运用生物传感器检测mecA耐药基因

Biotechnology FrontierApril 2015, Volume 4, Issue 1, PP.21-25 MecA Resistant Gene Detection Based on BiosensorTing Wang, Zhang Zhang, Guoming Xie#Key Laboratory of Medical Diagnostics of Education, Department of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, 400016, China#Email: guomingxie@AbstractA novel electrochemical strategy was designed for the detection of methicillin-resistant staphylococcus epidemidis resistant geneusing methylene blue as signal tag. First, the hairpin probes are immobilized on the gold electrode, and the MCH are used to close non-specific binding sites on the surface of the electrode. Next, the immobilized hairpin probes recognized the targets to trigger primer extension reaction by target-induced conformational transition, leading to an ultrasensitive electrochemical bioensor. The designed DNA biosensors can quantitatively detect resistant genes in the optimum experimental conditions to achieve a lower detection limit, which was amenable to quantification of DNA and would become a simple and powerful tool for bioanalysis and clinic diagnostic application.Keywords:Bacteria Resistant Genes; Electrochemical Biosensor; MRSA运用生物传感器检测mecA耐药基因汪婷，张章，谢国明#重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学国家重点实验室，重庆400016摘要：设计一种新颖的电化学传感器，用亚甲蓝作为信号分子检测耐甲氧西林金葡菌的耐药基因。

首先，在金电极上固定发夹结构捕获探针，用MCH封闭电极表面的非特异结合位点，加入目标物打开相应捕获探针的茎环结构并与其互补配对，使亚甲蓝远离电极表面，改变电流大小。

本文应用的DNA电化学生物传感器可以实现对耐药基因片段的灵敏定量检测，为临床医生合理使用抗生素提供了重要线索。

关键词：耐药基因；电化学传感器；耐甲氧西林金葡菌引言细菌的耐药性是指细菌多次与药物接触以后，对药物的敏感性减小甚至消失，致使药物对耐药菌的疗效降低甚至无效。

“超级细菌”的出现使得细菌耐药已成为全世界重要的公共卫生危机[1,2]。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染从发现至今几乎遍及全球，已成为医院内感染的重要病原菌之一[3,4]。

今天，医院内分离到的金黄色葡萄球菌中60%~70%都是具有多重抗药性的MRSA[5]。

MRSA对甲氧西林耐药的机制主要是由青霉素结合蛋白PBP2a介导的，SCCmec中的mecA基因是PBP2a的编码基因[6-8]，所以通过检测mecA基因中的一段特异性序列可以评估金黄色葡萄球菌对甲氧西林的耐药性[9-11]。

目前，细菌耐药性的检测方法主要分为常规表型检测（药敏试验）和耐药基因检测。

常规药敏试验在国内实验室常规检测中比较常用，但需要至少2-3 天的培养时间，而且许多生长缓慢和不易培养的细菌，无法通过常规药敏试验检测其耐药性。

以DNA探针和聚合酶链式反应为基础的实时荧光定量PCR技术可以从分子生物学水平检测细菌耐药。

但是，常规分子生物学方法对每一个测试的抗菌药物，均需要设计相应的分子检测方法，一次只能检测一种耐药机制[12]。

针对现有细菌耐药检测方法费时且低通量等不足，我们提出：采用生物传感新技术从基因水平上快速检测细菌的耐药基因，为临床医生合理使用抗生素提供了重要线索[13]。

本实验建立的传感器主要通过核酸杂交反应改变信号分子亚甲蓝与电极表面的距离，从而引起电流的变化，推算得出目标耐药基因的浓度。

1实验部分1.1仪器与耗材PBS缓冲液（100 mmol/L，pH 7.4，上海生工公司），三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（1 mol/L，pH 7.4，上海生工公司），三(2-羧乙基)膦盐酸盐（上海阿拉丁公司），6-巯基乙醇（上海生工公司），捕获探针序列5'-SH-(CH2)6-ATCACTTAAA TA TTCATCCATTTTTTTAACGGTTTTAAGTGAT-(CH2)3-Mb-3'（上海生工公司），靶探针序列5'- AACCGTTAAAAAAA TGGA TGAATATTT-3'（上海生工公司），电化学工作站CHI660D（上海辰华公司），实验用水均为双蒸水，其余耗材均购于美国Sigma公司。

1.2试验方法1.2.1 电化学传感器的制备电化学电极阵列制备流程（图1）：(a)预处理：首先用1、0.5、0.05直径的氧化铝粉末轻轻的打磨柱状金电极直至光滑成镜面，然后把打磨好的金电极放在去离子水、无水乙醇、去离子水中分别超声5分钟，并在0.1M的H2SO4溶液中从-0.2V到1.6V反复扫描CV，直至干净金电极的标准CV曲线出现，然后用去离子水清洗干净，并在氮气中烘干。

(b)发夹结构探针的处理：1uM的捕获探针与10uM三(2-羧乙基)膦盐酸盐反应1h减少二硫键的形成，把上述溶液放在95度水浴箱中水浴5分钟后放在冷水中降温30分钟，形成发夹结构的捕获探针，注意全程避光[14]。

(c)捕获探针的固定：将10ul制备好的捕获探针（3’末端标记亚甲蓝）溶液滴加在金电极上，盖上盖防止液体蒸发及避光，4度冰箱放置16小时，探针通过Au-S键固定在金电极上，探针5'标记的亚甲蓝靠近金电极，产生电流信号，接着用去离子水反复清洗三次。

(d)封闭：滴加1mM的6-巯基乙醇溶液在探针修饰后的金电极上，37度2小时，封闭上金电极上未结合的位点并把探针链支撑起来，用去离子水反复清洗三次去除未结合的多余6-巯基乙醇[15]。

(e)杂交反应：10ul加入不同浓度的靶探针溶液继续滴加在探针修饰的电极上，37度温育2小时，靶探针是金电极上固定的捕获探针完全碱基互补配对的单链，因此，加入的靶探针能够打开捕获探针的茎环结构并与其互补配对形成直立的双链DNA，3’末端标记的亚甲蓝远离电极，其产生的电信号减低，用去离子水反复清洗三次[16]。

1.2.2 电化学信号的检测利用传统的三电极检测系统：饱和甘汞电极作为对电极，铂丝作为参比电极，修饰后的金电极作为工作电极，含有140 mM氯化钠、1 mM氯化镁、5 mM氯化钾和1 mM氯化钙的20mM Tris-HCl(pH 7.4)溶液作为工作液，分别应用方波伏安法和交流阻抗法对该传感器修饰的每一步进行表征，并成功实现了对耐甲氧西林金葡菌耐药基因的定量检测。

2结果与讨论2.1电化学阻抗谱表征电极修饰过程的表征2.2.1 电化学阻抗谱表征电极表面层层自助装修饰过程可以用电化学阻抗谱进行表征，一个典型的阻抗图包含有一个低频率的线性部分和高频率的半圆部分，半圆部分对应的是电子转移过程，因此，更大的半径代表更大的电阻率。

图1中a代表的是裸电极，只有代表扩散的低频率线性部分，表明裸金电极的导电性很好。

b是经过捕获探针修饰后的电极，由于核酸链上磷酸骨架带负电，阻碍电子的传递，而图中b曲线有一个代表电子传导受阻的半圆部分，表明已成功的将带有负电荷的核酸链修饰在金电极上。

c曲线是用6-巯基乙醇封闭后的阻抗曲线，阻抗谱上半圆直径增大，表明已成功封闭。

d是加入50nM靶探针后的阻抗曲线，靶探针打开捕获探针发夹结构利用碱基互补配对原理杂交修饰在电极上，由于增大了电极上核酸装载量，致使电阻值增大，阻抗谱半径增大。

图1 金电极经不同修饰后在TrisHCl溶液中的阻抗谱2.2.2 方波伏安法表征亚甲蓝是一种促进电子传递物质，当它靠近电极时促进电流传导的作用很大，因此电流信号很大，当它远离电极表面时，其传导电子的作用降低，电流信号也就下降。

图2中两条曲线分别代表50nM靶探针加入前后电极表面的电流信号，没有耐药基因存在时，捕获探针是成发夹结构状态，因此其5'标记的亚甲蓝靠近金电极，产生很大的电流信号，而当靶物质加入后打开其发夹结构，致使亚甲蓝远离电极表面，使信号降低，该图表明了，捕获探针发夹结构的形成及在电极表面的成功修饰，也证明了靶探针是通过与捕获探针杂交而固定在电极表面的。

图2金电极经不同修饰后在TrisHCl溶液中的方波伏安曲线2.2耐药基因的检测通过对不同浓度下耐甲氧西林金葡菌耐药基因特异性片段的检测，对该电化学生物传感器的实用性进行了研究（图3），从a-f分别代表加入靶物质浓度为1nM, 10nM, 30nM, 50nM, 60nM,80nM时的电流曲线，从图中可以明显看出，随着目标物浓度的增加，电流信号逐渐下降，并且电流变化值与目标物浓度呈比例关系。

在1nmol/L到80nmol/L的范围内，表现出良好的检测特异性。

af图3不同靶DNA分子浓度下的方波图（nmol/L）3讨论生物传感技术因其高选择性和特异性，通量高，响应快，样品用量少，易于小型化等特点，在制药，环境监测，食品安全等领域已有很多应用。

本实验利用构建简单的电化学生物传感器平台，从基因水平上对耐甲氧西林金葡菌mecA耐药基因进行检测，为指导临床上医生合理运用抗生素提供依据，也为运用电化学传感器对其他物质检测提供平台。

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