实验十 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
实验三：琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 南京医科大学
3、丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂
浓 度
4、本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，
以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢
酶活性的抑制作用。
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
延胡索酸ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
FAD
FADH2
三、操作步骤：
1、酶提取液的制备 1 g 兔肌肉、剪碎＋海沙（研磨成糜状）
＋12 ml 1/15M磷酸盐缓冲液 (区别于0.1mol/L) （两次，研成糊状）；纱布过滤
２、酶促反应及竞争抑制作用
试剂（滴） １ ２ ３ ４ ５
酶提取液
20 20 20 20 -
0.2 mol/L琥珀酸 4
4
4
-
4
0.02mol/L琥珀酸 -
-
- 4-
0.2 mol/L丙二酸 -
4
-
4
-
0.02mol/L丙二酸 -
-4--
蒸馏水
4
-
-
- 24
0.02%甲烯蓝
2 2 2 22
3、 各管混匀，加石蜡5滴隔绝空气， 37℃水浴
保温，观察褪色情况。（斜执试管，沿壁缓慢加， 不要产生气泡）
四、结果、讨论： 阴性对照
编号 １
２
３
４
５
时间
10min
20min
30min 40min 50min 60min
褪色快
不褪色 褪色缓慢 不褪色 不褪色
五、注意事项：
1 、充分碾磨家兔肌肉，碾磨器械、纱布要及时清 洗，注意回收。
2 、滴加液体石蜡。(实验结束,试管用洗衣粉刷净) 3 、观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧
实验三 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
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3.TTC（氯化三苯四氮唑）法 无色TTC（2，3，5-氯化三苯基四唑）作为 人造受氢体，它在细胞呼吸过程中接受氢，还原 成三苯基甲膳（TF）。后者以红色晶体的形式存 在于细胞内，采用有机溶剂（如甲苯、乙酸乙醋 、三氯甲烷、丙酮或乙醇等）进行萃取。萃取液 测定485nm吸光度后，以TTC还原量表示脱氢酶 活性，根据标准曲线计算TF生成量，进而求出 TTC-脱氢酶活性
避免空气中的氧接触反应溶液，使的还原性的甲 烯白重新氧化成甲烯蓝
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思考题：
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2:本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？本 实验成功的关键是什么？
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思考题：
3：抑制剂还可以选用什么物质？ 还可以选用丙二酸
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4：利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制的特点 ？ 竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物 ；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部 位相同；c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大； 但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参 数：Km值增大，Vm值不变。
0.50
——
0.50
2.00
0.50
——
0.50
0.50
0.50 —— 1.00 0.20
2.00 —— 1.0 0.20
2.00 1.00 0.20
2.00 1.00 0.20
1.50 1.00 0.20
摇匀，静置于37摄氏度的水浴中（此后再勿摇动）注意观察各管的颜色变化，记 录各管颜色消退的顺序和时间，分析原因，振荡褪色的反应液，观察实验现象并 分析产生该现象的原因。
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2.铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法 以铁氰化钾[K3Fe（CN）6]和琥珀酸钠为底 物，使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为 亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6]，K4Fe（CN）6再与 Fe3＋作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸 光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸脱 氢酶的还原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活 力愈强。
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制[原理]肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸。
反应中生成的FADH2可使蓝色的甲烯蓝还原为无色的甲烯白(还原型甲烯蓝)。
丙二酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，故能与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心。
丙二酸与琥珀酸脱氢酶结合后，酶活性受到抑制，则不能再催化琥珀酸的脱氢反应。
抑制程度的大小，随抑制剂与底物两者浓度的比例而定。
本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔绝空气的条件下，通过甲烯蓝的褪色程度来判断琥珀酸脱氢酶的活性，并籍此观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。
CH2COOHCH2 COOH FAD MB•2H（甲烯白）琥珀酸琥珀酸脱氢酶CHCOOHHOOCCH FADH2MB（甲烯蓝）延胡索酸[试剂]1．0.2mol/L琥珀酸: 取琥珀酸钠(MW:270.14)27克加水至500ml。
2．0.02mol/L琥珀酸: 取1液稀释10倍。
3．0.2mol/L丙二酸: 取丙二酸钠(MW:166.05)16.7克加水至500ml。
4．0.02mol/L丙二酸: 取3液稀释10倍。
5．1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲: 1/15mol/LNa2HPO4溶液80.8ml与1/15mol/LKH2PO419.2ml 混合即成。
（1）1/15mol/LNa2HPO4溶液: 取Na2HPO4.12H2O （MW：358.14）23.876 克, 加水至1000ml。
（2）1/15mol/LKH2PO4溶液:取KH2PO4（MW：136.09）1.814克,加水至200ml.6．0.02％甲烯蓝溶液7．液体石蜡[主要器材]1．新鲜猪心2．玻璃研钵3．漏斗4．手术剪5．棉花6．恒温水浴箱[操作步骤]1．心肌提取液的制备取新鲜猪心约6g，用蒸馏水清洗后剪成碎块，置于研钵中，加入适量净沙，研磨成糜状。
再加1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液12ml，研成糊状，用棉花过滤，滤液即为猪心提取液。
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
实验三琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
一实验目的
了解琥珀酸脱氢酶的作用及酶促反应中竞争抑制。
二实验原理
肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢氧化生成延胡索酸，脱下的一对氢原子由FAD接受，生成FADH2。
本实验在无氧条件下采用甲烯蓝为受氢体（蓝色），接受FADH2传递的氢原子，使甲烯蓝受氢还原成甲烯白（无色），以指示酶的活性。
丙二酸与琥珀酸的结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。
在该酶促反应中设置不同含量的底物，并加入等量的丙二酸，观察甲烯蓝颜色消退的速度，判断琥珀酸脱氢酶的活性及丙二酸对酶活性的抑制程度。
三药品器材试管、滴管、高速组织捣碎机、恒温水浴箱、组织等。
1.0.1mol/L磷酸盐缓冲液（Ph7.4）取0.1mol/L磷酸氢二钠溶液81ml和0.1mol/L
磷酸二氢钠19ml混合即成。
2. 1.5％琥珀酸钠溶液。
3.1％丙二酸钠溶液。
4.0.02％甲烯蓝溶液。
5.液体石蜡。
6.肌肉匀浆取新鲜的动物肌肉组织适量，用组织剪将其剪碎，加入pH
7.4磷酸盐
缓冲液，置于高速组织捣碎机中加工成约20％的肌匀浆。
四实验方法取四支试管，编号，按下表操作：
中保温，在15～20分钟内观察各管各管的颜色变化，做好记录。
五思考题
1结合本实验说明竞争性抑制的特点。
2结合实验原理说明各管颜色变化的原因。
实验十 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
实验十琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制一、实验目的1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。
2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。
二、实验原理存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。
反应如下：草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。
若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。
本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。
这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
三、实验仪器、材料和试剂1、仪器：恒温水浴锅，研钵或组织匀浆机2、材料和试剂（1）新鲜兔肝（2） 0、10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7、4）：0、1mol/L NaH2PO419 ml 加0、1mol/LNa2HPO481ml。
（3）0、093 mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1、5g溶于100 ml蒸馏水中。
（4）0、10 mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1、5g溶于100 ml蒸馏水中。
（5）0、02%甲稀蓝溶液。
（6）液体石蜡。
四、实验操作新鲜兔肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7、4的0、10 mol/L磷酸盐缓冲液，制备成200 g/L的肝匀浆液备用。
取五支试管分别编号，按下表配制反应体系：试剂管号0、093 mol/l琥珀酸钠0、10 mol/l丙二酸钠0、10mol/l(pH7、4)磷酸缓冲液肝匀浆液0、02%甲烯蓝11ml2ml1ml3滴21、5ml0、5ml1ml1ml3滴31ml1ml2ml3滴42ml1ml1ml3滴51ml1ml1ml1ml3滴将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。
生化实验课 琥珀酸脱氢酶
五．实验结果记录
试管1 试管2 试管3 试管4 试管5 试管6 [I]/[S] 0 0.1 1 10 0 0 褪色时间（分钟）
六．注意事项
1、酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降 低。 2、加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以避免空气 中的氧气对实验造成影响，因此加石蜡时试管壁要 倾斜，注意不要产生气泡。 3、37℃水浴保温过程中，不能摇动试管，避免空 气中的氧气接触反应溶液，使得还原型的甲烯白重 新氧化成蓝色。 4、37℃水浴保温过程中，要注意随时观察各试管 的褪色情况。 5、实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体 石蜡。
二、实验原理
丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀 酸竞争，而和琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶 已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种 现象称为竞争性抑制。如相对地增加琥珀酸的浓度， 则可减轻丙二酸的抑制作用。
三．器材与试剂
1. 器材 大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、 量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、 恒温水箱、电热水浴锅 2. 试剂 0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶 液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L丙二 酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）、 0.02％甲烯蓝、液体石蜡
四.操作步骤
2.取试管6支，编号，再按下表步骤操作：
0.2mol/L 0.02mol/ 0.2mol/L 0.02mol/L 蒸馏水 甲烯蓝 琥珀酸溶 L琥珀酸 丙二酸溶 丙二酸溶液 （滴） （滴） 液（滴） 溶液（滴） 液（滴） （滴） 8 8 4 8 8 3
酶提 磷酸缓 取液 冲液 (ml) (ml) 试管1 2 试管2 2 -
琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察
1.琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察2.紫外分光法测定核酸含量本实验分组为15组，如果为16组，相应材料要增加。
需要的试剂配制方法注意事项1.5%琥珀酸钠溶液7.5g琥珀酸钠→500ml→15小瓶没有琥珀酸钠则用琥珀酸代替后用NaOH调和至PH7.01%丙二酸钠5g丙二酸钠→500ml→15小瓶没有丙二酸钠则用丙二酸代替后用NaOH调和至PH7.00.02%甲稀蓝0.1g甲稀蓝→500ml→15小瓶（棕色瓶）甲稀蓝别名亚甲酰蓝1/15mol/L Na2HPO4 23.6g Na2HPO4 →2000ml→15大瓶石蜡油可以不用分装每个房间在水浴锅前放1个核酸称一定量的小牛胸腺DNA融入0.1%的NaOH5-50ug/mL浓度羊的心脏切碎成小块大约2g左右提前购买，将皮、脂肪处理掉分割后放在冰箱里石英砂均匀的撒在上面注：每三个人一组，分为15组。
如果人数多可以适当多分几瓶试剂。
所需仪器所需数量40ml试剂瓶4560ml试剂瓶15试管4x152x15 共90个移液管（优先10ml的本次用5ml移液管）15研钵15种类数量心脏提取液151.5%琥珀酸钠151%丙二酸钠150.02%甲稀蓝15蒸馏水15液体石蜡 2胶头滴管共77个紫外吸收法测定核酸含量1、实验目的：1.掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理2.掌握利用紫外线分光度计测定核酸含量二、实验原理：DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处紫外线吸收是嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C 一），能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光。
等书上112页三、实验试剂与器材DNA样品紫外分光光度计四、实验步骤1.取DNA样品5ml，于紫外分光光度计上测定260nm与280nm处的OD值按下式按下式计算核酸浓度计算核酸浓度 DNA的质量浓度(mg/l)=OD260nm/0.020xL x稀释倍数计算核酸纯度=OD260nm/OD280nm2.取DNA样品5ml，沸水浴中加热5min于紫外分光光度计上，测260nm处的OD值比较DNA前后吸光度OD的差异。
实验五琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
实验五琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制【实验目的】1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。
2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。
【实验原理】存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。
反应如下：草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。
若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。
本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。
【实验用品】1、试剂（1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）:0.1mol/L NaH2PO419ml 加0.1mol/LNa2HPO481ml。
（2）0.093mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠 1.5g溶于100ml蒸馏水中。
（3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠 1.5g溶于100ml蒸馏水中。
（4）0.02%甲稀蓝溶液。
（5）液体石蜡。
2、器具（1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：0.1mol/L NaH2PO419ml加0.1mol/LNa2HPO481ml。
（2）0.93mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠 1.5g溶于100ml蒸馏水中。
（3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠 1.5g溶于100ml蒸馏水中。
（4）0.02%甲烯蓝溶液。
（5）液体石蜡。
2、器具（1）恒温水浴箱（2）研钵或组织匀浆机【实验操作】新鲜免肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7.4的0.10mol/L磷酸盐缓冲液，制备成200g/L的肝匀浆液备用。
取五支试管分别编号，按下表配制反应体系：试剂管号0.093mol/L琥珀酸钠0.10mol/L丙二酸钠0.10mol/L(pH7.4)磷酸缓冲液肝匀浆液0.02%甲烯蓝1 —1ml 2ml 1ml 3滴2 1.5ml 0.5ml 1ml 1ml 3滴3 1ml 1ml 2ml —3滴4 2ml —1ml 1ml 3滴5 1ml 1ml 1ml 1ml 3滴将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。
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实验十琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
一、实验目的
1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。
2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。
二、实验原理
存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。
反应如下：
草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。
若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。
本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。
这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
三、实验仪器、材料和试剂
1、仪器：恒温水浴锅，研钵或组织匀浆机
2、材料和试剂
（1）新鲜兔肝
（2）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：0.1mol/L NaH2PO4 19 ml 加0.1mol/L Na2HPO4 81ml。
（3）0.093 mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g溶于100 ml蒸馏水中。
（4）0.10 mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g溶于100 ml蒸馏水中。
（5）0.02%甲稀蓝溶液。
（6）液体石蜡。
四、实验操作
新鲜兔肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7.4的0.10 mol/L磷酸盐缓冲液，制备成200 g/L的肝匀浆液备用。
取五支试管分别编号，按下表配制反应体系：
将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。
思考题:
1、抑制的分类及其特点？
2、本实验中液体石蜡起什么作用? 本实验需在无氧条件下进行,可加一层液体石蜡以隔绝空气。
3、各管中的反应体系配好后为什么不能再摇动?
4、制备肝浆时用磷酸缓冲液，可否换用蒸馏水，为什么？。