分类方法。
02微生物的生物学特性介绍微生物的形态、结构、生理生化特性等。
微生物学概述01实验室安全制度包括实验室安全守则、危险标识识别、紧急情况下的应对措施等。
02实验操作规范介绍实验前准备、实验过程中的操作规范、实验后清理等注意事项。
03生物安全阐述生物安全的概念、生物安全级别的划分及相应防护措施。
实验室安全与规范介绍显微镜的种类、使用方法和维护保养。
显微镜介绍离心机的类型、使用方法和维护保养。
离心机阐述培养箱和摇床的工作原理、使用方法和注意事项。
培养箱与摇床包括分光光度计、电泳仪、PCR 仪等设备的简要介绍和使用方法。
其他常用设备常用仪器与设备实验报告格式包括标题、作者、摘要、正文、结论、参考文献等部分的撰写要求。
数据处理与图表制作介绍数据处理的方法、图表的制作规范及注意事项。
实验结果分析与讨论阐述实验结果的分析方法、讨论实验结果的合理性及可能存在的问题。
实验报告提交与评审说明实验报告的提交方式、评审标准及相关注意事项。
实验报告撰写要求03根据实验需求，选择适当的培养基类型，如营养琼脂、马丁氏琼脂等。
选择合适的培养基按照培养基配方准确称量各成分，加入蒸馏水或去离子水，加热溶解后调整pH 值。
配制培养基将配制好的培养基分装到试管、培养皿等容器中，采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法进行灭菌处理。
培养基分装与灭菌培养基制备与灭菌微生物接种与培养接种前准备准备好无菌操作台、无菌接种环、酒精灯等接种工具，确保无菌操作环境。
微生物接种采用划线法、倾注法等方法将待测微生物接种到培养基上。
培养条件设置根据微生物的生长需求，设置好培养温度、湿度和光照等条件。
观察前准备准备好显微镜、载玻片、盖玻片等观察工具，确保无菌操作环境。
微生物形态观察通过显微镜观察微生物的形态、大小、排列方式等特征，记录并描述观察结果。
实验动物微生物国家标准 (1)可编辑全文
五、取样方法的规定
新国标与原国标在取样方面的不同：
取样要求
取样数量
取样方法
本标准采用与实验动物寄生虫学检测的统一
检测频率、取样数量和取样方法，适当参考实验
动物群体大小来决定抽样数量，并规定抽样点。
五、取样方法的规定
取样要求： 每个小鼠、大鼠、地鼠和豚鼠生产繁殖单元（群
体100只以上），按照动物等级的不同取样。 兔 根据群体大小取样。（没有具体规定）
四、各等级动物检测项目的确定
普通级：排除动物烈性传染病和人兽共患性疾病 的病原体；
清洁级：排除对动物危害大和对科学研究干扰大 的病原；
SPF动物：排除主要潜在感染或条件致病和对科 学实验干扰大的病原体；
无菌动物：无可检出的一切生命体
四、各等级动物检测项目的确定
犬、猴微生物学质量标准是此次国家标 准的补充内容。在确定检测项目方面，主 要抓住烈性传染病和人兽共患病的病原以 及对科学研究干扰大的病原。同时采取把 检测项目分为必要时检测和必须检测两类 的方法，即可做到与国际接轨，又使重点 突出，使检测工作的可操作性更强。
实验小鼠、大鼠的等级划分 补充犬、猴的质量标准 “必检项目”和“必要时检测项目” 各等级动物检测项目确定 取样方法的规定 对动物免疫问题的规定 检测方法的调整
一、实验动物等级的设定
实验动物微生物质量等级的划分是实验动物质量 标准的一个核心问题，也是这次国标修订补充工 作中争论较大的问题，存在不同的看法。之所以 难度较大，就是在这个问题上，即要考虑与国际 接轨，不能停滞保守，保护落后。还要考虑到我 国实验动物现有水平和发展的需要，不能盲目拔 高，脱离开我国现阶段的具体国情，要找到一个 结合点，给国标作出一个恰如其分的定位。
微生物学实验指导
实验一：微生物形态观察实验学时：2实验类型：验证实验要求：选修一、实验目的1．巩固和掌握显微镜油镜的正确使用；2．学习细菌制片和单染色技术；3．观察几种微生物的基本形态。
二、实验内容熟悉掌握显微镜的结构及油镜的使用方法。
掌握几种微生物（枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、单细胞藻、原生动物等）的形态。
三、实验原理、方法和手段1．原理：细菌的涂片和染色是微生物实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能清楚地观察到其形态和构造。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染科和中性染料三大类。
碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合，因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的培养基中时常带负电荷．所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。
酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合，当细菌分解糖类产酸使培养基PH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
中性染料是前两者的结合，又称复合染料，如伊红美蓝和伊红天青等。
简单染色法即仅用一种染料使细菌着色。
此法虽操作简便，但一般只能显示其形态，不能辨别其构造。
染色前必须先固定细菌。
其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上，二是增加其对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
四、实验组织运行要求采用集中授课形式。
五、实验条件(1)菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)原生动物：盾纤毛虫单细胞藻类：盐生杜氏藻(2)仪器：显微镜。
(3)染色液：草酸铵结晶紫或石炭酸复红。
(4)材料：载玻片，擦镜纸．二甲苯．香柏油和玻片搁架等。
六、实验步骤1 涂片在洁净无油腻的玻片中央放一小滴水(或用接种环桃1—2环水)，用无菌的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀．涂成极薄的菌膜。
微生物实验指导
二零零六年十月目录实验一显微镜油浸系物镜的使用 ------------------------------------------3实验二细菌形态的观察-------------------------------------------------------------4实验三细菌简单染色法及口腔微生物的观察 ------------------------5实验四细菌的革兰氏染色---------------------------------------------------------7实验五细菌的芽胞染色 ------------------------------------------------------------8实验六酵母菌的形态观察实验 ---------------------------------------------- 10实验七霉菌的形态观察----------------------------------------------------------- 12实验八细菌大小的测定----------------------------------------------------------- 14实验九细菌数量的测定（血球板计数） ------------------------------ 16实验十培养基的配制--------------------------------------------------------------- 19实验十一消毒与灭菌--------------------------------------------------------------- 21实验十二稀释平板计数及微生物菌落形态的观察 -------------- 27实验十三紫外线对微生物生长的影响 ---------------------------------- 30实验十四抗生素对微生物的作用 ------------------------------------------ 30实验十五比浊法测定大肠杆菌的生长曲线 ------------------------ 31实验十六土壤中好气性细菌的分离与计数(附划线分离法)33实验十七土壤中放线菌的分离与计数 -------------------------------- 35实验十八土壤中真菌的分离与计数 ------------------------------------ 36实验十九纤维素分解试验----------------------------------------------------------- 37实验一显微镜油浸系物镜的使用一、实验目的和实验内容目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法内容：1、学习油浸系物镜的使用方法2、用油镜观察细菌三型和放线菌染色装片二、实验材料和用具细菌三型、放线菌的染色装片，香柏油、二甲苯，显微镜、擦镜纸。
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一、实验目的 1、 学习并掌握细菌芽胞染色法，初步了解芽胞杆菌的形态特征； 2、 学习并掌握细菌荚膜染色法； 3、 学习并初步掌握细菌鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征； 4、 学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。 二、实验内容 1、 细菌芽胞染色； 2、 细菌荚膜染色； 3、 细菌鞭毛染色； 4、 细菌的运动性观察。 三、实验原理
荚膜是包在细菌细胞壁外面的一层黏胶状或胶质状物质，成分为多糖、糖蛋白或多肽， 与染料间的亲和力弱，不易着色，故通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而 荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一浅色或无色的透明圈。由于荚膜的含水量在 90%以 上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形，影响观察结果。
实验 1 细菌的简单染色和革兰氏染色
一、实验目的 1、 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法； 2、 学习显微镜油镜观察的方法； 二、实验内容 1、 细菌的简单染色； 2、 细菌的革兰氏染色； 三、实验原理
简单染色法是一种最基本的染色方法，是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方 法。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，而 碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。所以通常采用碱性染料（如美蓝、结 晶紫、碱性复红、孔雀绿或蕃红）等进行染色，当这类染料解离后，染料离子带正电荷，使 菌体着色。简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。
subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）
的形态图。 2、 革兰氏染色后绘图并注明金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌
（Escherichia coli）两菌的革兰氏染色的反应性。 （二）思考题 1、 在取菌涂片的过程中怎样操作才能保证斜面菌种不受到污染？ 2、 革兰氏染色反应成败的关键操作是哪一步？为什么？ 3、 为什么革兰氏染色法要选用幼龄菌种？
②水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。 ③复染：用番红液染色 5min。 ④水洗、晾干或吸干。 ⑤镜检：先低倍、再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。 结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。 （二）细菌荚膜染色 细菌荚膜染色方法很多，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如 用相差显微镜检查则效果更佳。 1、负染色法 ⑴制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取 2～3 环菌体放入水滴中混匀并涂布。 ⑵干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。★为什么不能在火焰上方烘干？ ⑶染色：在涂面上加复红染色液染色 2～3min。 ⑷水洗：用水洗去复红染液。 ⑸干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。 ⑹涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素 沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。 ⑺镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。 结果：背景灰色，菌体红色，荚膜无色透明。 2、湿墨水法
2、Schaeffer 与 Fulton 氏染色法 ⑴涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。 ⑵晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过 2～3 次。 ⑶染色： ①加染色液：加 5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后，将涂片放在
铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持 15～20min。加热过程中 要随时添加染色液，切勿让标本干涸。★加热时温度可否太高？
⑴制备菌液：加 1～2 滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取 2～3 环菌体于试管中 并充分打匀，制成浓稠的菌液。★为什么要制成浓稠的菌液？
⑵加染色液：加 5%孔雀绿水溶液 2～3 滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混
合。 ⑶加热：将此试管浸于沸水浴，加热 15～20min。 ⑷涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。 ⑸固定：将涂片通过酒精灯火焰 3 次。 ⑹脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。 ⑺复染：加番红水溶液染色 5min 后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。 ⑻镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。 结果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。
1、活材料：培养 12～16h 的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草杆菌 （Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），培养 24h 的大肠杆 菌（Escherichia coli）。
2、染色液和试剂：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红、复红、二甲苯、香柏油。 五、实验用品
⑴ 将浸过油的镜头按下述方法擦试干净: ①先用擦镜纸将油镜头上的油擦去； ②用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦 2～3 次； ③再用干净的擦镜纸将镜头擦 2～3 次，注意擦镜头时向一个方向擦试。
⑵ 观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，并放入盛有 75%乙醇溶液的回收缸中。 ⑶ 显微镜复原并做好使用情况登记。 七、作业与思考 （一）、绘图 1、 简单染色后绘出苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草杆菌（Bacillus
废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、滴管、玻片搁架、镊子、 无菌水、75%乙醇浸泡的消毒棉球、盛有 75%乙醇的玻片回收缸、生物显微镜等。 六、实验方法 （一）简单染色 1、涂片：用消毒棉球擦拭双手，用镊子取干净载玻片一，在载玻片的左、右两端各加一 滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金芽胞杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬 液。再取干净载玻片一块，挑刚制成的苏云金芽胞杆菌浓菌悬液 2～3 环涂在左边制成薄的
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色反应。通过革兰氏染色法可将所有的 细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类。这是因为两类菌的细胞壁结 构和成分的不同，G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交 联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和 碘复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经过蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖 层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低， 因此细菌仍保留初染时的颜色，即紫色。 四、实验材料
细菌的芽胞壁较细胞壁厚而致密，透性低，不易着色，也不易脱色，若用一般染色法只 能使菌体着色而芽胞不着色，芽胞呈无色透明状。芽胞染色法就是基于细菌的芽胞和菌体对 染料的亲和力不同，用不同的染料进行着色，使芽胞和菌体呈现不同的颜色而加以区别。所 有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着 色。当芽胞着色时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。 再用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，形成鲜明的对照，便于 观察。
涂面，将大肠杆菌的浓菌液取 2～3 环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂 面，注意取菌不要太多。 2、晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用文火烘干。★是否还有其它方法？ 3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰 2～3 次固定，以不烫手为宜。★为什么要 进行该步骤？ 4、染色：用将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色 1～2min。 5、水洗：水洗去涂片上的染色液。 6、干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干，勿将菌体擦掉。 7、镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香 柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。★怎样操作才能做到既快而又不 易损坏玻片地调准焦距？ （二）革兰氏染色 1、涂片：涂片方法与简单染色涂片法相同。★涂片厚薄对结果有影响吗？ 2、晾干：与简单染色法相同。 3、固定：与简单染色法相同。 4、结晶紫初染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量的结晶紫染色液染色 1min，以盖 满细菌涂面为宜。之后倾去染色液，用水小心地冲洗。 5、碘液媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染 1min 后用水洗去碘液。★此步可否省去？ 6、脱色：将玻片倾斜，连续滴加 95%乙醇，脱色 20～25s 至流出液无色，立即水洗。★为 什么要立即水洗？ 7、复染：滴加蕃红复染 2～5min，然后用水洗去涂片上的番红染色液。 8、晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 9、镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 10、实验完毕后的处理
细菌的鞭毛极细，直径一般为 10～20nm ,超过了普通光学显微镜的分辨力，只有用电 子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，将鞭毛直径加粗，则在普通光学显微镜
下也能看到它。鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让 它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或 钾明矾等配制而成。
动物微生物学实验指导
中国人民解放军 军需大学
基因工程 军队重点实验室 长春
目录
实验 1 细菌的简单染色和革兰氏染色 实验 2 细菌的芽胞、荚膜、鞭毛染色及运动性观察 实验 3 微生物细胞形态及菌落特征观察 实验 4 培养基制作、灭菌消毒及无菌操作接种技术 实验 5 微生物的分离纯化与稀释平板菌落计数 实验 6 微生物细胞大小测定及显微镜直接计数 附录 1 常用培养基配方 附录 2 常用染色液的配制 附录 3 常用试剂和指示剂的配制 参考书目
细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形 态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果只需查清供试菌是否有鞭毛，可采用悬滴 法或水封片法即压滴法，直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细 菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。
悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有 凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。水封片法是将菌液滴在普通的载玻 片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。