蛋白纯化AKTA操作说明

AKTA pure操作说明

分子筛层析操作步骤：

1. 开机：

打开AKTA pure开关，看指示灯，泵同步（泵内有注入液体的声音）。

2. 打开系统：

打开电脑：双击Unicorn 7.0打开系统，进入log on 界面，用户名默认为Default，输入密码：default，点ok键，出现提示对话框，继续点确定，进入系统。

注意：进入系统时会弹出三个界面：System Control界面，Evaluation界面和Administration界面。其中system Control界面为主操作窗口，所有的设置选项都是在该界面下完成：Manual---Execute Manual instructions---......；Evaluation界面为结果数据查看及处理窗口；Administration界面为Unicorn 7.0系统设置界面。

3. 洗泵：

把A1泵头从20%乙醇中取出，用去离子水冲洗，放入分子筛缓冲液中，在System

Control界面下，点击manual---Execute Manual instructions---Pumps---Pump A wash---点开inlet，选择A1---Excuse。

4. 设置系统参数：

设柱压：Alams---alam systerm pressure---high alam---设置柱压---Execute；

设流速：Pumps---System flow ---设置system flow（1mL/min）---Execute。

注意：流速和柱压设置参照“GE蛋白纯化柱表”，不要超出最高限制。

5. 装柱子(先上后下)：

接柱子的上面：拧下连接进样阀和检测器之间的线，等进样阀出口有液体流出时，拧开柱上面线头的螺帽，将它连到进样阀出口；

接柱子的下面：去掉柱下端连接的注射器，连上接头，连上一段线，待液体滴出滴出液体滴到检测器上的连接口的洞里，滴满，将接头连到检测器的连接口里。

6.平衡柱子：

分子筛buffer平衡柱子，一般要两个小时左右，盐离子浓度达到5.5%左右。

7.设置系统及收集参数：

命名：先end---Manual instructions，点击browse，弹出select result name&location 界面，点开文件夹“defaultHome”，找到文件夹“labdata”，点开，选择自己名字

首字母缩写文件夹(已创建)，在界面下方“name”指令框进行命名。

注意：命名时要标明日期，柱子型号，样品名称。

设流速：Pumps---System flow---设流速（1 mL/min）---Execute；

设柱压：Alams--- alam systerm pressure---high alam---设置柱压---点击Execute；

洗A泵：Pumps---Pump A wash---点开inlet，选择A1---Excuse；

紫外调零：Monitors---Auto zero UV---Execute；

设置收集体积：Fracton collection---peak fractionation---fraction size---设置收集体积---

Execute；

一般设为1 mL(可根据实际情况调整)。

设置收集水平：Fracton collection---peak fractionation parameters---Start level---设置起始收集水平--- Execute。

注意：对于初次纯化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水平可设低些，

如10 mAU,避免损失蛋白。

8.上样：

冲洗Loop环：取5mL注射器，吸取5 mL分子筛（不能有气泡），从进样口注射2倍Loop体积的分子筛来清洗Loop环；

蛋白样品处理：取出蛋白样品（< 2 mL），12000 rpm离心3 min，把上清转移至新的离心管管，重复一次，以去除沉淀，避免堵塞系统；

手动蛋白上样：把蛋白样品转移至注射器内，从进样口把样品注射入Loop环内；

注意：上样时应小心操作，首先弹出注射器内的气泡，随后稍推注射器，

使注射器出口处悬挂一样品液滴（别太用力，导致液滴滴落），然后把

注射器插入进样口，把蛋白样品推入Loop环中。

Inject:点击Flow path---injection valve---点开position选项---inject---Execute---走2倍Loop 体积的分子筛缓冲液；

Load:点击Flow path---injection valve---点开position选项---manual load---Execute，调回Load状态。

9.收集目标蛋白：

参照标准蛋白曲线，估计样品出峰位置，收集蛋白样品，做好标记，过完后，peak fracstop 900 停止收集。

10. 20%乙醇平衡柱子：

等精氨酸峰出来，离子浓度平衡后，点击pause，进分子筛的buffer的泵头用去离子水洗，放入20%的乙醇中，continue---洗泵（A1泵），平衡柱子。20%的乙醇平衡柱子，一般要两小时左右，盐离子浓度达到0%。

11.收柱子（先下后上）：

调节流速至0.5 mL/min，拧下柱下面的接头，连上注射器，再调流速至1 mL/min，注射器内吸入3-5 mL 20%乙醇，取下柱上面的接头看是不是往外流液体，因为注射器内有压力，液体会倒流，盖子内滴满液体，立即拧上盖子，防止进气泡，将进样阀的线接到检测器上。

12.关闭系统：

点击End 关闭系统界面，关闭AKTA pure电源，关电脑。

2018-09-01