哺乳动物细胞大规模培养技术方面的研究及进展

哺乳动物细胞大规模培养技术方面的研究及进展

摘要：哺乳动物细胞的培养与生物科技的发展有着密切的联系，已经被广泛地用于生物学、医学的研究和应用领域中。本文将会对各种影响细胞培养的因素以及微载体和生物反应器在哺乳动物细胞大规模培养上的应用做一个回顾。

关键词：哺乳动物细胞, 培养, 微载体 , 生物反应器

Research Progress on the Large-scale Culture Technology

of Mammalian Cell

Cuijiali

(the college of life science，grade 6，bioengineering，20072502529、510630) Abstract:The culture of mammalian cells is closely related to the development of biotechnology, which has been used extensively in the research and application fields of biology and medical science． In this article, various factors affecting cell cultivation and the application of microcarrier and bioreactor on large—scale culture of mammalian cells were reviewed．

介绍

自从1907年Harrison在试管中培养蝌蚪的神经组织成功以后(1), 细胞培养技术就被广泛地应用到生物医

学领域的研究及应用中。现在，细胞培养技术已经在细胞工程、酶工程、发酵工程、尤其遗传工程的发展中扮演着重要角色（2-3)。本文将陈述关于哺乳动物细胞大规模培养的相关技术的研究进展。

影响细胞培养的主要因素

培养基

培养基类型主要有三种：天然培养基，合成培养基和无血清培养基（SFM）．天然培养基由动物血清、乳蛋白水解物、自制的体液或组织提取液等成分组成；合成培养基能模拟生物体内不同的生长环境，如DMEM 和RPMI1640等,适合在试管中培养的细胞，但是当使用合成培养基时，必须补充某些物质，如血清、抗体等。SFM用于提高生物产品的纯度及质量，由人工化合物组成，其中不含血清，易于产物的分离及纯化（4) ．研究显示在SFM中培养的细胞，其增长率、密度和蛋白质表达水平不会低于在含有血清的培养集中的细胞（5)。

血清

血清能补充合成培养基中缺乏或者不足的营养成分，并提供细胞生长及繁殖所需要大多数物质。另外，血清具有缓冲能力，能抵抗多种影响细胞培养体系的干扰，避免由于pH值变化、重金属离子、蛋白质水解剂、细菌内毒素等产生的毒性影响。然而，随着培养基中血清的添加，一些弊端显现出来——血清是潜在的污染源、不同批次产品中蛋白质的显著差异、高额的费用以及潜在的细胞毒性。因此，培养基中的血清浓度应控制在5％-20％内(6)。

培养温度

高温能破坏细胞膜上的脂质和细胞内的酶、影响细胞分裂甚至破坏细胞。低温会延长细胞有丝分裂时间，阻碍或者抑制细胞新陈代谢。所以，在培养过程中需要根据细胞类型及时调整培养温度。研究发现细胞的行为在低温下与在37℃下的行为很不同。例如在较低温度下，杂交瘤细胞的生长速度会减缓，但事实上它生产特异抗原的能力上升了（7）。虽然在低温下培养中国仓鼠卵巢（CHO）细胞会导致其生长减缓，但是却能提高细胞重组蛋白质的生产能力（8-9)。

培养基的气相环境与pH值

气相环境会影响细胞的生长，尤其是存在CO2和O2的时候。O2参与细胞能量代谢，而CO2能维持培养基pH值。据报导，如果培养基中pH值太低，细胞增殖时的新陈代谢生产物，如乳酸和氨的浓度会上升，进而影响细胞生理机能、降低细胞密度，最后导致细胞凋亡（10)。相反的，在高pH值环境会抑制细胞生长及重组蛋白的生产（11-14)。

细胞大规模培养

试管培养的细胞根据其生长形态不同分为两种：贴壁生长型（或贴壁依赖型）和悬浮生长型。大多数的组织细胞属于贴壁生长型（或贴壁依赖型）。一般的贴壁依赖型细胞可以通过静置培养或震荡培养来获得。培养过程繁琐而昂贵。在 1967 年, Wezel等开发改进了细胞微载体培养技术（15) 。他们首先令细胞在微载体表面贴附生长，然后像培养悬浮生长型细胞一样将微载体置入用于大型生物反应器中培养。因此，微载体培养技术被视为目前最有前景的细胞大规模培养技术。

微载体

微载体是一种适合贴壁依赖型细胞生长的微型小球，其直径在60-250μm间。至今，微载体因以下优点，在组织细胞培养中作为一种高效的载体被普遍使用。微载体有很大的比表面面积，非常适合单层培养和悬浮培养（16)。对于微型小球表面的细胞生长情况检测及培养体系的环境因数的控制也很简便。微载体的使用能提高培养基利用率，无需细胞筛选，优化下游工程，而且易于进行扩大培养及培养系统化和自动化。微载体也能降低污染的机率，提供类似生物体内的三维（3D）环境，消除接触抑制从而形成多层生长。

微载体的尺寸与密度

扩大载体单位体积的内部表面积对于细胞的生长非常有利，所以微载体的颗粒直径必需要缩小。但是较小的颗粒将会导致较高的接种物密度，因此，微载体的直径通常控制在 100-200 μm 之间。Kennard 曾用交联明胶微载体培养CHO细胞生产黑色素瘤抗原p97。他发现，同样在Cultispher-G微载体上培养的细胞，长在直径为200 μ m的微载体上的细胞比长在直径为320 μ m的微载体上的细胞表现出更强的生存能力及生产p97特异蛋白的能力。

大规模细胞培养需要较低的搅拌转速，为了使微载体能在40—50r·min-1的搅拌转速下充分悬浮于培养液中，通常都会将微载体的密度控制在1.03—1.05 g·cm-3之间，并且其密度会随着细胞的粘附及生长而逐渐增加（18)。

微载体的表面密度

组织细胞表面因为普遍因生理pH值不同而呈不同的电性（19)。因为细胞能同时带着正负电在微载体上