酵母双杂交(自激活) (2)
酵母双杂交
应用酵母双杂交系统对Prp蛋白与 shadoo蛋白互作的研究
1诱饵质粒的构建 2猎物质粒的构建 3诱饵质粒与猎物质粒的可行性检验及互作 4结果分析
第二十八页，共60页。
PRP蛋白：朊蛋白 PRNP：朊蛋白基因 Shadoo蛋白：与朊蛋白在N端结构上及其相似
的新蛋白 SPNR：Shadoo蛋白的结构基因
第二十页，共60页。
转印
相互作用
第二十一页，共60页。
(2) Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统（reverse two-hybrid system）。这项技术的关键是报道基因 URA3的引入。URA3基因在这里起到了反选择的作用,
它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5-氟乳清酸 (5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。
第三十七页，共60页。
C) 感受态细菌的转化
1)将DH5a感受态细胞从-70℃冰箱中取出,立即置于冰水 中,10min融化; 2)将10μL连接产物加入DH5a感受态细胞溶液中(超净工作 台进行),轻轻吹打混匀,冰浴30min。42℃水浴热激2min,此
⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。
1)由于某些蛋白本身具有激活转录功能。在酵母中表
达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在 无特异激活结构域的情况下可激活转录。 2)某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与 其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。
重组质粒的小量提取按vitagene生物公司开发的柱离心式琼脂糖凝胶dna质粒小量提取试剂盒进行操作将所提质粒dna在10琼脂糖凝胶上进行电泳紫外灯下观察质粒提取情况并拍照并贮存于20重组质粒的鉴定将经过电泳筛选出的可疑阳性克隆质粒进行bamhi和sall双酶切反应37度酶切2h10ddh2o88ltotal20l序列测定经双酶切分析证明连接成功后将保留菌种送上海生工生物技术有限公司进行序列测定
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母单Байду номын сангаас交
酵母双杂交的原理和应用
酵母双杂交的原理和应用前言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究蛋白质间相互作用。
本文将介绍酵母双杂交的原理和应用，并详细说明相关实验步骤和注意事项。
一、酵母双杂交原理酵母双杂交利用酵母细胞中的转录因子来检测两个蛋白质是否发生相互作用。
该技术包括两个主要步骤：酵母杂交库的构建和蛋白质相互作用的检测。
1.酵母杂交库的构建–首先，需要构建一个酵母细胞库，其中包含目标蛋白的编码序列，以及与之它相互作用的蛋白编码序列。
–这些蛋白编码序列被插入一个特殊的酵母表达载体中，该载体包含一个转录因子启动子和一个可变启动子。
当目标蛋白与与之相互作用的蛋白结合时，转录因子被激活，并启动报告基因的表达。
2.蛋白质相互作用的检测–将酵母杂交库与一个可能与目标蛋白相互作用的蛋白质编码序列进行杂交。
–利用筛选或选择的方法，检测是否存在转录因子的激活，从而判断蛋白质是否发生相互作用。
二、酵母双杂交的应用酵母双杂交技术在生物学研究中有广泛的应用，主要用于以下方面：1.蛋白质相互作用的筛选–酵母双杂交可以用于大规模筛选蛋白质间的相互作用。
通过构建酵母杂交库，并与目标蛋白进行杂交，可以鉴定潜在的相互作用蛋白，从而探索蛋白质间的相互作用网络。
2.功能区域的鉴定–通过酵母双杂交，可以鉴定特定的蛋白质功能区域。
例如，在研究某个转录因子的结构和功能时，可以利用酵母双杂交技术识别其与其他蛋白质相互作用的功能区域。
3.药物靶点的鉴定–酵母双杂交可以用于鉴定药物的靶点。
通过与已知药物相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与特定药物相互作用的蛋白质，进而确定药物的作用机制和潜在靶点。
4.疾病相关基因的鉴定–酵母双杂交还可以用于鉴定疾病相关基因。
通过与疾病相关蛋白相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与疾病发生发展相关的基因，从而揭示疾病的发病机制。
三、酵母双杂交实验步骤酵母双杂交实验包括以下步骤：1.构建酵母杂交库：–从样品中提取RNA或DNA片段；–将片段克隆到酵母表达载体中；–将载体转化至酵母细胞中。
酵母双杂
2014.07.20一、酵母双杂交1.传统的酵母双杂酵母双杂交是基于真核生物中的转录调控所建立的。
一般情况下，酵母的转录因子氛围两个结构域：一个是位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD），负责结合识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游；另一个是位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain, AD)，负责同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
如果当这两个结构域充分的接近时，会启动酵母中相关的基因的表达。
酵母双杂交技术主要利用BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，使两个结构域重新构成，则会启动特异基因序列的转录. 一般地，将BD-X的融合蛋白称作诱饵（bait),X往往是已知蛋白，AD-Y称作猎物（prey），能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因（如Lacz基因），通过对报告基因的检测，反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用。
酵母双杂交系统包括：1.与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称为诱饵蛋白。
2.与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的成为靶蛋白。
3.带有一个或者多个的报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有:HIS3、URA3、LACZ和绿色应该蛋白等。
2.DUALmembrane系统——一种膜蛋白质互作的研究方法2.1主要针对于：膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白的互作研究2.2应用：两个已知蛋白（其中一个是膜蛋白）间互作关系的验证膜互作蛋白的文库筛选2.3DUAL的作用原理：该系统由分离的泛素介导的蛋白互作信号的识别。
泛素是一种含76个氨基酸的保守蛋白，它经常作为降解信号连接在蛋白质的N端。
泛素能被其特异性的蛋白酶(UBPs)识别并从所连接的蛋白上切割下来，切割位总是位于泛素蛋白的C端。
在酵母细胞中，泛素可以分成两部分分别表达，即其N端部分(NubI, 第1~34位氨基酸)和C端部分(Cub, 第35~76位氨基酸)，后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白(Stagljar et al., 1998)。
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母双杂交ad自激活验证步骤
酵母双杂交ad自激活验证步骤
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）是一种常用的蛋白质相互作用研究技术。
下面是酵母双杂交AD自激活验证的步骤：
1. 构建酵母双杂交AD靶蛋白的表达载体：将目标蛋白的编码序列克隆到酵母双杂交AD表达载体中，将其与AD激活域相连，以使目标蛋白能够激活报告基因的表达。
2. 转化AD靶蛋白表达载体到酵母菌株中：通过酵母转化方法将AD靶蛋白表达载体导入酵母菌中，使其能够表达目标蛋白并激活报告基因。
3. 培养转化后的酵母菌株：将转化后的酵母菌株分别培养在选择性培养基上，其中包含AD靶蛋白表达载体所对应的选择性标记物，以筛选出成功转化的酵母菌株。
4. 鉴定AD自激活：通过观察报告基因的表达情况，若转化后的酵母菌株在选择性培养基上形成克隆，表明AD靶蛋白具有自激活能力。
此时需要通过相应的对照实验来确认AD靶蛋白的自激活性质。
需要注意的是，酵母双杂交中AD自激活验证的结果需要慎重解读，因为自激活可能会产生误报。
因此，在进行酵母双杂交实验时，通常需要配对对照实验来排除自激活的影响，以确保结果的准确性。
酵母双杂交
酵母双杂交折叠编辑本段基本思想酵母双杂交由Fields在1989年提出. 他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究. GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域. 位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNA binding domain，DNA-BD)和位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域(Activati酵母双杂交模型on domain,AD).DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，并与之结合. 而AD则是通过与转录机构(transcriptionmachinery)中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录. DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录.Fields建立了一个双杂交系统，BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，使GAL4两个结构域重新构成，则会启动特异基因序列的转录. 他们利用Snf1与Snf4的相互作用，将Snf1与BD融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上. 其中Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是他的一个结合蛋白. 研究者将二种穿梭质粒转化酵母GGY:171 菌株，该菌株含有LacZ报告基因，并已去除相应转录因子基因. 该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录. 一般地，将BD-X的融合蛋白称作诱饵(bait),X往往是已知蛋白，AD-Y称作猎物(prey)，能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因，通过对报告基因的检测，反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用.折叠编辑本段基本原理双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它基于酵母细胞内存在的转录激活子结合域（Transcription Activation Domain，TAD）和DNA结合域（DNA Binding Domain，DBD），通过融合特定的蛋白质序列并在酵母细
胞中共同表达，以实现筛选并鉴定蛋白质相互作用的目的。
酵母双杂交具体实验流程如下：
1.构建启动子驱动的酵母表达载体
该载体包含两部分：AD与DB，分别携带TAD和DBD结构域。
这些结构域可以具体化作为外源蛋白的两个互补部分，这样当它们相互结
合时，激活酵母内的报告基因（RLUC或LacZ）表达，并通过信号放
大器Cre的介入增强了信号。
2.构建融合基因的酵母表达载体
将想要研究的两种蛋白质的氨基酸序列分别连接到AD与DB的C端，形成融合蛋白质基因，然后将融合基因与启动子驱动的表达载体转化
入双杂交酵母细胞。
3.获得蛋白质相互作用的筛选和确认
通过对酵母双杂交转化后的细胞进行筛选，并通过对表达的信号进行观察和测量，得到蛋白质相互作用的筛选结果。
4.确定筛选结果的真实性
在确定特定蛋白质相互作用是否真实的过程中，通常会进行一些补充实验。
例如，可以通过分析生化反应，并利用免疫共沉淀等方法验证筛选结果的可靠性。
总的来说，酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它可以快速、可靠地鉴定蛋白质相互作用，从而帮助研究者更深入地探究蛋白质的功能和作用机制。
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D N A b i n d i n g d o m a i n
U A S ( u p s t r e a m a c t i v a t i o n s e q u e n c e )
t r a n s c r i p t i o n m a c h i n e r y
g e n e
Yeast two-hybrid system:
自激活原理
GAL4BD Transcription factors
X
X
r e p o r t e r g e n e
His, β-gal
YPDA培养基
YPDA 蛋白胨 酵母提取物 琼脂 0.2%ade 葡萄糖 液体 500ml 10g 5g —— 10ml 10g 固体 100ml 2g 1g 2g 2ml 2g
a c t i v a t i o n d o m a i n
D N A b i n d i n g d o m a i n
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t r a n s c r i p t i o n m a c h i n e r y
一、原理
真核生物的转录因子是由两个可以分开的、 功能上相互独立的结构域(domain)组成的。
酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个 由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个 氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
GAL4分子的BD可以同上游激活序列 (upstream activating sequence,UAS)结合。 AD则能激活UAS下游的基因进行转录。 单独的BD和AD都不能激活UAS的下游 基因，它们之间只有通过某种方式结合 在一起才具有完整的转录激活功能。
Yeast two-hybrid system:
His, β-gal
一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列（ GAL UAS ）结合，但不能 引起转录。然而，将一段具有转录激活活性 的转录因子基因构建到 BD 载体上，若其表 达产生的 BD 单独与 UAS 结合也可以引起 下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双 杂中的自激活现象。反过来，可以利用这种 自激活现象来验证某个转录因子是否具有转 录激活活性。
g e n e
D o th e s e p ro te in s b in d ?
Y
X
X
X YBiblioteka o u r t w o h y b r i d p r o t e i n s b i n d !
yes, we have expression of the reporter indicating that the proteins bind!
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Regulation of gene expression in yeast
t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r
a c t i v a t i o n d o m a i n
0.2g ade定容至 100ml → 0.2%的ade母液
pH 6.5
灭菌 121℃ 15min
正对照：pGAL4
负对照： pBD-GAL4
酵母菌株感受态细胞制备：
1. 将-70℃下冻存的酵母菌在YPAD平板上划线，倒置于30℃培养2-3天。 2. 挑取2-4个大菌落（直径2-3mm）于1.5ml YPAD液体培养基中，剧烈震 荡5min，打散菌落，接种于50ml YPAD液体培养基中（250ml三角 瓶），230-250转/min，30℃培养18-24hr。 3. 取菌液测定其OD600值，需达到1.5。若不到，再培养1~2hr，若还不到， 换单克隆重摇。 4. 取50ml菌液于300mlYPAD培养基中（1-2L大三角瓶），30℃， 230rpm，摇培3hr，至 OD600值为0.4~0.6。 5. 4000rpm 5min 于常温收集菌体，重复一次。 6. 室温下1000g离心5min，去上清，加入50ml 超纯水清洗悬浮3次。 7. 1000g离心5min，弃上清，用新配的1.5ml 1×TE/LiAc重悬细胞，置冰
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Suppose we have two proteins...
X
Y
and the question, do these two protein bind each other?
One way of answering this question is to use the yeast two hybrid method.
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions Regulation of gene expression in yeast
t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r
上，即成为酵母感受态细胞。
（只能现做现用，不能贮存，室温只能放置1-2hr）。
酵母转化
1. 鲑鱼精 DNA（20μg/μl）沸水中煮20min，冰上冷却10min。 2. 加入100μl酵母感受态细胞、1~2μl构建质粒（约200ng）、100μg鲑 鱼精、600μl TE-LiAc-PEG，变速涡旋10s~1min至混匀。 3. 30℃，200rpm/min，恒温摇床振荡30min。 4. 加入70μl DMSO，温和颠倒混匀。 5. 42℃水浴热休克15min，后冰浴10min。 6. 常温下，3000rpm离心10s；弃上清（去干净），用0.5ml 1×TE重悬 细胞。（ 1×TE室温只能放置1~2hr） 7. 将转化后的酵母培养于SD/-Trp培养基上，30℃倒置培养约3-5天，直 至出现菌落。
Y
t h u s f o r m i n g a f u n c t i o n a l t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r . . . X
Y
do we get expression of the reporter?
r e p o r t e r g e n e