酶的固定化讲解

间歇
固定化
交联
结合
连续
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
1.极易将固定化酶与底物、产物分开； 2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； 3.在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 4.酶反应过程能够加以严格控制； 5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6.较游离酶更适合于多酶反应； 7.可以增加产物的收率，提高产物的质量； 8.酶的使用效率提高，成本降低。
吸附法
性炭、白陶土、 氧化铝、多孔玻璃、 硅胶、碳酸钙凝胶
淀粉麸质、大孔树脂、 DEAE纤维素、 DEAE葡聚糖凝胶
（2）固定化酶的制备机理
所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。
（3）优缺点
优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的 高级结构;方法简单，成本低。
第四章 酶的固定化
酶应用过程中的一些不足
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α-淀粉酶等； 和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在 高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容 易变性失活。
酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样 酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后， 即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使 用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。
（4）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能 回收贮藏，利于重复使用。
（5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与 废物、产物或反应液发生化学反应。
（6）固定化酶成本要低，以利于工业使用。
四、酶的固定化方法
酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的方 法是没有的。酶的固定化方法通常按照用于结 合的化学反应的类型进行分类，大体可概括为 四种类型：
1.吸附法； 2.结合法； 3.交联法; 4.包埋法
1.吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含酶 菌体吸附在其表面上，而使酶固定化 的方法称为物理吸附法。
吸附法
常用的固体吸附剂：活性炭、氧化铝、 硅藻土、羟基磷灰石等。
优点：操作简便，条件温和，不引起 酶失活，载体廉价，而且可反复使用。
缺点：结合力弱，易解吸附由于靠物 理吸附作用，结合力较弱，酶与载体 结合不牢固而容易脱落，所以使用受 到一定的限制。
缺点：
1.由于多一步固定化操作，存在酶固定化过程中的活性收率损 失；
2.多了固定化载体成本费用及固定化操作费用，并且固定化酶 颗粒的扩散阻力作用会使酶的反应速率下降;
3.比较适用于水溶性的底物和小分子底物。
二、固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
Β－淀粉液化酶 磷酸化酶
2.结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一 起的固定化方法称为结合法。
根据酶与载体结合的化学键不同，可分为共价结合法和离 子结合法。
离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法 称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不 溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤 维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法 称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有： 纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚 物、甲基丙稀醇共聚物等。 酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯 基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键， 必须首先使载体活化。
三、酶的固定化方法原则和注意事项
1)、固定化酶操作的注意事项
活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的 氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定 化酶时，需要在非常严密的条件下进行。
功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、 组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的 羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求 不参与酶的固定化结合。
产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一 起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
固定化技术
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在一定载体上并在一定 的空间范围内进行催化反应的酶。
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术
水不溶性酶 （ 固相酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶
可溶
间歇
吸附
包埋
酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理， 而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因 此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。
2)、制备固定化酶遵循基本原则：
（1）必须注意维持酶的催化活性及专一性。
（2）固定化应该有利于生产自动化、连续化。 （3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨 碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的 千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定 化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年，日 本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸 酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。
缺点：酶吸附不牢固，易脱落； 防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应
吸附法固定化酶举例
载体 活性炭
多孔玻璃
氧化铝 碳酸钙凝胶 纤维素 麸素 硅胶
固定化酶
α －淀粉酶、β －淀粉酶 蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶 核糖核酸酶、木瓜蛋白酶 脂肪酶、葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶 亮氨酸氨肽酶 胰蛋白酶、核糖核酸酶
在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固 定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生 产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶， 开始了用固定化细胞生产酶的先例。
1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取 得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有 利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提 供了新的方向。