微生物学实验指导
微生物学实验指导大全
微生物学实验指导黄文芳张松编著华南师范大学生命科学学院第一部分基础实验实验1 培养基的配制一、实验目的和内容目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。
内容：1．牛肉膏蛋白陈培养基的配制。
2．高氏1号培养基的配制。
3．马丁氏培养基的配制。
二、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。
试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。
三、操作步骤（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。
其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.61．称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。
牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。
蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2．加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。
若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。
3．调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。
若偏碱，则用lmol/L HCl进行调节。
pH的调节通常放在加琼脂之前。
应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4．过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。
但是供一般使用的培养基，这步可省略。
微生物学类实验指导书(下)蛋白酶产生菌活力测定及果酒酵母分离纯化
实验一产酶微生物的分离、纯化与选育酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。
由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。
目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。
通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。
2. 蛋白酶产生菌的分离与纯化2.1 实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化。
2.2 实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。
也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。
2.3 实验仪器与材料土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。
2.4 实验方法与步骤2.4.1 分离1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液；2）取1：10土壤悬液5ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h；4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
2.4.2 筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基，再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24-48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径。
水微生物学实验指导书
水微生物学实验指导书武汉科技大学城市建设学院给排水工程系2007.12目录页实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察活性污泥生物相的观察实验二培养基的制备及灭菌微生物的纯种分离及计数实验三微生物生理生化特性实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察一、实验目的1.了解普通光学显微镜的构造，学习显微镜的使用方法和保养方法。
2.观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的个体形态，学会生物图的绘制。
二. 实验内容1．显微镜的使用方法和保养方法2．微生物形态的观察三、实验仪器、设备及材料1.光学显微镜、载玻片、盖玻片等2.示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌。
四、实验原理显微镜的结构和各部分的作用图1是微生物实验常用的双目电光源生物显微镜，其构造分机械和光学两部分：机械部分主要包括：1．镜筒镜筒是双筒，两筒间距离可调，长度一般是160mm。
它的上端装有接目镜，下端有回转板。
回转板上一般装有3个接物镜。
2．载物台载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。
两旁有弹簧夹，用以固定标本或载玻片。
有的载物台上装有自动推物器。
3．调节器镜臂旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降载物台，调节接物镜与所需观察的物体之间的距离。
光学部分主要包括：1．接目镜一股使用的显微镜具有2—3种放大倍数的接目镜，其上常刻有“5×”、“10×”或“16×”等数字及符号。
意即使用时可放大5倍、10倍或16倍。
观察微生物时常用放大10倍或16倍的接目镜。
2．接物镜接物镜装在回转板上．可分低倍镜、高倍镜和油镜3种，其相应的放大倍数常是10、40 (45)、100。
通常显微镜的放大倍数等于接物镜与接目镜放大倍数的乘积。
例如：用放大40倍的接物镜(高倍镜)与放大10倍的接目镜时所得的物象的放大倍数为40×10＝400。
如果用放大100倍的接物镜则放大倍数为100×10＝1000。
卫生微生物实习指导
卫生微生物学实验指导（仅供预防医学本科教学使用）姓名年级班级指导老师实验一自来水中指示微生物的检测 — 菌落总数的测定目的及意义掌握菌落总数实验的基本原理和意义；熟悉水样采集要求，熟悉菌落总数实验的全部过程和具体操作方法；了解无菌操作和避免污染的概念。
根据不同目的，选择有代表性的一种或一类微生物，对检测、研究对象中的该微生物状态进行定性或定量的描述，并赋予其特定的标志意义，这类微生物即所谓的指示微生物。
指示微生物在污水与饮用水处理、环境监测、产品质量控制、消毒灭菌、卫生监督等领域广泛应用。
最常用的为菌落总数和大肠菌群，菌落总数用于评价被检测样品的一般卫生微生物学质量，即微生物污染程度和安全性。
菌落总数是指被检测样品在单位重量（g）、溶剂（ml）、表面积（cm2）或体积（m3）内，所含有的能在某种培养基上经过一定条件培养后生长的微生物菌落总数。
仪器设备和试剂1. 仪器设备电子天平、pH计、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台。
2. 器材和试剂100-1000μl移液器、1000μl吸头、广口旋塞试剂瓶、培养平皿；1.5%硫代硫酸钠溶液、营养琼脂。
实验方法1、样品来源内蒙古医科大学金山校区C座自来水2、实验准备1. 配置1.5%硫代硫酸钠溶液2. 取400μl 1.5%硫代硫酸钠溶液加入容积为250 ml的蓝盖试剂瓶中，该瓶作为为取样瓶（硫代硫酸钠的作用是中和自来水中的消毒剂）。
3. 准备3个洗干净的培养平皿，用报纸包严。
4. 配置80ml固体营养琼脂。
5. 将上述取样瓶、营养琼脂和培养平皿101.3kPa高压蒸汽灭菌20分钟。
6. 灭菌过程中将超净工作台或无菌室打开紫外灯照射30min。
3、样品采集1.先对欲采集样品的水龙头进行消毒，然后将水龙头完全打开，放水5分钟后收集样品，采水量为瓶容量的80%左右。
2.采样后及时做好标记，开始检测。
四、检测步骤1.将水样用力摇20～25次，使微生物充分的分散开来。
2.分别稀释水样10倍、100倍、1000倍与水样原液一起待检。
微生物学实验指导-湖南农大
微生物学实验指导生物秀—专心做生物！ｗｗｗ．ｂｂｉｏｏ．ｃｏｍ易生物－领先的生物医药商务平台ｗｗｗ．ｅｂｉｏｅ．ｃｏｍ生物秀论坛－学术交流，资源共享，互助社区ｗｗｗ．ｂｂｉｏｏ．ｃｏｍ／ｂｂｓ／湖南农业大学植物科学实验教学中心2006年8月目录实验一细菌染色技术 (2)实验二细菌的芽孢染色和鞭毛染色 (6)实验三植物病源真菌的形态观察 (7)实验四植物病原细菌及其所致病害症状观察 (13)实验五接合菌门真菌基本形态及所致病害观察 (17)实验六担子菌门真菌的基本形态及所致病害的观察 (22)实验七有丝分裂孢子真菌的基本形态及所致病害的观察 (27)实验八病原物的分离培养与接种 (28)实验九植物的抗病性和病原菌的生理分化 (29)实验一细菌染色技术细菌个体微小，普通光学显微镜下不易直接观察，故常用染色技术使细菌细胞着色。
包括细菌单染技术、细菌的革兰氏染色技术、细菌的芽孢染色技术、细菌的荚膜染色技术和细菌的鞭毛染色技术Ⅰ、细菌的单染技术简单染色通常只用一种染色剂，使细菌整个细胞染上颜色。
但看不清结构。
所以只便于检查细菌的形态、大小和排列方式等。
【实验目的】1、掌握单染色的操作技术2、观察细菌的基本形态【实验原理】单染色即用单纯的种染料进行染色，多数采用美蓝、结晶紫或石碳酸复红等碱性染料。
此法仅能显示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构。
染色前必须将细胞固定，其目的是杀死细菌，并使它粘附在载玻片上。
此外，还可以增加菌体对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
无论用哪种方法都应尽量使细菌维持原有的形态，防止细胞膨胀或收缩。
【实验材料、药品及器具】1、菌种大肠杆菌（Escherichia col i）枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）2、染色液石炭酸品红染色或结晶紫染色液（Stining Solutions）3、无菌水4、洗瓶装蒸馏水5、洗净的载玻片（Slicle）5片6、显微镜、香柏油、接种环、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、二甲苯【实验步骤】1、涂片：取一片干净无油载玻片，在其中央滴一滴无菌水，然后用接种环以无菌操作方法取少许培养好的大肠杆菌，放在载玻片的水滴中涂匀，注意菌量不宜过多，否则，不易看清单个菌体。
土壤微生物学实验指导
土壤微生物学实验指导实验一培养基的制备和灭菌4学时一、实验目的要求1.掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法和培养基的制备方法。
2.了解消毒和灭菌的原理，并掌握各种灭菌方法的操作步骤。
二、实验方法及原理(一)培养基的制备培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配置而成的一种混和营养基质，用以培养或分离各种微生物。
因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素）和水。
根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。
微生物的生长繁殖除需一定的营养物质以外，还要求适当的pH范围。
不同微生物对pH 要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基是中性或偏碱性的。
所以配制培养基时，都要根据不同微生物对象用稀酸或稀碱将培养基的pH调到合适的范围。
但配制pH低的琼脂培养基时，如预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固，因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌后，在调整pH。
此外，由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，此外，已配制好的培养基必须立即灭菌，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基的酸碱度而带来的不利影响。
（二）干热和高压蒸汽灭菌原理干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。
因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160-170℃），时间长（1-2小时）。
但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烤焦，甚至引起燃烧。
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。
食品微生物学实验指导书
食品微生物学实验指导（食工、烹饪专业用）目录实验一显微镜的构造及使用方法 (5)实验二酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别 (9)实验三霉菌的形态观察 (11)实验四细菌的简单染色与形态观察 (13)实验五细菌的革兰氏染色与芽孢染色 (14)实验六培养基的制备与灭菌 (16)实验七细菌的分离培养及培养性状的观察 (22)实验八酵母菌细胞计数 (30)实验九食品中细菌总数的测定 (32)实验十食品中大肠菌群数的测定 (37)附录一常用染色液 (44)附录二常用培养基配方 (45)实验室安全守则1.进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。
2.在进行高压、干燥、消毒等工作时，实验人员不得擅自离开现场，认真观察温度、时间，蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接加热，应置水浴锅上进行。
3.严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液、病原体溅出容器外时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方能离开现场。
4.实验完毕，两手用清水肥皂洗净，必要时可用（杀菌剂）新洁尔灭、过氧乙酸液浸泡手，然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。
5.实验完毕，及时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处理，并填写日常工作记录。
6.每日实验结束，认真检查水、相关电源是否关闭和正在使用的设备运转是否正常，并认真记录。
关好门窗，方可离去。
实验室检验总则一、样品的采集（一）采样目的确保采集的样品能代表全部被检验的物质，使检验分析更具代表性。
（二）采样原则1.采集的样品要有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在，同时能反映全部被检食品的组成、质量和卫生状况。
2.应设法保持样品原有微生物状况，在进行检验前不得污染，不发生变化。
3.采样必须遵循无菌操作程，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新洁尔灭、酒精等消毒物灭菌，更不能含有此类消毒药物，以避免杀掉样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可使用。
环境微生物学实验指导
微生物实验室安全守则基本原则：1.在实验台上不可放臵任何非实验必须的物件或私人用品。
2.每次工作开始及终止时，必须清理并用杀菌液擦拭实验台面 (杀菌液的种类及浓度可参考表1中所列，最常用的为 70% 酒精水溶液) 。
表1、常用杀菌药品名称及其溶液的浓度3.在操作过程中绝不可抽烟、吃东西。
4.在操作过程中必须穿上清洁的实验服，若蓄长发须将长发束好，在实验室中任何时候皆应有整齐的装束。
5.实验室内的各种培养基、仪器，尤其是各种实验的样品及微生物培养，皆不可任意移至实验室外。
6.实验室內任何一种微生物样品，在处理时均须遵守下列事项：◎决不可用口吸取任何一种微生物样品。
◎如果微生物样品打翻，必須以吸满杀菌液的卫生纸加以覆盖 15 分钟后，卫生纸才可移除，并依照一般微生物实验室的废弃物加以处理。
◎任何微生物样品在室內搬移时都必须加盖。
7.在任何操作过程的开始前及终止后，双手都必须用清洁剂清洗（例如：70 % 的酒精水溶液）。
微生物实验室內，任何微生物的样品、废弃物 (对具感染性的废弃物应特别注意) 都必须高温高压灭菌后，才能以一般垃圾处理。
操作时注意事项:1.机器运转中如有不正常现象，应立即报告实验老师或任课教师，若时间急迫，可先切断电源。
2.发现仪器故障者，应在机器上清楚标示，尽到告知义务，以免发生危险。
3.任何药品使用前需详知其性质及使用方法，配制或使用有毒物品需戴手套口罩等操作，挥发性溶剂则需在通风柜内使用，并应随时加盖，以免发生危险。
4. 挥发性溶剂如酒精、丙酮、乙醚、苯、二硫化碳、冰醋酸、石油醚、甲苯、二甲苯等均易燃烧，故切勿靠近火焰。
不溶于水的有机溶剂着火时，切勿以水灭火，以免更助长火势蔓延。
5.不得将纸屑、玻璃碎片等流入排水管。
6.当加热试管内物质时，为避免烧破试管或致使试管內物质喷出，应常旋转试管或避免仅加热一处，切勿将试管口对着自己或邻座同学，以免试管内物质喷出伤害自身或其他同学。
7.稀释浓硫酸或其他强酸应徐徐将浓硫酸加入水中，并轻轻摇晃混合，切勿加水于酸中，以免因稀释时产生大量的热，致硫酸因沸腾而溅出。
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实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、大小的测定和计数一、实验目的1、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片，学会绘制生物图3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法4、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法二、实验器材1、显微镜2、微生物标本装片3、目、物镜测微尺4、血球计数板5、酵母菌液或霉菌孢子液6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等三、显微镜的构造、原理及使用方法1、构造现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜，由机械装置和光学系统两大部分组成。
机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器；光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。
显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。
2、操作在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。
一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。
四、微生物大小的测量原理和方法微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。
用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。
1、目镜测微尺（图1-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。
测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的12中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
2、物镜测微尺（图1-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm 等分为100格，每格长l0μm （即0.0lmm ），是专门用来校正目镜测微尺的。
校正时，将物镜测微尺放在载物台上，由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即物镜测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。
3、目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。
先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度(图1-3)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。
因为物镜测微尺的刻度每格长l0μm ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。
例如目镜测微尺5小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为l0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。
由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。
4、细胞大小的测定移去物镜测微尺，换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。
测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。
结果计算： 长μm ＝平均格数×校正值宽μm ＝平均格数×校正值大小表示： 宽μm ×长μm图1-1 目镜测微尺图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正3五、微生物细胞数量的测定原理和方法1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图1-4），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。
但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm ，则计数区的面积为l mm 2，每个小方格的面积为1/400mm 2。
盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm ，所以每个计数区的体积为0.1mm 3，每个小方格的体积为1/4000mm 3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
已知：1mm 3体积=10 mm ×10 mm ×10 mm=1000mm 3所以：1mm 3体积应含有小方格数为1000mm 3/1/4000mm 3=4×106个小方格，即系数K=4×106 。
因此：每ml 菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N ）×系数（K ）×菌液稀释倍数（d ）2、计数方法（1）视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释，以每小格的菌数可数为度。
（2）取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
（3）将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。
也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，图1-4 血球计数板 图1-5 计数室不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。
然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。
（4）静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。
由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
（5）计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。
如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。
如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
（6）对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。
每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
（7）测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。
洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
六、实验结果和思考题1、结果（1）绘制所观察的一种或两种微生物的形态，并测量其大小。
2、思考题（1）在显微镜的使用过程中须注意哪些问题？（2）根据你的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？4实验二培养基的配置与灭菌一、实验目的1、明确培养基配置的原理2、掌握配制培养基的一般方法和步骤3、掌握灭菌锅的使用方法二、实验器材1、药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、HCl、NaOH、琼脂、蒸馏水2、高压灭菌锅、电炉3、量筒、铝锅、三角瓶、天平等三、基本原理对照培养基配制的基本原则：目的明确、比例协调、pH适宜、经济节约。
本次需要配制的培养基是为下次从土壤中分离细菌用的，所以选择配制适合细菌生长的牛肉膏蛋白胨培养基。
这是一种应用最广泛最普遍的细菌基本培养基，牛肉膏提供碳原和能源，蛋白胨主要提供氮源，NaCl提供无机盐，用HCl和NaOH调节pH，还要加入一定量的琼脂最为凝固剂。
琼脂在大于96ºC时融化，小于40ºC时凝固，通常不被微生物利用。
5牛肉膏蛋白胨培养基的配方是：牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl 5g琼脂25g水1000mlpH 7.2~7.4四、实验内容和步骤（一）配制牛肉膏蛋白胨培养基1、计算：根据下次实验的要求和本组人数，每小组需要牛肉膏蛋白胨培养基的量为分离所用9平皿、划线所用每人一平皿、每人一支试管斜面所需培养基的总和，大概350ml。
按照配方，计算出每种药品的需要量。
2、配制溶液：取一定容量的烧杯或搪瓷杯盛入适量蒸馏水，按培养基配方逐一称取各种成分，依次加入水中溶解。
牛肉膏、蛋白胨可加热促进溶解，待全部溶解后，加水补足所需容量。
注意：加热时要不断搅拌，避免琼脂糊底烧焦。
3、调节pH：用精密pH试纸测量培养基原始pH值。
若偏酸，逐滴加入1mol/L的NaOH溶液，边加边搅拌，随时测pH值，直至达约7.6。
若偏碱，同法用1mol/L的HCl溶液调节。
注意不要调过头，避免回滴，否则会影响培养基内各离子的浓度。
4、分装：将配制好的培养基分装入三角瓶和试管中，三角瓶装量不要超过容积的1/2，试管装量不要超过试管高度的1/3，约为5ml。
注意分装速度要快，避免温度过低后琼脂凝固。
5、加塞：分装完毕后，在试管口和三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入并保证良好的通气性能。
6、包扎：加塞后，三角瓶外包一层牛皮纸或两层旧报纸，用麻绳以活结形式扎好；试管先用橡皮筋全部捆好，再在棉塞外包牛皮纸或旧报纸，防止灭菌时冷凝水润湿棉塞。
用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
7、灭菌：将包扎好的培养基放进高压蒸汽灭菌锅内，0.103MPa，121ºC，20min，高压蒸汽灭菌。
8、搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷却至50ºC左右，将试管口端搁在玻棒或其它合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
9、无菌检查：将灭菌的培养基放入37ºC的培养箱中培养24~48h，检查灭菌是否彻底。
（二）下次实验无菌器材的准备1、无菌水：每组在5支普通试管或刻度试管中装入9ml蒸馏水，加塞、包扎、待灭。
2、每组包扎一支1ml移液管、15只培养皿，待灭。
准备好后与培养基一起放入高压灭菌锅灭菌。
6五、思考题1、配制培养基的过程中应该注意些什么问题？为什么？2、培养基配制好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？附1：棉塞的制作棉塞的作用一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。
因此要求棉塞的形状、大小、松紧与容器口尽量适合，过紧则妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的。