蛋白纯化策略和工艺
重组蛋白[Recombinant Protein]纯化的基本策略
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重组蛋白[Recombinant Protein]纯化的基本策略一、融合表达蛋白的纯化：融合表达蛋白可以在原目标分子之外带有GST肽段或（His）6肽段，从而使得可以分别用Glutathione Sepharose凝胶或Chelating Sepharos e凝胶进行亲和色谱分子，一步可以达到~90%的纯度，经过特异蛋白酶切后，再进行离子交换及高分辨凝胶过滤一般便可以达到所需的纯度（95~99%）。
二、包含体表达蛋白的纯化：在E.coli系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。
一般采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利用凝胶过滤色谱进行复性（已有多种凝胶可以促进蛋白质的复性的报道）。
以下以rhGM-CSF（重组人粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子）的下游纯化工艺为例：E.coli细胞，超声破碎，离心收集包含体，用7mol/L盐酸胍溶解包含体蛋白，作1：70稀释使蛋白复性，加硫酸铵至一定浓度后，上样于 P henyl-Sepharose 6 FF（high sub）色谱柱，活性组分再上Q-Sepharo se FF进行离子交换，最后上Superdex 75 prep grade凝胶进行凝胶过滤色谱，最终获得了纯度较高的rhGM-CSF，同时，DNA及内毒素去除率均很高。
如下表所示：步骤体积（ml）蛋白（mg）内毒素（EU/ml）DNA（pg/ml）起始（复性样品）4344 490 421 180HIC疏水柱 880 220 243 0.46AIEX阴离子交换 620 88 251 0.14GF凝胶过滤 1045 62 9 0.08三、周质表达的蛋白的纯化：可用渗透压休克方法，使周质释放，然后利用扩张床技术将含有菌体的悬液直接上柱（STREAmlINE系列凝胶），菌体穿过而表达的蛋白上柱。
akta蛋白纯化 (3)
akta蛋白纯化引言蛋白纯化是生物化学研究中非常重要的一步。
在研究蛋白的结构和功能时，通常需要从混合物中分离和纯化目标蛋白。
akta系统作为一种常用的蛋白纯化设备，可以自动化地进行蛋白纯化过程，大大提高实验的效率和准确性。
本文将介绍akta蛋白纯化的基本原理和操作步骤，以及常见的纯化策略。
akta蛋白纯化的基本原理akta蛋白纯化系统通过色谱技术实现蛋白的分离和纯化。
色谱技术是一种基于蛋白在固定相和流动相之间相互作用的分离方法。
akta系统利用液相色谱柱来实现这一过程，可以根据蛋白的种类、大小、电荷、亲疏水性等特性选择不同的柱子和流动相，从而实现高效的分离和纯化。
akta蛋白纯化的操作步骤步骤一：准备工作在进行akta蛋白纯化之前，需要进行一些准备工作。
首先，准备好需要纯化的蛋白样品，可以是细胞裂解液、培养基等。
其次，准备好色谱柱和流动相，根据蛋白的性质选择合适的柱子和流动相。
最后，确保akta系统和相关设备已经连接并正常运行。
步骤二：设定操作参数在进行akta蛋白纯化之前，需要设定一些操作参数。
首先是选择合适的柱子和流动相，根据蛋白的特性选择合适的参数。
其次是设定流速和梯度，根据实验需求进行调整。
最后，设定采集参数，包括采集分数和容器类型等。
步骤三：样品加载和洗脱将准备好的蛋白样品加载到akta系统中的色谱柱中。
在加载前，可以进行一些预处理，如预洗柱子、平衡流动相等。
加载完成后，开始进行洗脱步骤，通过改变流动相的成分或浓度来逐渐洗脱目标蛋白。
通过监测洗脱曲线或使用特定检测方法，可以确定目标蛋白的洗脱时间和分数。
步骤四：分析和收集在洗脱过程中，可以通过吸光度检测或使用其他特定方法对洗脱的分数进行分析，以确定目标蛋白的纯度和浓度。
根据需要，可以选择采集纯化后的目标蛋白，纯化后的蛋白可以被用于进一步的实验研究。
常见的akta蛋白纯化策略akta蛋白纯化系统可以根据不同的需求应用于不同的纯化策略。
以下是一些常见的纯化策略：方法一：亲和层析亲和层析是一种基于蛋白质与配体之间的特异性相互作用进行纯化的方法。
常用的蛋白质纯化方法和原理
常用的蛋白质纯化方法和原理蛋白质的纯化是生物化学研究中非常重要的一步，纯化蛋白质可以用于结构解析、功能研究、动态过程研究等各种生物学实验。
常用的蛋白质纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、逆渗透法和层析法等。
下面将对这些方法的原理和步骤进行详细阐述。
1. 盐析法盐析法是根据蛋白质在溶液中的溶解性随盐浓度的变化而变化的原理进行蛋白质的纯化。
该方法是利用蛋白质在高盐浓度下与水结合能力降低，使其从溶液中沉淀出来。
应用盐析法时，需要先调节溶液的盐浓度使蛋白质溶解，然后逐渐加入盐使其过饱和，蛋白质便会析出。
最后通过离心将蛋白质的沉淀物分离，得到纯化的蛋白质。
2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是利用凝胶的pores 来分离蛋白质的一种方法。
凝胶通常是聚丙烯酰胺（也称作Polyacrylamide）或琼脂糖。
研究者将蛋白质样品加入到过滤膜上，较小的蛋白质能够通过pores，较大的分子则被排出。
通过选择不同大小的凝胶孔径，可以根据蛋白质的大小来选择合适数目的过滤膜。
凝胶过滤法需要进行缓冲液体积的连续换流，将蛋白质与其他杂质分离开来。
3. 离子交换色谱法离子交换色谱法是利用蛋白质与离子交换基质之间静电吸引力的不同而分离的方法。
离子交换基质通常是富含正离子或负离子的高分子材料。
在离子交换色谱法中，样品溶液在特定的pH 下流经离子交换基质，带有不同电荷的蛋白质能够与基质发生反应，吸附在基质上。
为了获得纯化蛋白质，需要通过梯度洗脱，逐渐改变缓冲液pH 或离子浓度，使吸附在离子交换基质上的蛋白质逐渐释放出来。
4. 亲和色谱法亲和色谱法是利用蛋白质与特定的配体相互作用特异性进行分离的方法。
配体可以是天然物质，如金属离子、辅酶或抗体，也可以是人工合成的结构。
在亲和色谱法中，样品溶液经过含有配体的固定相，与配体发生特异性相互作用，蛋白质与其它组分分离。
然后可以通过改变某些条件（如pH、温度或离子浓度）来洗脱纯化的蛋白质。
蛋白纯化原则和技术介绍
蛋白纯化原则和技术概览无论是蛋白研究还是应用，通常需要将蛋白利用不同的生物系统表达出来，然后进行分离和纯化。
研究实验室通常需要纯化微克或毫克级别的蛋白质，而工业上需要纯化数千克甚至数吨的蛋白质。
因此，蛋白纯化非常重要。
纯化过程中，主要需要考虑宿主污染、样品的可溶性、蛋白结构的完整性和生物活性。
蛋白的纯化可大致分为样品捕获、中度纯化阶段和精细纯化阶段3个阶段。
✓样品捕获：分离、浓缩和稳定化处理；✓中度纯化：去除核酸等其他细胞成分，可使用硫酸铵沉淀法；✓精细纯化：将靶蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，常用方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
蛋白纯化指导原则1. 明确目标，避免过度纯化或者纯化不够；表1. 对蛋白样本纯度要求的例子。
2、明确样本特性和主要的杂质，选择合适的纯化方法；可以通过检测蛋白稳定性窗口（如pH值、离子强度）和蛋白基础数据（如蛋白大小、等电点pl、疏水性、可溶性等）快速确定纯化技术组合。
3、能够快速检测蛋白的回收率、活性和杂质情况；4、尽量减少步骤，从而避免样本损失过多和活性降低过多；5、尽早除去蛋白酶等对样品有损害的杂质；6、尽量少使用添加剂，否则可能需要额外的步骤去除添加剂。
蛋白纯化方法由于样品和蛋白的性质各异，所含杂质也不尽相同，因此需要采用不同的蛋白纯化策略。
目前主要有六种蛋白纯化方法：凝胶过滤层析、离子交换层析、标签纯化、亲和层析、疏水作用层析、电泳等。
其他方法也可用于蛋白纯化，比如利用蛋白的热稳定性、蛋白酶解稳定性、溶解度等特性纯化蛋白。
1 凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种高效的蛋白分离纯化方法，根据分子大小的差异分离蛋白质混合物。
在蛋白溶液通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时，由于不同蛋白的分子大小不同，扩散进入特定大小孔径颗粒的能力也因此各不相同，大分子蛋白率先被洗脱出来，分子量越小，洗脱越晚，从而达到蛋白分离和纯化的目的。
一般来说，越细、越长的凝胶过滤层析柱的纯化效果越好。
重组蛋白纯化基本策略
重组蛋白纯化基本策略捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。
中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。
精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。
分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。
分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。
总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。
处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。
如上样体积、浓度等。
速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。
回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。
在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。
样品浓缩HIC分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率（使用Supedex）样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）样品稀释RPC高分辨率需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险提示：1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。
第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。
2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。
3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。
4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。
蛋白质超表达和纯化的技术和策略
蛋白质超表达和纯化的技术和策略蛋白质是生命体内最基本的分子之一，具有多种重要的生物学功能，如催化酶、结构支持和细胞信号传递等。
因此，研究蛋白质的超表达和纯化技术，对于生命科学领域的基础研究和应用研究都具有非常重要的意义。
蛋白质超表达技术是指利用外源基因组序列进行组成的表达载体，在细胞中高效表达目标蛋白质的方法。
目前常用的表达系统包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等。
其中，大肠杆菌是被广泛采用的表达平台，因其生长速度快、易于培养和维护，表达高产量的重组蛋白质的能力极强。
蛋白质超表达的常用策略包括优化启动子、选择表达宿主株和表达载体、优化质粒和诱导条件等。
对于启动子的选择，一般常用的是T7、lac和trc启动子，可以通过在这些启动子中选取合适的序列，提高目标蛋白质的表达量。
表达载体的选择是提高产量的关键之一，一般载体分为表达载体、纯化载体和融合蛋白质表达载体等，选择适合的载体有助于提高表达效率。
此外，质粒特性也是表达效率的关键因素之一，包括质粒的大小、拓扑结构和复制起点等。
在选择宿主菌株时，需要考虑菌株的生长速度、表达能力和纯化难度等因素，同时根据目标蛋白质的特性进行选择。
蛋白质纯化的主要目的是获得高质量、高纯度、高活性的目标蛋白质，以满足各种研究需求。
蛋白质纯化的方法多种多样，可根据蛋白质特性不同，选择适合的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
其中，亲和层析是一种常用的选择性较强的纯化方法，可利用目标蛋白质与亲和分子的特异性结合，实现目标蛋白质的高纯度分离。
离子交换层析则是一种根据蛋白质带电性的分离纯化技术，可做到高效纯化目标蛋白质。
凝胶过滤层析则是一种分子量分离技术，常用于纯化较大分子量的蛋白质。
在进行蛋白质纯化时，需要充分考虑到目标蛋白质可能存在的 probllems，如聚集、不稳定、易降解等，进而采取相应的手段进行解决。
此外，还需考虑到纯化产物的稳定性，一些蛋白质在纯化过程中容易出现变性或损失活性等问题，需要通过添加辅助剂、调整 pH、温度等措施，减少纯化过程中的不良反应，获得高质量的产物。
蛋白质纯化策略并举例
蛋白质纯化策略并举例蛋白质纯化是研究蛋白质特性和功能的重要步骤之一、纯化蛋白质的目的是将目标蛋白从混合物中分离出来，并去除其他干扰物质，以便进一步研究和利用。
蛋白质纯化的策略可以根据蛋白质的性质和混合物的组成选择不同的方法。
下面将介绍几种常用的蛋白质纯化策略。
1.借助溶液性进行纯化一种常见的方法是根据蛋白质在不同溶液条件下的溶解性来纯化蛋白质。
例如，如果目标蛋白质在酸性条件下溶解，在中性或碱性条件下不溶解，可以通过调整溶液的pH值来实现纯化。
另一个例子是，一些蛋白质在高盐浓度条件下溶解，在低盐浓度条件下沉淀，可以通过逐渐降低盐浓度来实现纯化。
2.借助分子大小进行纯化一些蛋白质具有与其他成分相比较明显的不同分子大小。
利用这种特性，可以选择适当的分离方式进行纯化。
一种常用的方法是通过凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）纯化蛋白质。
该方法利用分子大小的差异，使大分子物质通过凝胶较快，小分子物质则需要在凝胶中较长时间停留，从而实现纯化目标蛋白质。
3.借助电荷进行纯化一些蛋白质具有特定的电荷性质，可以根据其在不同条件下的电荷状态选择适当的分离方式。
例如，离子交换层析（ion exchange chromatography）可以通过调整缓冲液的 pH 值，利用蛋白质与离子交换树脂之间的相互作用，实现目标蛋白质的纯化。
还有一种常见的技术是等电聚焦（isoelectric focusing），该方法是利用蛋白质在不同 pH 值下的等电点移动来实现纯化。
4.借助亲和性进行纯化5.借助活性进行纯化一些蛋白质具有特定的酶活性、配体结合性等活性，可以通过专一酶活性或配体结合性来进行纯化。
例如，利用蛋白质的酶活性，可以通过亲和层析和酶反应来实现目标蛋白质的纯化。
还可以根据蛋白质与配体结合的特异性，利用亲和层析等方法实现纯化。
以上是常见的几种蛋白质纯化策略及其举例。
需要注意的是，每种策略都有其适用范围和局限性，因此在纯化蛋白质时需要根据具体情况选择合适的策略，并结合多种方法进行组合使用，以达到最佳的纯化效果。
蛋白纯化方案
蛋白纯化方案简介蛋白质纯化是生物技术和分子生物学研究中常用的一项关键技术，通过一系列操作步骤将目标蛋白从复杂的混合物中分离纯化出来。
本文将介绍一种常见的蛋白纯化方案，帮助读者了解并学习如何进行蛋白纯化。
蛋白纯化的步骤步骤一：样品制备在进行蛋白纯化之前，需要准备样品。
样品可以是细胞裂解液、血清或其他含有目标蛋白的混合物。
其中，细胞裂解液的制备是最常见的样品制备方式。
步骤二：初步纯化初步纯化旨在将目标蛋白从含有大量其他蛋白的混合物中分离出来。
常用的初步纯化方法包括： - 盐析：利用盐浓度变化的方式，使目标蛋白在特定盐浓度下发生沉淀或溶解，从而与其他蛋白分离。
- 胶束凝聚：利用目标蛋白与溶液中的其他物质在一定条件下形成胶束，通过调节溶液条件使胶束溶解或沉淀，实现蛋白分离。
- 比重梯度离心：利用密度差异，将目标蛋白从含有其他蛋白的混合物中分离出来。
- 亲和层析：通过特定的亲和剂与目标蛋白的结合，实现目标蛋白的分离纯化。
步骤三：柱层析柱层析是一种常用的蛋白纯化方法，根据目标蛋白的性质选择不同的层析方法进行纯化。
常见的柱层析方法包括： - 离子交换层析：根据蛋白带负电或带正电的性质，利用载有相应带电物质的树脂进行分离。
- 凝胶过滤层析：根据蛋白的分子大小，利用不同孔径的凝胶进行分离。
- 亲和层析：利用亲和剂与目标蛋白的特异结合进行分离纯化。
- 逆相层析：根据蛋白在水相和有机相中的亲和性差异，实现蛋白分离纯化。
步骤四：洗脱和收集在柱层析过程中，目标蛋白经过与柱填料相互作用，可以通过调节溶液条件来选择性地洗脱目标蛋白。
通常，目标蛋白溶液通过柱床，非目标蛋白从柱上流过，收集洗脱出的目标蛋白裂解物。
步骤五：浓缩和纯化在蛋白纯化的最后一步，我们需要通过浓缩目标蛋白溶液来得到高浓度的蛋白样品。
常用的浓缩技术包括超滤和冷冻干燥。
浓缩后，可以使用SDS-PAGE和Western blot等方法检测纯化后的蛋白。
总结蛋白纯化是生物技术和分子生物学研究中不可或缺的关键技术之一。
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分辨率
Phase 2：Intermediate Purification
速度
载量
回收率 Phase 3：Polishing
层析技术的推荐
交替运用互补技术，合理衔接
减少样品处理，尽量简单化
综合考虑起始和结束条件的衔接
设计合理的纯化路线
互相衔接，减少中间处理
建立纯化方案
目的产物的特性: ·分子量 ·等电点 ·可溶性 ·稳定性 ·…
起始条件: ·样品量 ·pH ·离子强度 ·成分 ·关键杂质 ·…
CIPP纯化策略
筛选层析技术 筛选填料 优化条件
筛选层析技术：标签蛋白
筛选层析技术:非标签蛋白
筛选填料
筛选填料
筛选填料
不同HIC填料分离同种蛋白质的分离结果
优化条件
·CIPP纯化策略 √Capture、Intermediate Purification and Polishing √综合运用多种层析技术 √互相衔接 √保持简单
·纯化工具
思考： 如果要得到一个去GST标签的蛋白，该如何设计纯化实验？
如何选择层析柱？ 如何搭配层析设备？ 中试放大？
Thank you for your listening!
明确纯 化目的
了解纯 化产物 的特性
CIPP纯 化策略
建立有 效分析 方法
确立最 终的纯 化方案
明确纯化目的
Mass spectrometry
Antigen dies
Amount
pg
ng
ug
Structural studies
mg
Therapeutic protein
蛋白纯化策略和工艺
吕虎 2017.8.18
五大层析原理
内容: ·简介 ·蛋白纯化策略 ·如何建立纯化方案 ·纯化工具 ·总结
简介
早期的蛋白纯化 1789-1940s
今天的蛋白纯化
层析纯化 1950s-1980s
决定因素
层析技术
蛋白纯化策略
蛋白纯化策略
CIPP
KEEP SIMPLE
关键因子
recovery （%）
Purification factor
回收率&纯化因子
纯化工具
手动纯化: ·重力纯化 ·磁珠纯化 ·离心纯化
优点: ·简单易掌握 ·经济
自动纯化: ·预装柱配合层析设备
优点: ·自动化——解放人力更高效 ·洗脱手段多样化——结果更优 ·高重复性，结果可追溯
总结
·纯化目的&目的产物特性
g kg
Purity
Moderate ＞ 80%
High ＞ 95% -99%
Very high ＞ 99%
Activity
Often not necessary
Homogeneity Often not necessary
rigid requirements rigid requirements
了解目的产物的特性
不同pH条件下，目的蛋白与DEAE柱的结合情况
优化条件
不同洗脱方式对蛋白纯化结果的影响
有效的分析方法
纯化追踪表
Purification step
Volume （ml）
Protein Conc. （mg/ml）
Amount total
Protein（mg）
Total activity （U）
Specific activity （U/mg）