文库构建及酵母双杂交技术
酵母双杂技术的原理和应用
酵母双杂技术的原理和应用一、酵母双杂技术的原理酵母双杂技术是一种重要的基因工程技术，其原理主要包括以下几个方面：1.酵母双杂技术的基本原理：酵母双杂技术基于酵母细胞中的两种杂交酵母菌株，一种包含目标酵母蛋白的报告基因，另一种包含潜在的酵母互补DNA库。
通过把这两个酵母菌株共同培养在含有特定酵母蛋白诱导剂的培养基中，使得目标酵母蛋白和潜在互补DNA库中的DNA相互作用，从而筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列。
2.双杂交酵母菌株的构建：首先需要构建含有目标酵母蛋白的报告基因表达酵母菌株，该菌株会在酵母细胞中表达目标蛋白。
同时，还需要构建潜在酵母互补DNA库，该库中含有大量酵母基因组DNA片段的克隆。
3.酵母菌株的培养和筛选：将目标蛋白报告基因酵母菌株和酵母互补DNA库菌株共同培养在含有诱导剂的培养基中，诱导目标蛋白和潜在互补DNA库中的DNA发生相互作用。
然后利用适当的筛选方法，如抗生素抗性筛选或含有荧光素底物的筛选，筛选出与目标蛋白相互作用的克隆。
二、酵母双杂技术的应用酵母双杂技术广泛应用于生物医药、生物学研究等领域，具有多个重要的应用方面：1.蛋白相互作用的研究：通过酵母双杂技术，可以快速筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列，从而深入研究蛋白相互作用的机制和功能。
这对于揭示生物体内复杂蛋白相互作用网络、研究疾病相关蛋白相互作用具有重要意义。
2.新药靶点的发现：通过酵母双杂技术，可以筛选出与药物分子相互作用的蛋白，从而为新药靶点的发现提供候选蛋白。
这对于药物研发和临床治疗具有重要意义。
3.基因功能研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与目标基因相互作用的蛋白，从而推断目标基因的功能。
这有助于揭示基因的调控机制和功能。
4.疾病相关基因的筛选：通过酵母双杂技术，可以筛选出与疾病相关的基因，从而对疾病的发生机制和治疗提供有价值的信息。
5.基因治疗的研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与治疗目标相关的蛋白或基因，从而为基因治疗的研究提供候选靶点或治疗策略。
Mate_Plate酵母双杂交文库构建中文说明书(clontech)
系统说明书PT4085-1 (PR013451)Cat. No. 630490Published February 2010“Mate & Plate™”文库构建系统说明书目录I. 介绍&操作流程 (4)II. 组份列表 (5)III. 附加产品推荐 (7)IV. 缩写列表 (8)V. 宿主菌株信息 (9)VI. 对照实验 (10)A. 总论 (10)B. 操作:对照同源重组克隆的实验操作 (10)VII. cDNA文库构建 (11)A. 操作:第一链cDNA合成 (11)B. 操作:长距离PCR (LD-PCR)扩增cDNA (13)C. 操作: CHROMA SPIN™ TE-400 纯化ds cDNA (14)VIII. 双杂交文库构建 (16)A. 酵母双杂交文库构建&筛选总论 (16)B. 操作:制作Mate & Plate文库 (16)IX. 参考文献 (18)X. 疑难解答指南 (19)附录A: 文库滴度测定 (24)附录B: 质粒信息 (22)附录C: 酵母生长培养基&补充物 (23)附录D: SMART™ 技术概述 (25)Protocol No. A Clontech Laboratories, Inc. Version No. PR013451 Takara Bio Company2“Mate & Plate™”文库构建系统说明书目录，续图表Figure 1.利用酵母的生物学知识构建Mate & Plate文库 (4)Figure 2. Mate & Plate文库构建概述 (11)Figure 3. SMART cDNA合成高质量cDNA (14)Figure4. CHROMA SPIN纯化柱和收集管 (15)Figure 5. pGADT7-Rec 载体图谱和克隆位点 (22)Table I:酵母宿主菌株的基因型 (9)Table II:根据不同SD培养基的表型测试 (9)Table III: RNA起始量和PCR最优循环数的相关性分析 (13)Table IV:酵母培养基套装2&酵母培养基套装2Plus的各组份 (23)Table V: Matchmaker黄金酵母操作用独立包装的酵母培养基 (23)Table VI:酵母双杂交筛选用的附加培养基&培养基补充物 (24)＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿A Clontech Laboratories, Protocol No. PT4085-1 Takara Bio Company Version No.PR0134513“Mate & Plate™”文库构建系统说明书1.介绍&操作流程酵母双杂交系统主要是从prey文库中筛选与已知蛋白（bait）有相互作用的蛋白（prey）。
灰飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建及分析
２１．７ ）９ ２ ０１３（ ： — ３ １１
Ｐａｔ ｒ ｅ ｉ ｌｎＰ ｏ ｃｏ ｔｔｎ
ｌｌ 报 ｆ 开罗 ｆ ＲｅｃＲ ｏｓｌ ｅａｈ ｅｒ ｓｒ ｐｔ
灰 飞虱酵 母双 杂交 ｃ Ｎ Ｄ Ａ 的构 建 及分 析 肖冬来 ， 邓 慧颖 ， 谢荔 岩 ， 吴 祖 建 ， 谢 联 辉
ＸｉｏＤｏ ｇａ， Ｄ ｎ ｉ ｎ － Ｘｉ Ｌ ｙｎ Ｗ ｕＺ ｊ ｎ Ｘｉ Ｌａ ｈ ｉ ａ ｎ ｌｉ ｅ ｇＨｕｙ ｇ ｉ ｅ ｉａ ， ｕｉ ， ａ ｅ ｉ ｕ ｎ
（ ｙＬ ｂ ｒｔｒ ｆ ｌｎ ｉ ｌ ｙｏ ｕｉ ｒ ｖ ｃ ，Ｉ ｓ ｔｔ ｏ ｌ ｔ ｉ ｌｇ ｆ ｕｉｎ Ｋｅ ａ ｏａｏｙｏ ａ ｔＶｒ ｏ ｆＦ ｊ ｎＰ ｏ ｉ ｅ ｎｔ ｕｅ ｆＰａ ｒ ｏｙｏ ｊ Ｐ ｏｇ ａ ｎＤＮ ．５ ０ ｆ 扩 ｕ ． ×１ ｃｕ ｍＬ，
重 组 率 约 为 ９ ； 增 文 库 插 入 片段 主 要 集 中在 １００ １５０ｂ ７ 扩 ０ ０ ｐ之 间 。 随 机 挑 取 １ Ｏ个 克 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ， 测 序 与 ＧｅＢ ｎ 经 ｎ ａｋ 数据 库 比 对 结 果显 示 ７个克 隆具 有 同 源序 列 ， 中 Ｉ 、 ９为 已公 布 的灰 飞 虱序 列 。灰 飞 虱 酵 母 双 杂 交 ｃ ＮＡ 文 库 其 Ｌ ２ Ｄ
ｇ ｕ ｅ ｕ ｎ ｅ ｎ ｎ ｏ ｓｓ ｑ ｅ ｃ ｓ ｉ Ｇｅ Ｂａ ｋ． Ｃｌ ｎ ｓ Ｌ２ ａ ｄ Ｌ９ ｗｅ ｅ ｔ ｅ ｓ ｉ ｅ ａ ｈ ｕ ｌ ｈ ｄ ｓ ｑ ｅ ｃ ｓ Ｃｏ ｓｒ ｃ ｉ ｎ ｏ ｈ ｓ ｎ ｏ ｅ ｎ ｒ ｈ ａｎ ｓ ｔ ｅ ｐ ｂ ｉ ｅ ｅ ｕ ｎ ｅ ． ｓ ｎ ｔｕ ｔ ｆ ｔ ｉ ｏ ｙ ａ ｔ ｔ — ｙ ｒｄ ｅ ｅ ｓ ｗｏ ｈ ｂ ｉ ＤＮＡ ｉ ｒ ｒ ｆＬ ｏ ｅ ｐ ａ ｔｉ ｌｕ ａ ｄ ｔ ｅ ｆ ｕ ｄ ｔ ｎ ｆ ｒｃ ｏ ｉ ｇ ｏ ｕ ｃ ｉ ｎ ｌ ｅ ｅ ｎ Ｌ． ｌｂ ａ ｙ ｏ ａ ｄ ｌ ｈ ｘ ｓ ｒａ ｅ ｌ ｓ ｌ ｉ ｈ ｏ ｎ ａ ｉ ｏ ｌ ｎ ｎ ｆｆ ｎ ｔ ａ ｎ ｓｉ ｔ ｏ ｏ ｇ ｓｒａ ｅｌ ｓ ａ ｄ ｓ ｕ ｉ ｓｏ ｔｉ ｔ ｌ ｎ ｔ ｄ ｅ ｎ Ｌ．ｓ ｒ ｔ ｌ ｓ ｖ ｒ ｓ ｉ ｔ ｒ ｃ ｉ ｎ ． ｕ ｔｉ ｅ ｌ — ｉｕ ｎ ｅ ａ ｔ ｓ ａ ｕ ｏ Ｋｅ ｒ ｓ Ｌａ ｄ ｌ ｈ ｘ ｓｒａ ｅｌ ｓ ｙ ｗｏ ｄ ｏ ｅｐ ａ ｔｉ ｔ ｌ ； ｕ ｙ ａ ｔｔ － ｙ ｒｄ ｅ ｓ ｗｏ ｈ ｂ ｉ ； Ｇａ ｅ ｙ ｔ ｗａ ； ｃ ＤＮ释e值褐飞虱肌球蛋广l2轻链琏闪灰毪虱细胞色素氧化酶哑摹基因褐飞虱肌球蛋门2轻链基因飞虱科wby一200016s核糖体rna基因褐飞虱卵黄原蛋白基因未发现同源基因柑橘木虱40s核糖体蛋白sa摹冈束发现同源堆阂灰飞虱al微管蛋白基因未发现同源基因3e一140004e一1623e
酵母双杂实验步骤
2.1.1 酵母双杂交2.1.1.1 Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TTG-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TTG-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。
其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。
通过PCR扩增获得带有attB位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。
获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。
进行BP反应时，需注意以下几项：(1) 对于BP反应来说，最高效的是采用线性的attB-PCR产物和超螺旋的attP入门载体；(2) 为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3) 提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。
酵母双杂交.三杂交
其中第一个融合蛋白由两部分组成，一部分为能 结合lexA启动子的DNA结合结构域，另一部分为噬菌 体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白也由两部分组成， 一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构域，另一 部分为有待研究的RNA结合蛋白“Y”。
这两个融合蛋白通过第三个融合的RNA分子相连，其一 端为含有噬菌体衣壳蛋白MS2结合位点的MS2RNA，另 一端为有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互 作用就使得这个复合物形成一个功能性的转录激活因 子，从而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表达。 LacZ基因的表达水平能够通过在体外检测β半乳糖苷酶 的活性来确定,His3基因的表达赋予了酵母细胞在缺乏 组氨酸的培养基上生存的能力。通过缺陷培养基及β半 乳糖苷酶的活性的测定就能判断在酵母菌内是否发生 了RNA“X”和蛋白质“Y”的相互作用。
negative selection by adding FOA)
酵母双杂交操作主要流程
1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体
BD
2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞
BD
3. 对酵母转化子进行自激活检测
AD AD
630490 酵母双杂交文库构建实验流程(clontech)
第一链cDNA合成1.准备: 高质量的Poly A 或总RNA2. 在微量离心管中混匀以下试剂：1–2 μl RNA 样本(0.025–1.0 μg poly A+或0.10–2.0 μg 总RNA)1.0 μl CDS III 或CDSIII/6 引物1–2 μl 去离子水(补齐体系到4.0 μl)4.0 μl 总体积注意: 对照实验时，请使用1μl *1μg+ 的对照RNA。
CDSIII = Oligo-dT；引物CDSIII/6 =随机引物3. 72°C ，孵育2 min。
4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm，10sec，瞬时离心。
5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，轻拍混匀。
2.0 μl 5X First-Strand 缓冲液1.0 μl DTT (100 mM)1.0 μl dNTP 混合物(10 mM )1.0 μl SMART MMLV 反转录酶6. 只有使用随机引物(CDSIII/6)实验才进行此步骤[如果采用Oligo-dT(CDSIII)请忽略此步骤，直接进行Step7]，25°C，室温孵育10 min。
7. 42°，孵育10 min。
注意: 孵育在热盖的PCR仪中进行。
若用非热盖的PCR仪或水浴，请在反应管中加入一滴矿物油来避免水分蒸发。
8. 加入1 μl SMART III-modified oligo，混匀，42°C，孵育1 hr。
9. 75°C ，10 min终止第一链合成反应。
10. 室温冷却，加入1 μl RNA酶H (2U)。
11. 37°，孵育20 min。
12. 继续进行LD-PCR 扩增(Section VII.B)。
注意: –20°C下可保存3个月。
第一链反应最终体积为15μl• 10 μl SMART III Oligo(10 μM; 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG CCATTATGGCCGGG-3’)• 10 μl CDS III 引物(10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-d(T)30VN-3’)*23个碱基• 10 μl CDS III/6 引物(10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-NNNNNN-3’)注意: N = A, G, C, or T; V = A, G, or C• 50 μl 5’ PCR 引物(10 μM; 5’-TTCCACCC AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)25个碱基•50 μl 3’ PCR 引物(10 μM; 5’-GTATCGATGCCCACCC TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’)第二链cDNA合成（LD-PCR）尽量使用最小的循环数来得到3-6ug的ds cDNA。
浅析酵母双杂交文库构建的方法
浅析酵母双杂交文库构建的方法酵母双杂交技术是分子生物学研究领域的重要实验手段，是利用酵母遗传学方法来分析蛋白质之间的相互作用，现在已被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域。
酵母双杂交文库构建一般包括核体系和膜体系两种方法。
核体系包含通过同源重组的方式实现文库的构建、根据Gateway的技术实现建库采用BP重组和LR重组分别获得初级文库与次级文库这两种方法。
膜体系是由酶切连接的方法实现建库，主要是基于分离的泛素介导膜蛋白互作信号的识别。
美迪西生物医药专业从事酵母双杂交，出具权威检测数据报告，具有独立优质实验室，专业实验人员，提供详细的酵母双杂交实验步骤，原始数据和图片，结果分析。
1、膜体系和核体系酵母双杂筛库的不同点筛库所用菌株不同，在通过共转方式筛库时，核体系使用Y2HGold酵母菌，膜体系使用NMY51菌株。
核体系除了可以选择共转筛库，还可以通过mating的方法进行。
Mating自然要用到两种性别的菌株，含有AD文库质粒的Y187和含有BD质粒的Y2HGold。
2、核体系和膜体系在整个实验的流程上的差异。
值得注意的是核体系酵母双杂中如果BD基因本身为转录因子时，可能存在自激活现象，因此在诱饵载体构建完成后首先要做的则是诱饵基因的自激活检测。
而膜体系酵母双杂，理论上由于诱饵蛋白被“挂”在细胞质膜上，在没有互作蛋白相互靠近时，泛素的两部分彼此分离，转录因子不会被切割，便不会导致报告基因表达。
而对于膜体系酵母双杂，因为诱饵蛋白在细胞膜上的跨膜方式不同，构建BD载体时选用的质粒不同。
基于此，在BD载体构建完成后，首先要做的是功能验证，亦即所构建的BD质粒是否适用于该系统。
下面是两种体系的筛库主要实验流程。
（1）核体系筛库实验流程（2）膜体系筛库实验流程（3）另外，在阳性克隆的筛选方法上两者亦不同。
核体系，因为报告基因中有MEL1，在有蛋白互作时，α-半乳糖苷酶被表达，即在含X-α-Gal的选择培养基上阳性菌落呈蓝色。
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它基于酵母细胞内存在的转录激活子结合域（Transcription Activation Domain，TAD）和DNA结合域（DNA Binding Domain，DBD），通过融合特定的蛋白质序列并在酵母细
胞中共同表达，以实现筛选并鉴定蛋白质相互作用的目的。
酵母双杂交具体实验流程如下：
1.构建启动子驱动的酵母表达载体
该载体包含两部分：AD与DB，分别携带TAD和DBD结构域。
这些结构域可以具体化作为外源蛋白的两个互补部分，这样当它们相互结
合时，激活酵母内的报告基因（RLUC或LacZ）表达，并通过信号放
大器Cre的介入增强了信号。
2.构建融合基因的酵母表达载体
将想要研究的两种蛋白质的氨基酸序列分别连接到AD与DB的C端，形成融合蛋白质基因，然后将融合基因与启动子驱动的表达载体转化
入双杂交酵母细胞。
3.获得蛋白质相互作用的筛选和确认
通过对酵母双杂交转化后的细胞进行筛选，并通过对表达的信号进行观察和测量，得到蛋白质相互作用的筛选结果。
4.确定筛选结果的真实性
在确定特定蛋白质相互作用是否真实的过程中，通常会进行一些补充实验。
例如，可以通过分析生化反应，并利用免疫共沉淀等方法验证筛选结果的可靠性。
总的来说，酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它可以快速、可靠地鉴定蛋白质相互作用，从而帮助研究者更深入地探究蛋白质的功能和作用机制。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1 基因组文库的构建基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。
理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。
1. 1构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。
1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb）1.2 基因文库构建的一般步骤1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。
不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。
1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。
噬菌体载体构建基因组文库第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。
2.1高质量mRNA的制备应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。
将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。
PolyAT tract mRNA 的分离纯化过程第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2.2反转录成cDNA可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的反转录酶(Reverse transcriptas)；应选用甲基化dCTP；应保证所获得双链cDNA 的方向性。
cDNA克隆时，必须考虑到目的基因mRNA在特定的生物体组织中的含量问题。
根据mRNA分子含量的多寡（丰度），可将其划分为高丰度、中丰度和低丰度三种类型。
寡聚(dT)12-18随机6碱基引物R 6寡聚(dT)12-18随机6碱基引物R 6mRNA (A)n (T)12-18(A)n (A)n(T)12-18R 6R 6R 6R 6R 6R 6第二链合成(A)n(T)12-18(A)n R 6R 6R 6R 6R 6R 6(A)n (T)12-18Eco RI Eco RI 加上EcoRI 接头，磷酸化，cDNA 分级cDNA 合成完毕，准备连接第一链合成cDNA 合成过程示意图第四章基因文库构建及酵母双杂交技术接头及引物序列无RNaseH活性的反转录酶，5’甲基化的dNTPXhoIRNaseH，DNA聚合酶IXhoIEcoRI接头，T4连接酶EcoRI XhoIXhoI酶切XhoI完整有方向的cDNA cDNA合成的分子修饰cDNA文库的构建3 RACE技术cDNA 3′端的快速扩增法（3′RACE 法）(RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends)•3`-Full RACE法cDNA 5′端的快速扩增法（5′RACE 法）(RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends)5 ’ RACE原理●Self-Ligation 法5’ RACE 法种类1.使用RNA Ligase 的5’ RACE 法●Self-Ligation Method●Adaptor-Adding Method2. 使用TdT (Terminal DeoxynucleotidylTransferase) 的5’ RACE 法Adaptor-Adding Method 原理TdT 法原理几种5’ RACE 法的比较¿É·ñ½øÐNested PCR TdT·¨Öк¬PolyG ²»¿ÉµÍSelf-Ligation·¨ÒýÎïÇé¿öÀ©ÔöÌØÒìÐÔ¸ßÖи߿ÉÌØÒìÐԸߵÍÌØÒìÐԸ߿ÉMethodAdaptor-Adding·¨Á¬½ÓЧÂÊ4 酵母双杂交系统Yeast Two Hybrid System (Interaction trap) 4.1酵母双杂交系统的作用90年代，纽约大学的S. Field等建立。
有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质4.2酵母双杂交系统的原理4.2.1 结构域（Domain）合作许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成。
例如：啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNA binding domain Active domain N C1-147aa 768-881aa上游激活序列（UAS ）转录机GAL4效应基因结合结合激活转录只要DNA binding domain （DNA-BD ）与Active domain （AD ）靠近就能够表现转录激活活性。
实验发现：转录表达4.2.2 拆开Domain用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力。
Active domainDNA binding domain结合上游激活序列（UAS）转录机GAL4效应基因不能转录4.2.3 重组Domain用重组DNA 技术把这两个Domain 分别与两个不同的多肽连接。
Active domain 蛋白A蛋白B DNA binding domain 在体内，蛋白A 与蛋白B 是否能结合。
通过效应基因是否被激活来检查：4.2.4 观察报告基因表达上游激活序列（UAS ）转录机GAL4效应基因蛋白ADNA binding domain 转录激活domain蛋白B GAL4的DB domain 与AD Domain 也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。
不能转录（1）如果蛋白A 与蛋白B 不能相互结合上游激活序列（UAS ）转录机GAL4效应基因蛋白ADNA binding domain 转录激活domain蛋白B 激活转录GAL4的DB domain 与AD Domain 也能靠近，所以能启动效应基因的转录。
转录表达（2）如果蛋白A 与蛋白B 能相互结合双杂交原理X基因和Y基因产物的相互结合，导致reporter gene表达。
Reporter gene表达就可说明X基因产物于Y基因产物能结合。
4.3 构建双杂交体系的宿主菌删除基因组中的内源野生型GAL4基因使酵母菌只能利用载体表达的GAL4蛋白。
此外还有其他营养缺陷。
如：SFY526; HF7c 等菌株。
4.4 构建报告基因（reporter gene）GAL4的效应基因是his3/lacZ/URA3。
GAL4激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长在组氨酸缺乏培养基上。
4.5 构建双杂交体系的穿梭质粒4.5.1 穿梭质粒（shuttle plasmid ）既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。
4.5.2 双杂交体系需要两种穿梭质粒分别携带已知的靶蛋白基因和携带未知基因序列。
（1）BD-plasmid靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。
P: ADH1启动子。
T: ADH1终止子。
ADH：Alcoholdehydrogenase核定位信号是GAL4本身的一部分筛选标志：TRP（2）AD-plasmid外源基因按正确阅读框克隆到GAL4的AD片断之后。
P: ADHI启动子。
T: ADHI终止子。
核定位信号是SV40的T抗原的序列筛选标志：LEU24.6 酵母双杂交的实验过程报告基因：HIS（合成组氨酸）4.6.1 把蛋白A插入到BD质粒上（pGBT9）4.6.2把蛋白B插入到AD质粒上（pGAD424）4.6.3 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c）4. 6.4筛选观察（1）存活选择在缺少亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）培养基上筛选双载体转化子。
双载体转化才能合成亮氨酸和色氨酸，菌体存活。
Trp-Leu-（2）蛋白结合选择在缺少组氨酸（HIS）、亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）的培养基上筛选蛋白A和蛋白B 能相互作用的双载体转化子。
His-Trp-Leu-。