现代组织化学技术-组织化学 ppt课件
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组织化学技术5免疫组化
Ab滴片技术 —— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。 ［注意］ 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能 干片。 要领：甩净组织周围的水。 4．PBS洗涤技术 （1）洗涤的目的 ①保证离子浓度和PH值。 ②减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）
Ab滴片图示：
方法：洗三次，每次5分钟。 Ab孵育技术 必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。
02
应用：特别适用于含抗原量较少的组织。
03
包埋后染色：
04
组织标本经过固定脱水及树脂包埋、制
05
成超薄切片后，再进行免疫组化染 色。由
06
于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色，
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故又称载网染色（on grid staining ）。
优点： ① Ultrastructure 保存良好。 超薄切片易穿透，可标记细胞任何 部位。 方法简便，（+）结果高度可重复性。 同一张切片上可进行多重免疫染色。 缺点： ① 抗原活性可能减弱或消失。 树脂中的组织不易进行免疫反应。
2
液，室温5~30分钟，随时镜检（DAB用时
3
新配）
4
自来水洗净。
5
用Mayer 苏木精或0.5％甲基绿，复染胞
6
核（可不染）。
7
常规脱水、透明、封固、镜检。
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结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。
9
（四）免疫组化染色基本技术及注意事项 1．实验计划 ① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。 如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则 不能用其他动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若 PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。 ② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差 异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否 则无可比性。
生物显微技术 第三章 细胞化学和组织化学
❖ 显示脂类的基本原理 ：用易溶于脂类的染料, 使之溶于所检的脂质(如脂滴)中,使组织内的 脂类着色.
❖ 常用方法： 苏丹黑B法、油红O法、硫酸尼 罗蓝法 、苏丹Ⅲ染色法等
❖ 基本要求 ⑴ 不用石蜡切片. ⑵ 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好. ⑶ 方法: ① 物理法:脂溶性染料,不溶于水,属 偶 氮染料.常用苏丹Ⅲ,Ⅳ,苏 丹黑 ,油红O等. ② 化学方法:硫酸尼罗蓝显示脂肪酸. ③ 选择 性提取法(对照)
❖ 差不多与此同时(1900-1935年)，发现疾病组织中出 现的物质变化，更促进了化学技术在病理学染色方法 中的应用，也丰富了在显微镜下显示无机物、色素、 脂类、糖类、蛋白质、核酸等物质的组织化学内容， 此后又出现了酶的组织化学等。由此可见，“组织化 学”一词的含意是随时代而变化的，由定位趋向于与 定量相结合的研究。
❖ 3、灌注固定法：从心血管途径将固定剂灌注到全 身或某一个器官，使细胞保持生活时的状态而不发 生移位，固定后再迅速取材。
三、制 片
❖ 涂片法、石蜡切片法、冰冻切片法 ❖ 最常使用的为恒冷箱冰冻切片法。
四、注意事项
❖ 1、实验所用的器械、器皿都必须清洁无污染。 ❖ 2、配制试剂时应使用双蒸馏水。 ❖ 3、固定、取材都应在冷的环境下进行。 ❖ 4、各种试剂的pH值都要调准，否则影响反应结果。 ❖ 5、所用试剂要纯，都必须达到分析纯(A·R级)。 ❖ 6、同时、同条件情况下做阴性和阳性对照。 ❖ 7、了解和掌握被检组织中所要测定的化学物质或
❖ 以下介绍McGee-Ruseell核固红法。 ❖ 1、操作步骤 ❖ (1) 石蜡切片常规脱蜡至水。 ❖ (2)核固红染液染色2一10分钟。 ❖ 核固红染液的配制：核固红2g，蒸馏水100ml洗涤2次，剩
❖ 常用方法： 苏丹黑B法、油红O法、硫酸尼 罗蓝法 、苏丹Ⅲ染色法等
❖ 基本要求 ⑴ 不用石蜡切片. ⑵ 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好. ⑶ 方法: ① 物理法:脂溶性染料,不溶于水,属 偶 氮染料.常用苏丹Ⅲ,Ⅳ,苏 丹黑 ,油红O等. ② 化学方法:硫酸尼罗蓝显示脂肪酸. ③ 选择 性提取法(对照)
❖ 差不多与此同时(1900-1935年)，发现疾病组织中出 现的物质变化，更促进了化学技术在病理学染色方法 中的应用，也丰富了在显微镜下显示无机物、色素、 脂类、糖类、蛋白质、核酸等物质的组织化学内容， 此后又出现了酶的组织化学等。由此可见，“组织化 学”一词的含意是随时代而变化的，由定位趋向于与 定量相结合的研究。
❖ 3、灌注固定法：从心血管途径将固定剂灌注到全 身或某一个器官，使细胞保持生活时的状态而不发 生移位，固定后再迅速取材。
三、制 片
❖ 涂片法、石蜡切片法、冰冻切片法 ❖ 最常使用的为恒冷箱冰冻切片法。
四、注意事项
❖ 1、实验所用的器械、器皿都必须清洁无污染。 ❖ 2、配制试剂时应使用双蒸馏水。 ❖ 3、固定、取材都应在冷的环境下进行。 ❖ 4、各种试剂的pH值都要调准，否则影响反应结果。 ❖ 5、所用试剂要纯，都必须达到分析纯(A·R级)。 ❖ 6、同时、同条件情况下做阴性和阳性对照。 ❖ 7、了解和掌握被检组织中所要测定的化学物质或
❖ 以下介绍McGee-Ruseell核固红法。 ❖ 1、操作步骤 ❖ (1) 石蜡切片常规脱蜡至水。 ❖ (2)核固红染液染色2一10分钟。 ❖ 核固红染液的配制：核固红2g，蒸馏水100ml洗涤2次，剩
组织学基本技术ppt(共69张PPT)
显微镜技术
根据光源不同，显微镜分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以
可见光为光源，后者则以电子束为光源。
—、光学显微镜
（一）普通光学显微镜 （三）激光共聚焦扫描显微境
（五）相差显微镜
（七）微分干涉差显微镜
（二）荧光显微镜 （四）暗视野显微镜
（六）偏光显微镜
（八）倒置显微镜
尼康E-600光学显微镜
消 化 分 离 ： 将 组 织 分 离 成 小 块 ， 然 后 利 用 相 应 的 化 学 组涂织片制 ：片将技所术采➢是的随血着液生或命骨科髓学样的品发涂展抹而于不载断玻进片步上的经。瑞氏或姬姆萨染色后的标本。
抗体已失活、浓度过低；
磨片: 用于很药坚硬品的组水织，如溶骨和液牙。将其细胞间质消化溶去，再用机械分离的方
（二）固定
目的：使组织内的蛋白质迅速凝固或
沉淀，防止细胞自溶或组织腐败，尽 量保持组织的原有结构和化学组成。
固定液的种类
单纯固定液 ➢ 4%中性甲醛：用PH7.2-7.4的PBS配制，配制后 密封、 4℃保存，保存时间不超过一个月。适用 HE染色和免疫组化。 ➢ 4%多聚甲醛：用PH7.2-7.4的PBS配制。 ➢ 乙醇混合固定液
尼康E-600光学显微镜
普通光学显微镜由二 部分构成： ①光学部分：包括聚 光镜、物镜和目镜； ②机械部分：包括镜 臂、载物台等。
尼康E800荧光显微镜
荧光显微镜由光源、滤片系 统和显微镜三部分构成。光 源为高压汞灯，用以产生波 长短、能量高的紫外光。 原理：紫外光激发标本中的 荧光物质，使之产生各种不 同颜色的荧光，通过观察荧 光的分布与强弱来测定被检 物质。 研究内容：观察组织、细胞 中有自发荧光或经荧光染料 染色或标记的结构。
《组织化学染色》课件
科学研究
通过染色技术，研究人员可 以观察和研究细胞的结构和 功能。
药物开发
染色技术也可以用于药物开 发过程中的药效评估和分析。
组织化学染色的原理
组织化学染色的原理是利用化学反应将染料分子与组织或细胞结构中的特定 成分结合，从而产生颜色反应。
组织化学染色的步骤
1
标本制备
将组织标本收集、固定和包埋，以便进行 Nhomakorabea一步的染色过程。
2
染料选择
根据需要染色的组织或细胞成分特点选择合适的染料。
3
固定和染色
将标本与染料处理，使染料与目标结合，并增强染色效果。
优点和限制
优点
组织化学染色可以提供直观的视觉信息，用 于研究和诊断。
限制
染色结果可能受到多种因素影响，例如标本 质量和染色剂的稳定性。
常见问题和解决方法
1 染色结果不明显
可能因为染料浓度不足，可以尝试增加染料浓度。
常用的染色方法
1 酸性染料
酸性染料常用于染色细胞核和某些细胞器，例如血液涂片中的噬菌体。
2 碱性染料
碱性染料主要用于染色胞浆和细胞骨架，如组织切片中的嗜酸性细胞。
3 特殊染料
特殊染料用于特定类型的细胞或组织元素，例如肿瘤标志物的染色。
染色技术的应用
医学诊断
组织化学染色在病理学中广 泛应用于疾病的诊断和鉴定。
《组织化学染色》PPT课 件
欢迎来到《组织化学染色》的课程！在本课程中，我们将深入探讨组织化学 染色的基本原理、常用方法以及应用领域。准备好扩展您的知识，并让我们 一起开始这个令人兴奋的旅程吧！
染色的定义和作用
染色是一种在组织学和生物学研究中常用的技术，通过使用染料将细胞和组织的特定结构染色，以显示 其形态、组织类型和功能特点。
免疫组织化学染色技术PPT课件
• 抗原（antigen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（ 2 ） 反 应 原 性 （ reactogenicity ） 指 抗 原 分 子 与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
6
2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原7
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠
制备的单克隆抗体。
10
第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
17
尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（ 2 ） 反 应 原 性 （ reactogenicity ） 指 抗 原 分 子 与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
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2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原7
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠
制备的单克隆抗体。
10
第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
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尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同
现代组织化学组织化学
5. 酶类:
通过显示酶的活性来检测酶的存在。
常用光镜酶组织化学 显示法反应原理
酶组织化学基本反应原理
酶特异性底物 + 相关捕获剂
（孵育液内）
酶
（组织细胞内）
反应产物沉淀（有色）
镜下观察
反应产物沉淀（无色）+置换剂 有色沉淀
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅰ：钙-钴法
R-PO4Na2 +
H2O
CaCl2 酶作用
R-OH + CaHPO4
（无色沉淀）
CaHPO4 Co(NO3)2 Co3(PO4) 2
Co3(PO4) 2 (NH4)2S CoS ↓（显色）
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅱ：铅法
Pb2+
R-PO4Na2 + H2O 酶作用 R-OH + PbHPO4
PbHPO4 (NH4)2S PbS ↓（显色）
2%CaCl2 5%MgSO4 双蒸水
10 ml 10 ml 20 ml 1 ml 5 ml
酸性磷酸酶(ACP)
1、反应原理（铅法）：
R-O-PO3Na2 (β-甘油磷酸钠)
ACP pH 5.0
R-OH + H3PO4
H3PO4 + Pb2+ Pb3(PO4)2 + (NH4)2S
Pb3(PO4)2 PbS↓(棕黑色)
N—N—C6H5 酶作用 N＝N—C6H5 +2H C6H5—C
N—NH—C6H5 + HCl
N＝N—C6H5
四唑盐(无色)
甲月朁 （红色）
3、色素形成法
II、靛酚蓝法：
H3C CH3 N
+
通过显示酶的活性来检测酶的存在。
常用光镜酶组织化学 显示法反应原理
酶组织化学基本反应原理
酶特异性底物 + 相关捕获剂
（孵育液内）
酶
（组织细胞内）
反应产物沉淀（有色）
镜下观察
反应产物沉淀（无色）+置换剂 有色沉淀
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅰ：钙-钴法
R-PO4Na2 +
H2O
CaCl2 酶作用
R-OH + CaHPO4
（无色沉淀）
CaHPO4 Co(NO3)2 Co3(PO4) 2
Co3(PO4) 2 (NH4)2S CoS ↓（显色）
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅱ：铅法
Pb2+
R-PO4Na2 + H2O 酶作用 R-OH + PbHPO4
PbHPO4 (NH4)2S PbS ↓（显色）
2%CaCl2 5%MgSO4 双蒸水
10 ml 10 ml 20 ml 1 ml 5 ml
酸性磷酸酶(ACP)
1、反应原理（铅法）：
R-O-PO3Na2 (β-甘油磷酸钠)
ACP pH 5.0
R-OH + H3PO4
H3PO4 + Pb2+ Pb3(PO4)2 + (NH4)2S
Pb3(PO4)2 PbS↓(棕黑色)
N—N—C6H5 酶作用 N＝N—C6H5 +2H C6H5—C
N—NH—C6H5 + HCl
N＝N—C6H5
四唑盐(无色)
甲月朁 （红色）
3、色素形成法
II、靛酚蓝法：
H3C CH3 N
+
第13章 免疫组织化学技术(共42张PPT)
➢ 电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出基 因位点
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
组织化学技术教程PPT课件
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案例一：乳腺癌组织化学染色分析
总结词
乳腺癌组织化学染色分析是研究乳腺癌的重要手段， 通过染色技术观察癌细胞形态和组织结构变化，有助 于诊断和预后评估。
详细描述
乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，组织化学染色分析可 以帮助医生了解癌细胞的分化程度、恶性程度以及转 移情况。在染色过程中，常用的染色方法包括HE染色 、免疫组化染色和特殊染色等。通过观察癌细胞核增 大、核沟、核沟蛋自质等特征，可以判断癌细胞的恶 性程度和分化程度。此外，组织化学染色还可以用于 检测癌细胞转移和浸润的情况，为临床治疗提供依据 。
组织化学技术教程
目录
• 组织化学技术概述 • 组织化学技术的基本原理 • 组织化学技术的实际应用 • 组织化学技术的挑战与未来发展 • 案例分析
01 组织化学技术概述
定义与特点
定义
组织化学技术是一种利用化学反应来 检测组织或细胞内特定化学物质的方 法。
特点
高灵敏度、高特异性、可定量分析、 可定位分析等。
20世纪初
随着新技术的不断涌现，组织 化学技术得到迅速发展，并逐 渐应用于医学领域。
20世纪中叶
随着免疫组织化学和原位杂交 技术的出现，组织化学技术进 入了一个新的发展阶段。
21世纪
随着Байду номын сангаас白质组学和基因组学研究 的深入，组织化学技术在生命科
学领域的应用越来越广泛。
02 组织化学技术的基本原理
组织样本的获取
解决方案
针对这些挑战，可以采取优化实验条件、改进抗体标记技术、发展新型荧光染料 和探针等措施，提高检测的灵敏度和特异性。同时，加强样本处理和数据分析方 法的研究，提高实验结果的可靠性和可重复性。
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是常用的混合固定剂，特点是穿透力强、收缩作用小、固 定均匀，缺点是该固定液偏酸性，对抗原活性有影响 Carnoy固定液：冰乙酸、氯仿和无水乙醇组成，适于固定染 色体、DNA、RNA、糖原和尼氏体等，组织化学技术常 用 Zamboni固定液：多聚甲醛、饱和苦味酸和Karasson-Schwilt 磷酸盐缓冲液组成，类似于Bouin固定液，对超微结构的 12
(2) 细胞标本取材：
① 涂片法：培养的悬浮细胞，人体液中的细胞等，细胞密度 低时可先沉淀或者离心；
• 爬片法：贴壁生长的培养细胞； • 印片法：活组织标本、尸检标本及子宫颈外口等脱落细胞
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二、标本的制备
2. 固定（fixation）
(1) 固定的目的：
保持组织细胞原有的形态结构；使组织硬化；对组织化 学及细胞化学技术来说---保存酶活性和蛋白质的抗原性 非常重要
2. 固定
(4) 固定的方法： 灌流法：适用于动物实验中对缺氧敏感
的器官，如神经系统、胃肠等取材。
包括推注，滴注 滴注步骤(大鼠)： 开胸- 暴露心脏- 自心尖剪开左心室-插入灌流 针至主动脉弓- 固定灌流针-快速注入冲洗液， 剪开右心耳- 先快后慢注入固定液- 慢注毕， 将动物装入含少量固定液的塑料袋置4ºC冰箱 内静置2h后取材（或立即取材），放入固定 液中进行后固定 大动物多采用输液方式，将固定液从一侧颈总 动脉或股动脉输入，从另一侧切开静脉放血 固定液的输入量因个体不同而异，500～2,000 毫升不等
(2) 固定的优、缺点：
优点：使组织细胞的形态结构得到保持 缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损
9
二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
① 单一固定剂：
A. 交联固定剂
Байду номын сангаас
甲醛、多聚甲醛、戊二醛等：与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨
基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白分子相互交联，保存抗原于原位。其特点是
组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。但是，醛基与抗原蛋白氨基交
联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象出现障碍，可能部分或完全遮盖抗原
决定簇，在免疫组织化学染色时产生假阴性结果。固定时缩短固定时间（824
小时），降低固定温度（4℃）、固定后充分水洗、在免疫组织化学染色之前通
过抗原修复等可提高抗原反应性。常用的有：10%福尔马林（即4%甲醛）、4%
5
一、绪论
3. 组织化学与细胞化学技术的主要类型
化学方法，类化学方法，物理学方法，显微烧灰方 法，免疫学方法，分子生物学方法等
常用分类： (1) 一般组织化学与细胞化学 (2) 免疫组织化学与细胞化学 (3) 原位杂交组织化学 * 每种均有光镜和电镜之分和定性与定量之分
6
一、绪论
4. 组织化学与细胞化学技术的基本要求
3
一、绪论
2. 组织化学与细胞化学技术的特点
普通组织学技术：组织原位，染色，显微镜观察
HE染色
HE染色
4
一、绪论
2. 组织化学与细胞化学技术的特点
组织化学与细胞化学技术
PAS法显示粘多糖
铅法（ATP酶）
组织原位，特异性的化学反应，显微镜观察
——对组织或者细胞内特定物质进行定性， 定位， 定量分析
------介于细胞生物学、组织学、化学、生物化 学、免疫学及分子生物学之间的边缘科学
------对组织与细胞的化学成分或者酶活性进行 定性、定位和定量的研究。常统称为“组织化 学”
------在保持组织或细胞基本不改变其生活状态时 的微细结构的条件下，利用某些特异性的反应， 采用显微镜技术观察某些化学成分或酶活性在组 织或细胞内的定性、定位和定量及其变化规律
现代组织化学技术
组织化学与细胞化学
1
学习要求
1．掌握组织化学技术的基本概念 2．熟悉组织化学和免疫组织化学标本的制备方 法及过程 3．掌握酶组织化学的基本原理 4．熟悉高碘酸Schiff（PAS）反应、过氧化物酶、 酸性磷酸酶铅法的基本原理
2
一、绪论
1. 什么是组织化学与细胞化学技术？
Histochemistry and cytochemistry
二、标本的制备
2. 固定
(4) 固定的方法
浸渍法、灌注法、滴片法、原位法、蒸汽法和微波法等，浸 渍法和灌注法用的最多
浸润法：适用于临床取材的标本和小动物组织固定，做好
标记，直接将组织块修整为合适大小，投入到样品体积的40 倍左右的固定剂中，固定剂的种类和固定时间的长短根据情 况而定
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二、标本的制备
多聚甲醛（应用最为广泛）、2.5%戊二醛等
A. 戊二醛含两个醛基，对膜结构固定更好，但是形成更多的交联，对抗原活性有
影响
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二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
① 单一固定剂：
B. 凝固沉淀固定剂 丙酮、甲醇/乙醇、苦味酸、乙酸、三氯乙酸和氯化汞等：使
组织细胞中的蛋白质、糖等物质凝固，优点是渗透力强，对抗原活性和酶活性 保存较好；缺点是固定快，易使组织细胞收缩，小分子物质不容易保存，膜结 构会破坏，因此对细胞结构保存不好。固定方法在4℃，30~60 min 为宜。
① 其他固定剂
B. 铬酸、重铬酸钾、四氧化锇等 四氧化锇：非电解质强氧化剂，与氨基酸、肽和蛋白质反应形成交联，保存微
细结构作用好，对组织收缩和膨胀的影响小，电镜技术常用的固定剂
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二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
② 混合固定剂：
Bouin固定液、Carnoy固定液、Zamboni固定液等 Bouin固定液：甲醛、冰乙酸和饱和苦味酸按一定比例混合，
冲洗液 固定液
动物
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二、标本的制备
2. 固定
(5) 影响固定的因素：
① 组织块不宜过大： 组织块过大会影响固定剂的渗透 ② 固定液的量要合适：固定液的量要超过组织块大小的20倍-30倍，
(1) 保持组织和细胞的完整性 (2) 被检物质具有不溶性和（或）可视性 (3) 反应具有特异性 (4) 反应具有灵敏性 (5) 可重复性
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二、标本的制备
1. 取材（draw material）
(1) 组织标本取材：
准备充分、麻醉或处死方法合适、操作迅速、刀应锐利、适当 清洗、离体即固定（或冷冻切片，或保存于-80℃冰箱）、 大小适中（约2.5cm×2.5cm×0.2cm，宁可面积大，不能厚）
(2) 细胞标本取材：
① 涂片法：培养的悬浮细胞，人体液中的细胞等，细胞密度 低时可先沉淀或者离心；
• 爬片法：贴壁生长的培养细胞； • 印片法：活组织标本、尸检标本及子宫颈外口等脱落细胞
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二、标本的制备
2. 固定（fixation）
(1) 固定的目的：
保持组织细胞原有的形态结构；使组织硬化；对组织化 学及细胞化学技术来说---保存酶活性和蛋白质的抗原性 非常重要
2. 固定
(4) 固定的方法： 灌流法：适用于动物实验中对缺氧敏感
的器官，如神经系统、胃肠等取材。
包括推注，滴注 滴注步骤(大鼠)： 开胸- 暴露心脏- 自心尖剪开左心室-插入灌流 针至主动脉弓- 固定灌流针-快速注入冲洗液， 剪开右心耳- 先快后慢注入固定液- 慢注毕， 将动物装入含少量固定液的塑料袋置4ºC冰箱 内静置2h后取材（或立即取材），放入固定 液中进行后固定 大动物多采用输液方式，将固定液从一侧颈总 动脉或股动脉输入，从另一侧切开静脉放血 固定液的输入量因个体不同而异，500～2,000 毫升不等
(2) 固定的优、缺点：
优点：使组织细胞的形态结构得到保持 缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损
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二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
① 单一固定剂：
A. 交联固定剂
Байду номын сангаас
甲醛、多聚甲醛、戊二醛等：与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨
基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白分子相互交联，保存抗原于原位。其特点是
组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。但是，醛基与抗原蛋白氨基交
联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象出现障碍，可能部分或完全遮盖抗原
决定簇，在免疫组织化学染色时产生假阴性结果。固定时缩短固定时间（824
小时），降低固定温度（4℃）、固定后充分水洗、在免疫组织化学染色之前通
过抗原修复等可提高抗原反应性。常用的有：10%福尔马林（即4%甲醛）、4%
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一、绪论
3. 组织化学与细胞化学技术的主要类型
化学方法，类化学方法，物理学方法，显微烧灰方 法，免疫学方法，分子生物学方法等
常用分类： (1) 一般组织化学与细胞化学 (2) 免疫组织化学与细胞化学 (3) 原位杂交组织化学 * 每种均有光镜和电镜之分和定性与定量之分
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一、绪论
4. 组织化学与细胞化学技术的基本要求
3
一、绪论
2. 组织化学与细胞化学技术的特点
普通组织学技术：组织原位，染色，显微镜观察
HE染色
HE染色
4
一、绪论
2. 组织化学与细胞化学技术的特点
组织化学与细胞化学技术
PAS法显示粘多糖
铅法（ATP酶）
组织原位，特异性的化学反应，显微镜观察
——对组织或者细胞内特定物质进行定性， 定位， 定量分析
------介于细胞生物学、组织学、化学、生物化 学、免疫学及分子生物学之间的边缘科学
------对组织与细胞的化学成分或者酶活性进行 定性、定位和定量的研究。常统称为“组织化 学”
------在保持组织或细胞基本不改变其生活状态时 的微细结构的条件下，利用某些特异性的反应， 采用显微镜技术观察某些化学成分或酶活性在组 织或细胞内的定性、定位和定量及其变化规律
现代组织化学技术
组织化学与细胞化学
1
学习要求
1．掌握组织化学技术的基本概念 2．熟悉组织化学和免疫组织化学标本的制备方 法及过程 3．掌握酶组织化学的基本原理 4．熟悉高碘酸Schiff（PAS）反应、过氧化物酶、 酸性磷酸酶铅法的基本原理
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一、绪论
1. 什么是组织化学与细胞化学技术？
Histochemistry and cytochemistry
二、标本的制备
2. 固定
(4) 固定的方法
浸渍法、灌注法、滴片法、原位法、蒸汽法和微波法等，浸 渍法和灌注法用的最多
浸润法：适用于临床取材的标本和小动物组织固定，做好
标记，直接将组织块修整为合适大小，投入到样品体积的40 倍左右的固定剂中，固定剂的种类和固定时间的长短根据情 况而定
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二、标本的制备
多聚甲醛（应用最为广泛）、2.5%戊二醛等
A. 戊二醛含两个醛基，对膜结构固定更好，但是形成更多的交联，对抗原活性有
影响
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二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
① 单一固定剂：
B. 凝固沉淀固定剂 丙酮、甲醇/乙醇、苦味酸、乙酸、三氯乙酸和氯化汞等：使
组织细胞中的蛋白质、糖等物质凝固，优点是渗透力强，对抗原活性和酶活性 保存较好；缺点是固定快，易使组织细胞收缩，小分子物质不容易保存，膜结 构会破坏，因此对细胞结构保存不好。固定方法在4℃，30~60 min 为宜。
① 其他固定剂
B. 铬酸、重铬酸钾、四氧化锇等 四氧化锇：非电解质强氧化剂，与氨基酸、肽和蛋白质反应形成交联，保存微
细结构作用好，对组织收缩和膨胀的影响小，电镜技术常用的固定剂
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二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
② 混合固定剂：
Bouin固定液、Carnoy固定液、Zamboni固定液等 Bouin固定液：甲醛、冰乙酸和饱和苦味酸按一定比例混合，
冲洗液 固定液
动物
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二、标本的制备
2. 固定
(5) 影响固定的因素：
① 组织块不宜过大： 组织块过大会影响固定剂的渗透 ② 固定液的量要合适：固定液的量要超过组织块大小的20倍-30倍，
(1) 保持组织和细胞的完整性 (2) 被检物质具有不溶性和（或）可视性 (3) 反应具有特异性 (4) 反应具有灵敏性 (5) 可重复性
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二、标本的制备
1. 取材（draw material）
(1) 组织标本取材：
准备充分、麻醉或处死方法合适、操作迅速、刀应锐利、适当 清洗、离体即固定（或冷冻切片，或保存于-80℃冰箱）、 大小适中（约2.5cm×2.5cm×0.2cm，宁可面积大，不能厚）