纤维素分解菌的分离培养

纤维素分解菌的分离培养

来源：添加时间：2010-1-22 9:50:00

纤维素是组成植物细胞壁的主要成分，是地球上存在量最为丰富的有机物。它性状比较稳定，不易分解。因此，它是一类数量庞大的环境污染物，同时又是一项可开发利用的宝贵资源，它的综合利用具有广阔前景。自然界有一部分细菌、放线菌和真菌能诱导产生纤维素酶，进行纤维素的分解。能分解纤维素的好氧细菌主要有：

噬纤维黏菌属(Cytophaga)、

生孢噬纤维黏菌属(Sporocytophaga)、

纤维弧菌属(Cellvibrio)，

分解纤维素的厌氧细菌有：

奥氏梭菌(Clostridium omelianski)、

高温溶纤维梭菌(C. Thermocelluloseum)等。

真菌中主要有以下属的一些种：

木霉(Trichoderma)、

葡萄状穗霉(Stachybotrys)、

葡萄孢霉(Botrytis)、

曲霉(Aspergillus)、

青霉(Penicillium)、

毛壳霉、

好热霉 (Thermomyces)。

放线菌的诺卡氏菌属（Nocardia）、链霉菌属（Streptomyces）、小单胞菌属（Micromono spora）中也都有一些能分解纤维素的种。

(1) 好气性纤维素分解菌的分离

① 分离源

草地表层土壤、堆腐烂植物体、湖水等可作为好气性纤维素分解菌的分离源

② 培养基

Dubos纤维素培养基：

NaNO30.5g K2HPO41g

Fe2(SO4)3·7H2O微量H2O1000mL

MgSO4·7H2O0.5g pH7.5

KCl0.5g

滤纸剪成小条，放入试管中，使略露出液面.

Hutchison培养基：

KH2PO41g FeCl30.01g

MgSO4·7H2O0.3g NaNO3 2.5g

CaCl20.1g H2O1000mL

NaCl0.1g pH7.2～7.4

若制平板，加琼脂18～20g，121℃，灭菌15分钟.

③ 操作方法

a. 将采取的待分离样品，用无菌水制成10-1～10-3不同稀释度的悬液。

b. 用无菌移液管吸取上述样品悬液，接种于装有10mL Dubos纤维素培养基的试管内

c. 置于25～27℃条件下培养。

每天观察培养管内的变化，注意液面附近的滤纸变薄或出现斑点。如果分解旺盛甚至可见滤纸条被完全切断。

d. 将无菌的Hutchison培养基融化，注入灭菌培养皿内，制成平板。把上述试管内正在破碎的滤纸适当稀释制成悬液，吸取0.5mL接入平板上，用玻璃推棒涂布均匀，再在琼脂表面覆盖一张无菌滤纸，用玻璃棒（或玻璃刮刀）压平，使滤纸紧贴在琼脂表面。

e. 把上述平板置于底部盛水的干燥器隔板上，28～30℃，培养7～10天。

f. 纯化分离

用接种环挑取滤纸上的菌落，在含0.1%葡萄糖（过滤除菌）的赫氏平板上划线分离。重复数次，直至分纯。

g. 将滤纸剪成小片，灭菌后放到无碳源的赫氏培养基平板上。把在葡萄糖赫氏平板上生长的菌落，移接到滤纸片上，并在皿底相对应地编号。经培养后确认分解滤纸的菌种，从相应的葡萄糖赫氏平板上移接到赫氏液体培养基（不加琼脂）的滤纸条上保存。

⑵ 厌气性纤维素分解菌的分离

取1g土壤（或稀释到10-2的菌悬液1mL），接种到已灭菌的磷酸铵钠培养基中，28～30℃，严格厌氧培养。培养2周左右，滤纸溶解后，再重复移殖3～4次，或取滤纸上生长的斑点，黄色部分，经稀释后在平板上涂布分离。

磷酸铵钠培养基配方如下：

Na(NH4)HPO42g CaCO35g

KH2PO41g CaCl2·6H2O0.3g

MgSO4·7H2O0.5g蛋白胨1g

H2O1000mL

分装试管，液层要较高，以利于深层培养。同时，插入滤纸条，一端露出液面。121℃灭菌20分钟。

注意：滤纸使用前必须检查是否有淀粉。可在滤纸上滴加稀碘液，如显兰色，示有淀粉存在。则可用1%稀醋酸浸泡一昼夜，用碘液检查确认无淀粉后，再用2%苏打水冲洗至中性，干热灭菌后备用。

纤维素分解菌培养基

培养基1（g/L）：

KH2PO4 1.00 ；MgSO40.3 ；NaCl 0. 1；NaNO3 2.5 ；CaCl2·6H2O 0. 1 ；

FeCl30. 01 ；稻草粉20；pH 自然。

培养基2（g/L）：

尿素 5.00 ；KH2PO4 1.00 ；K2HPO4 1.00 ；FeSO4·7H2O 0.05 ；MnSO4·H2O

0.02 ；MgSO4·7H2O 0.5 ；酵母浸出液0.2 ；稻草秆20 ；pH＝7.0－7.2 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基（g/L）：

CMC-Na 20 ；Na2HPO4 2.5 ；KH2PO4 1.5 ；蛋白胨2.5 ；琼脂20 ；

pH 7.0—7.5