动物细胞原代培养实验项目指导

附件-4

综合设计性实验项目指导

一、实验项目名称：动物细胞原代培养及活力检测

二、实验目的：掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培养过程中无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的观察方法及细胞活力的测定方法，为细胞工程中的胚胎移植、细胞融合与单克隆抗体制备等技术奠定重要的技术基础。

三、实验原理

用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养。这种培养过程是把组织或器官从动物体取出，分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断的生长和繁殖。

原代培养是建立各种细胞系的第一步。利用原代培养技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究。原代培养科分为组织培养法和消化法两种。

台盼蓝染色法检测细胞活力的原理:台盼蓝是检测死、活细胞最常用的生物染色试剂之一。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，由于膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。

四、实验材料：

1.新生兔

2.大剪子、弯头眼科剪、小镊子、平皿、细胞培养瓶、烧杯、酒精灯、移液枪、超净工作台、细胞计数板、0.22μm细菌过滤器、移液枪、枪尖、PE手套、一次性无菌橡胶手套、脱脂棉、无水乙醇、台盼蓝、15ml离心管

3. DMEM培养基、血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶

五、实验仪器：二氧化碳培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、离心机、显微镜

六、实验步骤（方案）：（如需要学生设计，也要提交一参考方案供论证评审）（一）DMEM培养基的配制

1. 将DMEM培养基干粉用800ml超纯水溶解，加入3.7gNaHCO3，搅拌溶解，加入双抗（100IU/ml），调整pH为7.0，定容至1L，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，分装，并用封口膜封口，4℃保存备用。

2. 取一定量的配制好的DMEM培养基，按10%-20%的比例添加新生牛血清。

（二）新生兔细胞原代培养

1. 准备

（1）取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。

（2）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

2. 取样

（1）处死新生兔，并用75％酒精浸泡1分钟。

（2）移入超净工作台，用含有双抗的PBS冲洗2遍。

（3）用手术剪剪取所需部位，置于培养皿中，加适量PBS。（要求学生自己设计所要分离的细胞种类，如成纤维细胞、肝细胞等。）

3. 组织细胞的分离

（1）用PBS冲洗实验材料2次。

（2）用眼科剪剪成小块（2-3mm3），并PBS冲洗2次。再用DMEM培养液冲洗2次。

（3）用3ml DMEM培养液悬浮组织块，并用移液枪转入细胞培养瓶。

（4）轻轻晃动培养瓶，使组织块均匀的铺于瓶壁，翻转培养瓶（瓶口向下），拧紧瓶盖，放入二氧化碳培养箱，并拧松瓶盖。

（5）3-5小时后，补加2ml培养液，瓶口向上继续培养。

4. 培养条件

37℃、5%二氧化碳、饱和湿度。

（三）培养细胞的增殖及活力测定

细胞培养24h观察组织块贴壁情况，以后每隔48h观察细胞形态，并换液。细胞呈现接触抑制后，用台盼蓝染色法检测细胞活力。

1. 用移液枪将细胞培养瓶中的培养基取出，并用预热的PBS液洗涤细胞2遍。

2. 加入预热的0.25%胰蛋白酶至刚没过细胞，放入37℃消化3min，加入6倍体积的含血清培养基终止消化，并移液枪反复吹打细胞，将细胞移入离心管，1000rpm，离心5min，加2ml预热的PBS液悬浮细胞，即得细胞悬液。

3. 取洁净的细胞计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

4. 取适量细胞悬液加等体积台盼蓝，混匀，静置2-3min。

5. 取10μl悬液滴至计数板和盖片空隙中；

6. 计数四个角上大方格中死活细胞的数目。

7. 计算细胞活率：细胞活率=活细胞数/细胞总数